EFECTO DEL NEMATODO QUISTE DEL TREBOL Heterodera trifolii Goffart, EN EL DESARROLLO VEGETATIVO DE DOS CULTIVARES DE TREBOL BLANCO¹

Laura Böhm S., Carol Krausz B. y Susana González M.
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
Casilla 567, Valdivia, Chile

¹ Financiado por FONDECYT 193336
  Recepción de originales: Mayo 15, de 1996

ABSTRACT

Effect of the clover cyst nematode de Heterodera trifolii Goffart, on the vegetative development of two white clover cultivars.

Key words: Heterodera trifolii, white clover, Rhizobium trifolii.

As a means of evaluating the root nematode Heterodera trifolii G. performance on the vegetative growth of white clover (Trifolium repens L.), nine different inoculation densities, consisting of eggs and second juveniles stages, were assayed on 500 g soil pots containing clover seedlings of" Huia" and "Kopu" cultivars, under glasshouse conditions. Clover samples were uprooted for evaluation during the second and fourth month after the root nematode inoculation. Data estimating growth of white clover were taken as follow: total dry root weight and total root length, Rhizobium trifolii Dangeard nodule number. Foliage and stem yield were evaluated as total dry weight, leaf and stolons number. After statistical analysis of variance, the above estimates, under the environmental and soil conditions of the experiment, had no significant difference on the foliage yield of white clover regarding the nematode infecting treatments. Differences on the average root length and nodule number of R. trifolii were detected, associated to H. trifolii under different infective densities.

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar el efecto de Heterodera trifolii Goffart en el desarrollo de plantas de trébol blanco, se inocularon nueve concentraciones del nemátodo (0,250,500, 1.000,2.000,3.000,4.000,5.000 y 6.000 huevos y juveniles/500 cc de suelo) en macetas que contenían plántulas de los cultivares Huia y Kopu. Después de dos y cuatro meses de ensayo se analizó el peso seco y la longitud de la masa radical, así como también el número de nódulos de Rhizobium trifolii Dangeard y de quistes del nemátodo desarrollados en las raíces. En el sector aéreo se evaluó el peso seco, número de hojas y el número de longitud de los estolones. De los resultados obtenidos y bajo las condiciones dadas en el ensayo se determinó que no hubo alteraciones significativas en el rendimiento de ambos cultivares de trébol, con excepción de la longitud radical y la nodulación que se vieron disminuidas. A los cuatro meses de evaluación el número de quistes formados en el cultivar Kopu fue notoriamente superior que en Huia.

INTRODUCCIÓN

El problema del establecimiento y persistencia del trébol blanco en praderas permanentes es un hecho conocido, el cual ha sido estudiado y atribuido a diversos factores, entre los que se cuentan condiciones de cultivo y manejo, fertilización y en menor proporción al efecto que puedan estar causando agentes patógenos, en especial microorganismos del suelo que afectan el sistema radical de las plantas. Entre los últimos se encuentran los nemátodos fitoparásitos, especialmente endoparásitos, los que infestan internamente las raíces como es el caso del denominado nemátodo quiste del trébol Heterodera trifolii y especies del género Meloidogyne(Healy et al.,1973; Mercer, 1990).

El efecto detrimental de la infestación de H trifolii en el desarrollo del trébol blanco es un hecho reconocido en otros países (Cook y Yeates, 1993) aún con reportes muchas veces contradictorios en relación al origen de la población y a los cultivares utilizados (Townshend y Potter, 1976). Los síntomas que este nemátodo provoca en las plantas se refieren especialmente a una reducción en el rendimiento y a una menor supervivencia de las plantas lo que se atribuye a un debilitamiento y menor desarrollo del sistema radical (Norton, 1967 y Mercer, 1990).

A pesar de haberse determinado que en Chile el nemátodo quiste del trébol se encuentra ampliamente distribuido en praderas establecidas desde Rancagua a puerto Varas (Guiñez, 1988; Böhm et al, 1994), no se tiene información del daño que puede estar causando. Es por ello que se hace necesario evaluar el efecto que provoca su infestación en las plantas, objetivo general que se planteó en la investigación aquí presentada.

El objetivo específico fue conocer el efecto de nueve concentraciones de inóculo de H. trifolii sobre el desarrollo radical y aéreo de dos cultivares de trébol blanco, Huía y Kopu, después de dos y cuatro meses de interacción.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en el laboratorio e invernadero de Hematología del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. La fase experimental se desarrolló entre los meses de diciembre de 1993 a junio de 1994.

Tratamiento de la semilla y siembra. Se utilizó semilla certificada de trébol blanco de los cultivares Huía y Kopu, desinfectada con alcohol al 70% por 30 segundos, luego con hipoclorito de sodio al 5% durante cinco minutos y enjuagada tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente las semillas fueron inoculadas con la cepa 15 BEI de Rhizobium trifolii, aislada de raíces de trébol blanco por el laboratorio de Bacteriología del mismo Instituto. En el proceso de inoculación con el rizobio se utilizó turba estéril y un aditivo comercial, mezcla que se dejó secar a temperatura ambiente bajo condiciones de oscuridad.

En macetas plásticas que contenían 500 ce de sustrato, compuesto por tierra y arena estériles (1:1) con una fertilización de 200 unidades/ha de superfosfato normal, 100 u/ha de sulfato de potasio y 1.000 u/ha de cal, se sembraron 10 semillas de trébol. Una vez sembradas las macetas fueron mantenidas bajo condiciones de invernadero, regándolas con agua hervida fría según el requerimiento de las plántulas. Transcurrido un mes, se realizó un raleo, dejando seis plantas por maceta. Las temperaturas bajo las cuales se desarrolló el ensayo fluctuaron, en promedio, entre 22 °C (mes de febrero) y 15 °C (junio) a nivel del suelo, y entre 25 °C (febrero) y 13 °C (junio) temperatura ambiente.

Inóculo del nemátodo quiste del trébol Heterodera trifolii. La inoculación se efectuó inmediatamente después del raleo. Para ello se hicieron cuatro orificios por maceta, inyectándose con una micropipeta la suspensión de huevos y juveniles del nemátodo, en la concentración equivalente a cada tratamiento. Los tratamientos ensayados correspondieron a nueve concentraciones de inóculo (O, 250, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 y 6.000 huevos y juveniles por 500 cc de suelo), los que se aplicaron en cada uno de los cultivares en estudio.

La suspensión de huevos y juveniles se obtuvo a partir de quistes del nemátodo propagados en raíces de trébol blanco "Huia" e inoculadas cinco meses antes con una población pura, aislada originalmente de praderas de los alrededores de Valdivia. Estos quistes se maceraron con una base de goma sobre un tamiz de 120 mallas por pulgada, dispuesto sobre otro de 500 mallas/pulgada, de tal forma que al aplicar agua a presión los huevos y juveniles quedaban retenidos en el tamiz más fino. De este último tamiz se recuperaron los huevos y juveniles en un vaso de precipitado. El recuento de individuos se realizó bajo microscopio y posteriormente se prepararon las diluciones correspondientes a cada tratamiento.

Parámetros evaluados. Las evaluaciones se realizaron después de dos y cuatro meses de inoculación, tomando separadamente los componentes del sector radical y aéreo de cada una de las plantas desarrolladas en cinco macetas o repeticiones. En el sector radical se consideró el peso seco, la longitud de la masa radical y el número de nódulos de R. trifolii, considerando solamente aquellos con tamaño superior a 1 mm. El peso seco se tomó después de extraer los quistes del nemátodo adheridos a las raíces.

El número total de quistes desarrollados en cada maceta se obtuvo contabilizando bajo lupa los quistes adheridos a las raíces y los quistes libres en el suelo, después de procesar éste último, una vez seco, por el sistema de la jarra Fenwick (Southey, 1970).

En el área foliar se evaluó el número de hojas, el número y longitud de estolones y el peso total de la materia seca de hojas y estolones.

Diseño experimental y análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar con arreglo factorial de los tratamientos, considerando nueve tratamientos por especie de trébol y época de evaluación y cinco repeticiones para cada uno. Se efectuó un análisis de varianza y se aplicó el test de Waller-Duncan (P < 0,05) para los parámetros evaluados en cada cultivar de trébol.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desarrollo radical

Como se indica en el Cuadro 1 las plantas no mostraron un menor peso seco con respecto a los testigos correspondientes en ninguno de los dos muéstreos. Por el contrario, se observa un incremento en este parámetro en los tratamientos inoculados con menos de 5.000 huevos y juveniles/ 500 cc de suelo, haciéndose este significativo en relación a los testigos, en los tratamientos T6 y T7 del cultivar Kopu a los dos meses de muestreo y el T3 a los cuatro meses, observándose la misma situación en el T1 del cultivar Huía evaluado a los cuatro meses.

Al realizar un análisis de regresión para esta variable, a los cuatro meses se obtuvo una relación inversa con el aumento de las poblaciones en los tratamientos. En forma más precisa, las poblaciones del nemátodo en el cultivar Huía fueron responsables en un 12,5% de las variaciones en la respuesta en el peso seco, mientras que en el cultivar Kopu fue alterado sólo en un 1,1%. Es importante señalar que en todos los tratamientos inoculados se observó una mayor proliferación de raicillas cortas las que, sin embargo, no se contabilizaron individualmente. Estos resultados hacen suponer que en un tiempo más prolongado de relación planta-nemátodo, las poblaciones más elevadas inoculadas al sustrato podrían haber evidenciado una disminución en el peso radical, como resultado posiblemente de la formación de una mayor proporción de raicillas cortas e improductivas.
Lo encontrado en el presente ensayo se contrapone a lo reportado por otros autores, donde el efecto más importante de la infestación de H. trifolii es una reducción general del crecimiento del trébol blanco. Así por ejemplo Dropkin (1980) y Caradus (1990) indican que la normal distribución del peso aéreo y radical de las plantas es drásticamente alterada. Por su parte, Yeates et al. (1977) señalan que al inocular trébol blanco con H. trifolii y M. hapla, el peso seco radical de las plantas fue significativamente más bajo en todos los tratamientos que contenían nemátodos. Sin embargo, Wallace (1971) observó en sus ensayos de tomate inoculados con Meloidogyne javanica, que a medida que aumentaba el número de nemátodos, la disminución del peso seco radical era inicialmente bajo, pero éste se fue incrementando al aparecer posteriormente propiedades compensatorias del sistema radical, donde las raíces muertas por efecto del ataque del nemátodo fueron reemplazadas por la generación de nuevas raíces.

En el caso del ensayo aquí presentado el efecto de H. trifolii se manifestó en la longitud radical de las plantas. En el Cuadro 2 se aprecia que éste parámetro fue afectado significativamente en ambos cultivares después de dos meses de inoculación; en cambio a los cuatro meses el efecto de la infestación se hizo más evidente en el cultivar Kopu que en Huia cuando la concentración de inóculo era de 2.000 o más huevos y juveniles por maceta.

Estos resultados se relacionan con la reproducción del nemátodo en las raíces, puesto que al comparar con el Cuadro 3 se aprecia que fue en el cultivar Kopu, en esas mismas concentraciones iniciales de inóculo, donde se obtuvo la mayor cantidad de quistes.

El hecho que esta disminución en la longitud radical no se manifieste en un menor peso seco podría explicarse señalando que éstas compensaron su biomasa emitiendo más raíces secundarias, lo que se observó en los tratamientos con poblaciones moderadas de H. trifolii, entre 250 y 3.000 individuos/500 g de suelo aproximadamente. Tal fenómeno, reportado también por Wallace (1971), podría explicarse como un mecanismo de defensa de la planta frente al ataque del nemátodo, ya que al emitir más raíces secundarias puede absorber en mejor forma los nutrientes del suelo mientras éstas no sean colonizadas por otros juveniles.

Autores como Widdowson et al (1973), han señalado también una marcada proliferación de raíces secundarias en trébol y así mismo una disminución de la longitud de las raíces primarias en plantas infestadas con nemátodos radicales.

De acuerdo a lo anteriormente señalado y observando los resultados obtenidos en el presente ensayo, el hecho de no haberse manifestado una disminución en el peso seco radical, pudo ser consecuencia del escaso tiempo de interacción entre la planta y el nemátodo, sumado a las óptimas condiciones medioambientales (altas temperaturas, riego frecuente y sustrato con adecuado nivel de fertilización) donde se desarrollaron las plantas, lo que sin duda favoreció el crecimiento inicial de éstas.

En relación al efecto de H. trifolii sobre el desarrollo de nodulos de Rhlzoblum trifolii varios investigadores han determinado que los nemátodos endoparásitos sedentarios causan reducciones en la nodulación de plantas leguminosas. Taha y Raski (1969), citan como ejemplo los casos de H. glycines en soya, H. trifolii en trébol blanco, H. goettlnglana en arveja y Meloldogyne spp. en maní.

Aún cuando en este ensayo no se contó con plantas testigo sin inóculo de R. trifolii y los resultados fueron comparados entre tratamientos, se observó que el proceso de nodulación fue notoriamente afectado por el ataque del nemátodo quiste del trébol, presentándose una reducción en el número total de nodulos a medida que aumentó la población de H. trifolii, lo que se hizo más evidente en el cultivar Huia, como se observa en la Figura 1.

Figura 1.	Número de nódulos de Rhizobium trifolii desarrollados en raíces de trébol blanco después de dos y cuatro meses de inoculadas con H. trifolii. Rhizobia nodule number developed on white clover roots after two and four months from H. trifolii inoculation.

Desarrollo aéreo

En el sector aéreo de las plantas se evaluó el número de hojas, el número y longitud de estolones y el peso seco aéreo, resultados que se muestran en los Cuadros 4 al 7. Si bien en el peso seco aéreo, que incluye hojas y estolones, no se observaron alteraciones entre los tratamientos, donde los análisis de varianza y regresión no arrojaron diferencias significativas (Cuadro 4), la inoculación de 500 o más huevos y juveniles/500 cc de suelo provocó después de cuatro meses una disminución en el número de hojas en el cultivar Huia, no siendo esta significativa en el caso del cultivar Kopu (Cuadro 5).

En relación al número de estolones (Cuadro 6), éste parámetro se vio afectado significativamente en ambos cultivares también en la evaluación de los cuatro meses, pero con concentraciones más altas de inóculo no detectandose sin embargo, una relación clara y directa entre los tratamientos. Por otra parte en el Cuadro 7 se aprecia que la longitud de los estolones tampoco reflejó un efecto negativo de la infestación de H. trifolii en las raíces, con excepción del tratamiento con mayor concentración de inóculo en la evaluación de los dos meses, efecto que se revirtió completamente a los cuatro meses.

Estos resultados no coneuerdan con lo indicado en la literatura en relación al daño que provoca H. trifolii en trébol blanco. Por ejemplo, Dropkin (1980) y Cook y Yeates (1993) coinciden en señalar que el crecimiento aéreo se ve drásticamente disminuido con niveles de infestación en el suelo similares a las utilizadas en el presente estudio. Sin embargo, Norton (1967) determinó una gran variabilidad en la respuesta de las plantas e indica que, en general, se incrementa el peso seco por efecto de un mayor engrosamiento de los estolones, reduciéndose éstos en número y longitud.

Cuando se comparan los resultados obtenidos en el desarrollo general de las plantas, con el número de quistes formados (Cuadro 3) destaca el hecho que habiendo sido el cultivar Kopu el que menos efecto manifestó, fue por el contrario el que permitió una mayor reproducción del nemátodo; esto se hace especialmente evidente en la evaluación de los cuatro meses y con concentraciones de inóculo de 2.000 y más huevos y juveniles. Ello podría suponer una mayor tolerancia de este cultivar, con respecto a Huia, a la infestación de H. trifolii, aún cuando los resultados obtenidos no permiten desconocer la posibilidad que la población del nemátodo utilizada en este ensayo pueda corresponder a un biotipo o raza de menor agresividad.

De acuerdo a los resultados se puede concluir que bajo las condiciones en que se realizó el presente ensayo, la infestación del nemátodo quiste del trébol no afectó en forma significativa el desarrollo aéreo del trébol blanco, causando sólo una disminución en la longitud radical y un menor desarrollo de nodulos en raíces.

Considerando que la literatura indica un efecto negativo en las plantas de trébol por la infestación de H. trifolii (Townshend y Potter, 1976; Cook y Yeates, 1993) se hace necesario realizar nuevos estudios donde tanto la duración de la relación planta-nemátodo como el manejo de las plantas sea diferente; así también comparar el efecto de otras condiciones edafoclimáticas y poblaciones de distinto origen de este nemátodo.

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