Giovambattista G., P. Peral García, M. E. Kienast,
M. V. Ripoli, F. N. Dulout Centro de Investigaciones en Genética Básica
y
Aplicada (CIGEBA)
Facultad de Ciencias Veterinarias
60 y 118 s/n, ce 296,190, La Plata, Argentina
Recepción de originales: Octubre 1, de 1996
Trends in livestock animals identifícation
Key words: Genetic markers, individual identifícation, paternity test, domestic animals.
Domestic animals identification has always been very important
for breeders. Before genetic markers were developed, individual characterization
and parentage verification could only be performed through phenotypic characteristics,
such as the outline. This is a subjective method that does not produce much
information. So a more objective technique needed to be developed. Blood groups
were the first genetic markers applied to the individual characterization. Then,
biochemical polymorphisms and MHC polymorphisms were incorporated.
In the '80s, DNA analysis tecniques were developed. One of them was DNA fingerprinting,
which analyses the variation in the number of repeats in the minisatellite sequences.
Nowadays, the more feasible DNA technique is the microsatellites typification
by PCR. However, blood groups and biochemical polymorphisms are still the standard
techniques used in the paternity tests and could be complemented by molecular
markers. The next steps will be to design and to standardize these markers and
studies at population level to measure their information value and finally to
automatize the parentage verification.
La identificación de animales domésticos ha sido
siempre una necesidad para los productores. En los tiempos anteriores al desarrollo
de los marcadores genéticos la identificación individual y las
verificaciones de parentesco sólo podían realizarse mediante las
características fenotípicas, que eran representadas sobre siluetas.
Estos criterios son subjetivos, ambiguos y escasamente informativos, por lo
que se inició la búsqueda de criterios más objetivos. Los
primeros marcadores genéticos utilizados fueron los grupos sanguíneos,
a los que luego se le incorporaron los polimorfismos bioquímicos y los
correspondientes al Complejo Principal de Histocompatibilidad.
En la década de los '80, en la continua búsqueda de los marcadores
genéticos apropiados para la identificación surgen las técnicas
de análisis del ADN. Las mismas son utilizadas para evidenciar los polimorfismos
presentes tanto en las secuencias codificantes como en las no codificantes.
En 1985 fue desarrollada la metodología denominada ADN "fingerprinting",
basada en el análisis de las variaciones en el número de repeticiones
presentes en secuencias minisatélites.
Actualmente, entre las diferentes técnicas de caracterización
de los polimorfismos del ADN, la que muestra mayores perspectivas es la tipificación
de microsatélites mediante la Reación en Cadena de la Polimerasa.
Sin embargo, hasta el momento la tipificación de los grupos sanguíneos
y los polimorfismos bioquímicos siguen siendo en animales domésticos
el estándar internacional para la certificación de paternidad,
pudiendo ser suplementadas con marcadores moleculares. Los pasos a seguir en
la estandarización de estos últimos consisten en desarrollar un
gran número de microsatélites y estudiarlos a nivel poblacional
para poder estimar su grado de información. Finalmente, la última
etapa seria la automatización de la técnica, que permita el análisis
simultáneo de un gran número de individuos.
En los tiempos anteriores al desarrollo de las técnicas moleculares, la identificación de un individuo sólo podía hacerse mediante el empleo de tatuajes o descripciones fenotípicas. También siluetas de cabezas de frente, y dos siluetas del individuo vistas por ambos flancos eran utilizadas para identificar remolinos, marcas, manchas, etc. De la misma manera, la determinación de la paternidad debía resolverse de acuerdo al parecido fenotípico entre los supuestos padres y la cría.
Estos criterios son subjetivos, ambiguos, escasamente informativos, de herencia poco conocida o bien su expresión depende de la acción de un gran número de genes. Por lo tanto, estos criterios de identificación no resultan recomendables. Es por esta razón, que desde principios de siglo se ha intentado desarrollar una metodología mas objetiva que, cumpla con los siguientes requisitos básicos:
a) Analizar loci correspondientes a caracteres cualitativos.
b) Dichos caracteres no deben estar influenciados por el ambiente.
c) Deben poseer herencia mendeliana sencilla.
d) Deben estar presentes en el individuo en el momento del nacimiento.
e) Que su análisis no conlleve riesgo para el animal.
f) Que sean informativos.
g) Que la metodología sea repetible y pueda ser estandarizada.
Grupos sanguíneos - Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - Polimorfismos Bioquímicos:
En el 1900, Landersteiner abre el camino de la identificación a través de los Grupos Sanguíneos en humanos, describe que no todos los individuos poseían el mismo tipo de glóbulos rojos, ya que existía polimorfismo. Así por primera vez, los individuos se podían agrupar en base a un criterio objetivo y se acuñó el término Marcador Genético. Recién después de muchos años, este criterio se consideró válido para la identificación en animales domésticos (Dujarric de la Rivere y Kossowitch, 1927; Rouscher, 1934; Ferguson, 1941; Irwin, 1956; Stormont e Irwin, 1948; Stormont y Susuki, 1961; Stone e Irwin, 1954; Podliachouk, 1957; Braend et al., 1962). Posteriormente, al mismo se le incorporaron otros tipos de polimorfismos: los correspondientes al Sistema de Histocompatibilidad (puesto de manifiesto por reacciones inmunológicas) (Amorena y Ston, 1978; Sponer et al., 1978; Lazary et al., 1987 ; Alexander et al., 1988) y los polimorfismos bioquímicos (identificados mediante técnicas electroforéticas) (Smithies y Hickman, 1959; Braend et al, 1962; Braend y Stormont, 1964; Braend y Efremov, 1965; Franks, 1962; Podliachouk y Hessel-Holt 1962;Samberg, 1974; Bowling y Clark 1985).
Estos hitos constituyeron un gran avance para la identificación de animales domésticos, ya que se contaba por primera vez con una batería de marcadores genéticos polimórficos, que cumplían con las características fundamentales para ser utilizadas en las pruebas de identificación individual y de verificación de parentesco. Sin embargo, los grupos sanguíneos, el MHC y los polimorfismos bioquímicos tienen algunas desventajas, como ser:
a) El nivel de obsevación es el fenotípico,
ya que se tipifican proteínas, analizando indirectamente, sólo
las secuencias codificantes de loci estructurales,
que corresponden aproximadamente al 5% del genoma.
b) La funcionalidad de las proteínas limita el grado de polimorfismo
ya que sólo son detectadas aquellas mutaciones que producen
cambios en la cadena proteica. Y entre estos cambios, a aquellos cuyos productos
pueden ser detectados mediante colorantes, reacciones
enzimáticas o inmunológicas. Las limitaciones inherentes al sistema
mencionado hacen que se reduzca considerablemente el
grado de información de los mismos, por lo que son considerados pruebas
de exclusión (donde se descarta o excluye pero
no se puede confirmar una paternidad discutida).
c) Las muestras tienen que ser frescas ya que las proteínas se deterioran
con facilidad.
d) En el caso de los grupos sanguíneos y del MHC es necesario mantener
rodeos de animales para la producción de los antisueros.
En la década de los '80, en la continua búsqueda de los marcadores genéticos apropiados para la identificación, surgen las técnicas de análisis del ADN. Las mismas son utilizadas para evidenciar el polimorfismo tanto de las secuencias codificantes (5 a 10% del genoma) como no codificantes (90 a 95% del genoma). Estas últimas comprenden ADN de copia única, ADN repetido heterodisperso (SINEs, LINEs) y ADN repetido en "tándem" (ADN satélite, Telómeros, Minisatélites y Microsatélites). Nakamura et al. (1987) acuñaron el término "variable number tándem repeats" (VNTR) para denominar a los loci cuyos alelos están constituidos por repeticiones en "tándem" que varían en el número de unidades.
Jeffreys et al. (1985) desarrollaron los denominados "DNA fingerprinting" en humanos, basados en el análisis de Minisatélites. Estos están constituidos por una unidad básica o secuencia "core" que se repite en "tándem" una cierta canti-dad de veces. El polimorfismo a nivel de los minisatélites está dado por las variaciones en el número de repeticiones de la secuencia "core" en un determinado locus.
La metodología de "DNA fingerprinting" se basa en la extracción de ADN de alto peso molecular y su posterior digestión con enzimas de restricción. Los fragmentos de restricción se separan por medio de electroforesis en geles de agarosa, siendo luego transferidos a una membrana (nylon o nitrocelulosa) para su hibridación con sondas, que incluyen a la secuencia "core". Teniendo en cuenta que la unidad de repetición (secuencia "core") se localiza en diferentes loci del genoma, la sonda se comporta como un marcador multilocus, en condiciones relajadas de hibridación. Sin embargo, en condiciones estrictas, estas pueden utilizarse como sondas para locus simple.
Esta metodología permitió por primera vez contar con una prueba de inclusión (donde se puede afirmar la paternidad discutida), ya que la probabilidad de determinación de una paternidad se aproxima a la unidad. Esto se debe a que el "DNA fingerprinting" analiza secuencias que son altamente polimórficas en las poblaciones y que por estar las mismas dispersas en el genoma se pueden analizar simultáneamente, con la misma sonda, diferentes regiones cromosómicas o loci. Por otra parte, el gran número y tipos de minisatélites presentes en el genoma hacen que no haya limitaciones en cuanto a la cantidad de marcadores que potencialmente podrían ser utilizados.
El desarrollo de las técnicas basadas en minisatélites, ya sea multilocus o de locus simple, permitió pensar que ya se contaba con la herramienta que reemplazaría a los polimorfismos bioquímicos, los grupos sanguíneos y al MHC (Georges et al., 1988, 1990; Kirby, 1990; Haberfeld et al., 1991; Dolf et al., 1992: Mannen et al, 1993) Sin embargo, una serie de limitaciones propias de la metodología hacen que, por lo menos en animales domésticos, no se haya cumplido con las expectativas. Las principales dificultades son:
a) Se necesita ADN de alto peso molecular (~ 5-l0 µg).
b) El tiempo de realización es largo y la técnica trabajosa, tiene
baja repetibilidad, por lo que el número de muestras que pueden
ser llevadas a cabo simultáneamente es reducido. No es sencillo automatizar
la rutina en el laboratorio.
c) En el caso de las sondas multilocus, no pueden ser identificados los loci
tipificados, sino que se trabaja con un conjunto de bandas
o fragmentos con herencia mendeliana.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Su Aplicación en el Análisis de los Polimorfismos Presentes en el ADN.
En 1987, Mullis y Faloona producen un hecho revolucionario al idear la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Esta consiste en la amplificación "in vitro" de un fragmento de ADN utilizando una polimerasa termoestable (Taq Polimerasa). Esta técnica aplicada al análisis de los polimorfismos presentes en las secuencias repetidas en "tándem" del tipo de los microsatélites está modificando radicalmente el campo de la identificación individual.
Los Microsatélites (Short Tándem Repeat, STR): Los STR son una de las clases de secuencias repetidas presentes en el genoma. Están constituidos por repeticiones de di, tri y tetranucleótidos (secuencia "core"), dispersos en todo el genoma (Ellegren, 1993). Al igual que en los minisatélites los alelos están dados por variaciones en el número de repeticiones, pero a diferencia de aquellos sólo se requiere amplificar la secuencia en cuestión y analizarla posteriormente por medio de electroforesis en geles de secuenciación. Dicho análisis consiste en la identificación de los alelos en base a su peso molecular.
En las diferentes razas de bovinos, han sido reportados más de 1000 microsatélites polimórficos (Fries, 1993; Barense et al., 1994); mientras que en equinos han sido descriptos aproximadamente 200(Brenn et al., 1994;Guerin et al, 1994; Van Haering et al, 1994; Gralak et al, 1994).
Hasta el momento, son escasos los polimorfismos de microsatélites reportados en razas autóctonas sudamericanas. Por ejemplo, el STR denominado DU17S3 ha sido estudiado en el bovino Criollo Argentino (Giovambattista et al, 1995) y el HMS7 en el equipo Criollo Argentino (Kienast et al, 1996).
Polimorfismos de ADN-MHC: Los avances en el estudio del ADN no se limitaron tan sólo a la determinación de secuencias no codificantes. Así por ejemplo, algunos de los genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), que en un principio eran identificados por reacciones inmunológicas, pueden ser tipificados actualmente a través de técnicas de ADN.
En animales domésticos los genes de Clase II de bovinos son quizás los mejor conocidos. Entre éstos el gen más polimórfico es el BoLA-DRB3, por lo que en esta especie los esfuerzos han sido enfocados hacia el desarrollo de una técnica que permita la tipificación del polimorfismo existente a nivel del segundo exón del BoLA-DRB3 (que codifica para el sitio de reconocimiento del antígeno). Sin embargo, a pesar del esfuerzo realizado ninguna de las diferentes metodologías utilizadas (PCR-RFLP, SSO-PCR isoeléctroenfoque, RFLP) han logrado diferenciar los 62 alelos conocidos. Es probable que en los próximos años se cuente con un sistema basado en la amplificación por PCR a través de cebadores específicos de alelos, similar al ya existente en humanos (Olerup y Zetterquist, 1992), ya que dicho método se encuentra actualmente en desarrollo (Sitte et al., 1996).
Estado actual de la identificación en algunas especies domésticas.
En la actualidad, gracias al esfuerzo de diversos laboratorios de todo el mundo se han producido grandes avances en el conocimiento de los diferentes genomas de los animales domésticos. Es por ello que ya se cuenta con una batería de marcadores a nivel molecular. Por ejemplo: Se reportaron aproximadamente 1100 marcadores en bovinos y cerdos, 700 en ovejas y cabras, 450 en aves de corral (Georges y Andersson, 1996).
Entre las diferentes técnicas de caracterización de los polimorfismos del ADN la que actualmente muestra mayores perspectivas es la tipificación de microsatélites (STR) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Es por esta razón, que con el auspicio de la Sociedad Internacional de Genética Animal (IS AG), fueron seleccionados y estandarizados diferentes microsatélites en las distintas especies de animales domésticos (bovinos, equinos, cerdo, perro, oveja, cabra), los que fueron utilizados en el Test de Comparación 1995/96.
Bovinos: Basado en los resultados obtenidos en el Test de Comparación Internacional, el Comité de Estandarización Bovino presentó, en el "workshop" bovino (Tours, Francia, 1996), una propuesta de un panel de microsatélites para ser usado como estándar internacional, siendo aprobados nueve marcadores y otros cuatros fueron aceptados en forma experimental. Hasta el momento la tipificación de los grupos sanguíneos sigue siendo el estándar internacional para la certificación de paternidad, pudiendo ser suplementadas con marcadores moleculares. Sin embargo, estos últimos ya pueden ser utilizados para confirmar la identidad de los animales que van a ser exportados o importados.
Equinos: En el último Test de Comparación Internacional fueron utilizados por primera vez microsatélites, además de los marcadores utilizados tradicionalmente (grupos sanguíneos y polimorfismos bioquímicos). Sin embargo, todavía no se cuenta con un panel de STR para uso de rutina. Actualmente, el Comité de Estandarización Equina se encuentra preparando la lista tentativa de microsatélites que conformarían el "Kit" de identificación. En caballos ya se recomiendan 12 microsatélites.
Cerdo: Hasta la actualidad no se ha llegado a un acuerdo o solución para el uso de microsatélites en el control de paternidad y mapeo del genoma.
Ovejas y Cabras: En el Test de Comparación Internacional se utilizaron grupos sanguíneos, polimorfismos bioquímicos y microsatélites. Se están analizando los resultados obtenidos, y diferentes laboratorios se encuentran intercambiando información para desarrollar y estandarizar microsatélites.
Perro: Con el auspicio de la IS AG se está llevando a cabo el proyecto de mapeo del genoma canino, habiéndose tipificado un total de 94 genes (89 microsatélites y 5 loci polimorfismos bioquímicos). El estudio del polimorfismo presente en un gran número de loci en familias Internacionales de Referencia es la etapa previa al uso de esta metodología en las pruebas de paternidad.
Perspectivas futuras: La necesidad de analizar un gran número de muestras simultáneamente, ha llevado a que algunas empresas de biotecnología ya hayan lanzado al mercado "Kits" de identificación individual que permiten la automatización de la técnica. Estos posibilitan la amplificación simultánea de varios marcadores moleculares (Multiplex-PCR). La utilización de cebadores fluorescentes en la reacción de PCR permite correr en geles de poliacrilamida hasta 12 microsatélites por calle, siendo los resultados analizados mediante "software" específicos. Así por ejemplo, en equinos está basado en la amplificación de 12 dinucleótidos, obteniéndose de esta manera un poder de exclusión del 99,9% (Bozzini et al., 1996). Para estos STR se cuenta ya, con datos poblacionales en razas como Pura Sangre de Carrera, Tennessee Walking Horses Trotadores, Friesians y Fjord Horses. Por otra parte, en bovinos existen dos juegos de 11 microsatélites cada uno, lo que da una probabilidad de exclusión del 99,999%, contándose con datos de frecuencias génicas en al menos 12 razas.
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