Manuel Pinto C.1, Marta Contreras
O.1, Erwin Carrasco R.1, Carmen Brito C.1,
Luz H. Molina C.1, Kong Shun Ah-Hen 1 y Salvador Vega
y León.2
1 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Casilla
567 Valdivia, Chile. 2 Departamento de Producción Agrícola
y Animal, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Código
Postal 04960, México D.F.
E-mail: mpinto@uach.cl
Recepción originales 27 de noviembre de 2001
Determination of authenticity of pure milk fat. linear discriminant analysis of triacylglycerides.
Key word: Milk fat, bovine, adulteration, triacyl glycerides, lineal discriminant analysis.
The addition of non-milk fat of animal or plant origin to dairy products such
as fluid milk, milk powder, cheese or butter is considered to be an adulteration.
The purpose of this research was is to propose a methodology using linear discriminating
analyses for the detection of adulteration of milk fat with non-milk fat (animal
origin) at levels below 10%, with at least 95% of the analysis correctly classified.
The derived functions are applicable to pure milk fat samples of the VIIIth,
IXth and Xth regions. Similarly partial discriminating
functions applicable to pure milk fat of the said regions were also proposed.
The percentage composition of triacylglycerides (C26 to C54)
in 72 samples of pure milk fat of milk stored in tanks of six dairy plants was
determined. The pure milk fat samples were adulterated with non-milk fat according
to a theoretical model at 0 %, 5 %, 10% and 15% within 4 groups (n groups =
72).
The best discriminant function F1 found for the southern zone was:
F1 = 2.4633C34 2.69418C36 + 0.895685C38
2.09497C40+1.773789C42-1.57736C44
where C34, C36, C38, C40, C42
and C44 are the weight percentages of the weight of triacylglycerides
with carbon numbers 34, 36, 38, 40, 42 and 44. This equation allowed the correct
classification of 97.2 or 79.1% of the samples adulterated with 10 or 5% of
non-milk fat of animal origin, respectively.
Palabras claves: Grasa láctea, bovino, triacilglicéridos,
adulteración, análisis discriminante lineal.
La incorporación de grasas no lácteas de origen vegetal o animal
a productos lácteos tales como leche fluida, leche en polvo, queso o
mantequilla es considerada una adulteración.
El objetivo de esta investigación es proponer una metodología
de análisis discriminante lineal para detectar adulteraciones de grasa
láctea con grasa no láctea (origen animal), en niveles inferiores
al 10% con al menos el 95% de los casos correctamente clasificados. Las funciones
obtenidas son aplicables a muestras de grasa láctea pura de la zona sur
(VIII, IX y X regiones). Del mismo modo se proponen funciones discriminantes
parciales aplicables a muestras de grasa láctea pura de cada una de las
regiones mencionadas.
Se determinó la composición porcentual de triacilglicéridos
(C26 al C54), provenientes de 72 muestras de grasa láctea pura de leche
de silos de almacenamiento, de seis plantas lecheras. Se procedió a adulterar
las muestras de grasa láctea pura, con grasa no láctea, en un
modelo teórico al 0%, 5%, 10% y 15%, conformando 4 grupos.
La mejor función discriminante (F1) encontrada para la zona sur fue la
siguiente:
F1 =2,4633*C34-2,69418*C36+0,895685*C38 2,09497*C40 + 1,73789*C42
1,57736*C44
en donde C34, C36, C38, C40, C42 y C44 son los porcentajes en peso de los triacilglicéridos
con números de carbono 34, 36, 38, 40, 42 y 44. Esta ecuación
permitió una correcta clasificación de 97,2 o 79,1 % de muestras
adulteradas con un 10 o 5 % de grasa no láctea de origen animal, respectivamente.
En diversos estudios se ha informado que el contenido de la grasa en la leche
y su composición en ácidos grasos (AG) y triacilglicéridos
(TAG) pueden verse influenciados por diversos factores, como es el efecto de
raza (Gibson, 1991, Precht, 1992), estación
del año (Piva et al, 1993), los sistemas de alimentación
(Precht, 1990, Kennelly, 1996), las condiciones
de estabulación y el clima (Bornaz et al, 1993, Bear,
1991, Grummer, 1991, Hinrichs et al, 1992,
Palmquist et al, 1993) y la aplicación de la hormona
somatotropina bovina (BST) (Bear, 1991) muchos de los cuales
interactúan (Bear, 1991, Allore et al,
1997). Los factores que principalmente inducen variabilidad en AG y TAG,
son la alimentación y el período del año, y ellos pueden
contribuir a enmascarar la adición de grasa extraña a la leche
procesada.
La incorporación de grasas no lácteas de origen vegetal o animal
a productos tales como mantequilla, quesos, leche en polvo, leche fluida, entre
otros, es considerada una adulteración, según la reglamentación
nacional vigente (Chile, Ministerio de Salud Pública, 2000,
Vega et al, 1998). El análisis del perfil de triacilglicéridos
por cromatografía de gases es el método más confiable,
hasta el presente, utilizado para la detección de dichas adulteraciones
ya sea con grasas de origen vegetal o animal (Timmen, 1991,
Collomb y Spahni, 1991, y IUPAC, 1991). Cuando
la adulteración es de origen vegetal, su presencia se detecta fácilmente
a través del análisis de fitosteroles (b -sitosterol, campesterol,
stigmasterol, brassicasterol), en niveles de hasta el 1% de adulteración
con un 95% de confianza. Sin embargo, la incorporación de grasas no lácteas
de origen animal (hidrogenados de pescado, vacuno, manteca de cerdo, entre otros),
en niveles de hasta un 10% de adulteración no pueden detectarse con un
porcentaje de confianza aceptable, usando métodos convencionales: densidad,
índices de refracción, yodo, saponificación, Reichert
Meissl y Polenske, estos últimos referidos a la cuantificación
de ácidos grasos volátiles solubles e insolubles en agua, según
British Standards Institution 684 (1958), Villanueva,
1987, Vega et al, 1996).
En la literatura existen variados estudios, sobre métodos para la detección
de adulteraciones de la grasa láctea, pero muchos de ellos, no han obtenido
resultados muy alentadores. Sólo un bajo porcentaje de muestras adulteradas
han sido reconocidas como tales. El método convencional más conocido
es la determinación de cuocientes entre los valores porcentuales (%m/m)
de TAG propuestos entre otros por Parodi (1973) y Guyot
(1978).
Timms (1980), mediante una regresión lineal múltiple,
logra por primera vez, seleccionar un grupo de tres variables, C40,
C42 y C44 (número de carbonos acilados) y define
una ecuación que le permite clasificar correctamente con un 99% de confianza
las mezclas que incorporaron incluso un 5% de grasa no láctea.
Por otra parte, se ha propuesto la alternativa de un modelo de análisis
discriminante lineal (ADL), basado en el análisis cromatográfico
de TAG de grasas lácteas adulteradas con grasas de origen animal, logrando
dilucidar una función discriminante que caracteriza a la grasa láctea
pura, cuya sensibilidad ha demostrado ser una mejor alternativa que cuocientes
entre ácidos grasos o número de carbono de los TAG (Precht,
1991, Villanueva, 1987, Ulberth, 1994).
En la presente investigación se propone presentar un modelo de ADL, para
la determinación de adulteraciones de grasa láctea con grasa de
origen animal, en niveles inferiores al 10%, con al menos un 95% de casos correctamente
clasificados, para muestras de grasa recolectadas durante un año, en
las regiones VIII, IX y X . En una investigación anterior se demostró
que existen diferencias significativas (P<0,05) en la composición
de triglicéridos en la grasa láctea de muestras de leche tomadas
mensualmente y durante un año, a nivel de silos de plantas de las regiones
mencionadas (Shamshiri-Amirkolai, 2001), debido, al parecer,
a diferencias en los sistemas de alimentación predominantes en cada región
(Balocchi, 1999). Además se presenta una función
global que involucra el conjunto de muestras de las tres regiones anteriormente
nombradas (Sur de Chile).
Muestras. Las muestras de grasa láctea pura (GLP), fueron tomadas mensualmente y durante un año (junio de 1998 a mayo de 1999), de silos de plantas lecheras. La grasa no láctea (GNL) de origen animal, (margarinas no vegetales) se obtuvieron en el mercado, de tres industrias de la zona, según los esquemas indicados en el Cuadro 1. Ambos tipos de grasas, fueron analizados en forma similar, por cromatografía gas-líquido de TAG, según lo indicado en un trabajo anterior (Pinto et al., 1987) para la obtención de su perfil de TAG.
Cuadro 1: |
Procedencia de las muestras de grasa láctea pura (GLP) tomadas en estanques de leche de plantas de la VIII, IX y X regiones, y grasa no láctea, margarinas de origen animal (GNL). |
Table 1: |
Origin of the samples of pure milk fat (PMF) taken from tanks of dairy
plants of the VIIIth, IXth and Xth regions,
and of non- milk fat, margarines of animal origin (NMF). |
Conformación de grupos adulterados. Para la realización del ADL,
se procedió a la formación de los grupos según un modelo
de simulación presentado por Villanueva et al (1988),
en donde la fórmula empleada fue:
Ci MEZ = x Ci GNL + (1-x) Ci
GLP (1)
donde:
Ci: Porcentaje de triacilglicérido con un número de
carbono i.
MEZ: Mezcla.
x: Fracción de grasa no láctea.
GNL: Grasa no láctea.
GLP : Grasa láctea pura.
El procedimiento de aplicación de la fórmula (1) puede explicarse
más fácilmente a través de un ejemplo: la mezcla Nº1,
se obtuvo considerando la muestra de grasa láctea pura Nº6, con
un valor de C36 = 0,16 % para GNL, con la muestra de grasa no láctea
Nº38, con un valor de C36 = 8,21 % para GLP, ambas obtenidas
por elección aleatoria computacional, por lo tanto, el porcentaje del
triacilglicérido con número de carbono C36 en la mezcla
con un 5% del adulterante (GNL) resultó según la ecuación
(1):
C36 MEZ = 0,05 * 0,16 GNL + (1- 0,05) * 8,21 GLP = 7,81 %
De ésta forma, se conformaron cuatro grupos:
Grupo 1: Muestra de grasa láctea pura (0% Adulteración).
Grupo 2: Muestras adulteradas en un 5%.
Grupo 3: Muestras adulteradas en un 10%.
Grupo 4: Muestras adulteradas en un 15%.
Análisis discriminante lineal. En las ciencias aplicadas,
frecuentemente ocurren problemas multivariados. Uno de ellos es clasificar una
observación en una o varias poblaciones o grupos. El método más
utilizado para dicho procedimiento es el ADL, que proporciona una regla basada
en un índice llamado función discriminante lineal (F). En el presente
estudio se aplicó la técnica discriminante máximo verosímil
basada en la distancia de Mahalanobis, en la cual fue necesario comprobar el
cumplimiento de ciertos requisitos:
* Los datos de los grupos provienen de una población normal multivariada.
* No existen diferencias entre las matrices de covarianzas de cada grupo.
* Existe diferencia entre los vectores de medias de los grupos, tal que justifica
el análisis discriminante.
Para comprobar la normalidad entre las variables de grupo se utilizó
la prueba de KOLMOGOROV Y SMIRNOV del programa computacional SPSS.
Para verificar el segundo supuesto, se utilizó la prueba de M de BOX
para homogeneidad de covarianzas del programa computacional SPSS.
Finalmente, para verificar el tercer supuesto, se realizó un análisis
multivariado de varianza MANOVA, del programa computacional SPSS.
En general la función discriminante es de la forma:
F = SiZiCi
+ A
donde: F = puntaje discriminatorio; Zi = coeficientes ponderados; Ci = variables
discriminatorias y A = constante. Los valores A y Zi son determinados por el
programa computacional.
Este análisis se desarrolló con todas aquellas variables cuyos
Ci fueron menores o iguales a 1 en el adulterante y que correspondieron a los
triacilglicéridos C34, C36, C38, C40,
C42 y C44, (Figura 1).
Los valores promedio y desviaciones estándar de las variables C34, C36, C38, C40, C42 y C44, encontrados para los cuatro grupos formados, se presentan en el Cuadro 2. En dicho cuadro se puede observar, que existe una disminución en los valores promedio de cada una de las variables consideradas, al incrementarse el % del adulterante, lo que se explica debido a la baja incidencia de estos triacilglicéridos en el adulterante (grasa no láctea de origen animal). En forma gráfica (Figura 1), se puede apreciar que los TAG seleccionados, se presentan en cantidades considerables en la grasa láctea pura y que aún estando presentes también en la grasa no láctea (origen animal), con porcentajes inferiores al 1% (Ci < 1), no tienen la misma incidencia y en algunos casos incluso están ausentes.
Cuadro 2: |
Valor promedio y desviación estándar (DE), de los triacilglicéridos C34, C36, C38, C40, C42 y C44, en muestras de grasa láctea pura (grupo 1), y adulteradas en un 5 % (grupo 2), 10 % (grupo 3) y 15 % (grupo 4), con grasa no láctea de origen animal, n=72. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2: |
Average value and standard deviation of the triacylglycerides C34,
C36, C38, C40, C42 and C44
in samples of pure milk fat (group 1), and in samples adulterated at 5%
(group 2), at 10% (group 3) and at 15% (group 4) with non-milk fat of animal
origin, n = 72. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Figura 1: |
Composición de triacilglicéridos de muestras de grasa láctea pura (GLP) y grasa no láctea (GNL). |
Figure 1: |
Composition of triacylglycerides of samples of pure milk fat (PMF) and non- milk fat (NMF). |
La grasa no láctea de origen animal en las margarinas presentó
triacilglicéridos con números de carbonos superiores a C54,
con porcentajes importantes: C56 (9,5 %); C58 (5,7 %);
C60 (2,4 %), los cuales al no estar presentes en la grasa láctea,
es una indicación cualitativa de la adulteración de la misma.
Dado que para el ADL se conformaron 4 grupos, matemáticamente fueron
posibles 3 funciones discriminantes, pero no todas presentaron la misma capacidad
para clasificar las muestras. En el Cuadro 3, se presenta la información
necesaria para juzgar dichas funciones. Se puede observar que para la Función
1, el valor de la correlación canónica explica en un 86% la clasificación.
Además, se presentan los valores de Lambda de Wilks y sus valores de
Ji-cuadrado con su significancia. Claramente se puede aseverar que la primera
función (F1) es estadísticamente significativa al 5%. Por lo tanto,
todos los resultados clasificatorios se basaron en la Función F1, que
para el Sur de Chile (VIII, IX y X regiones) fue la siguiente:
F1 = 2,4633*C34-2,69418*C36+0,895685*C38
2,09497*C40 + 1,73789*C42 1,57736*C44
la función F1 clasificó correctamente el 100% de las
muestras adulteradas al 15%, el 97,2% y 79,1%, de las muestras adulteradas al
10% y 5%, respectivamente. En promedio, se logró un porcentaje de clasificación
correcta de 92,1% (n=288).
Cuadro 3: |
Valores propios, correlación canónica, valores Lambda de Wilks y ji- cuadrados, de cada una de las funciones obtenidas para el Sur de Chile (VIII, IX y X regiones). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 3: |
Own values, canonical correlation, l-values of Wilks and values of
c-square for each of the functions obtained for the South of Chile (VIII
th, IX th and X th regions). |
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|
La media de los porcentajes de los puntajes discriminantes (centroides) para
cada grupo, evaluados por la función F1 fueron: grupo 1 (-2,309);
grupo 2 (-0,765); grupo 3 (0,780) y grupo 4 (2,326). De la misma forma se obtuvieron,
funciones discriminantes parciales para cada una de las regiones involucradas.
La función obtenida para la VIII región de Chile se definió
como:
F1= 4,62083*C34 - 6,23028*C36 + 2,72306*C38
+ 1,78691*C40 - 5,3398*C42 + 4,02125*C44
que obtuvo un porcentaje de clasificación correcta de 91,6% en muestras
adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un 10 % o superior
(n=48).
La función obtenida para la IX región de Chile se definió
como:
F1 = -2,40779*C34 + 3,44448*C36 3,29087*C38
+ 3,1342*C40 1,47466*C42+ 1,69328*C44
que obtuvo un porcentaje promedio de clasificación correcta de 95,8%
en muestras adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un
10 % o superior (n=96).
La función obtenida para la X región de Chile se definió
como:
F1 = -3,889*C34 + 3,78828*C36 0,723933*C38
+ 2,15942*C40 1,46558*C42 + 1,15839*C44
que obtuvo un porcentaje promedio de clasificación correcta de 77,7%
en muestras adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un
10 % o superior (n = 144).
En la Figura 2, se presentan los porcentajes de clasificación correcta
(muestras adulteradas al 5%) de las funciones obtenidas para Sur de Chile, (
regiones VIII, IX y X). Claramente se visualiza que la función resultante
para la IX región, cumple con las expectativas planteadas en la hipótesis,
puesto que clasifica correctamente más del 95% de los casos adulterados
al 5%. Cabe destacar, además que los porcentajes de clasificación
correcta con niveles de adulteración del 5%, en la VIII región
(91,6%) y X región (77,7%) superan a lo indicado por Guyot
(1978), usando el método de estimación de cuocientes, en éste
caso C52/C38, para manteca (72,0%) y para grasa de vacuno
(C52/C50) (37,0%).
Figura 2: |
Clasificación correcta al 5% de adulteración, de las funciones obtenidas para el Sur de Chile, regiones VIII, IX y X. |
Figure 2: |
Correct classification at 5% adulteration of the functions obtained for the South of Chile (VIII th, IX th and X th regions). |
La alternativa del análisis discriminante lineal ha demostrado ser un
camino muy aceptable para niveles de adulteración de alrededor del 5
%.
Villanueva (1987), estudió la aplicación del
ADL, determinada a partir del análisis de triglicéridos por GLC,
de grasas lácteas, de leche de tres rebaños de la Universidad
Austral de Chile. Las variables independientes fueron determinadas por el sistema
de componentes principales, resultando los números de carbono C34,
C36
C44 como mejores variables discriminantes. Con
la función ADL resultante, se pudo clasificar correctamente con el 95%
de confianza el 97% de mezclas adulteradas en un 5% con grasa no láctea
de origen animal. Esto motivó la búsqueda de una función
para cada una de las regiones de mayor producción lechera del país
(VIII, IX y X regiones).
Precht (1991), propuso una metodología basada en el
análisis de triglicéridos, de hidrogenados de aceites vegetales
y grasas animales tales como manteca de cerdo y grasa de vacuno. La ecuación
de regresión lineal múltiple para detectar manteca de cerdo, propuesta
en este caso, incorpora como variables independientes los triglicéridos
con números de carbono C26, C32, C34,
C36, C42, C46, C52 y C54,
determinando un valor de R, para la grasa láctea pura, que fluctúa
entre 97,9 y 102,6. Valores de R fuera de este rango indican adulteración
de la grasa láctea con un 5% de manteca de cerdo, con un 99% de nivel
de confianza; el autor determinó ecuaciones similares para cada tipo
de adulterante.
Ulberth (1994), aplicó el método ADL para la
detección de adulteraciones de la grasa láctea, considerando la
composición de ácidos grasos. Encontró que los ácidos
grasos saturados e insaturados de la serie C18, fueron las variables
más discriminatorias, identificadas por un procedimiento de selección
de variables paso a paso. Sobre el 95 % de las muestras adulteradas en un 3
% con grasa de vacuno, manteca de cerdo, aceite de oliva y aceite de palma,
fueron correctamente clasificadas. Las mezclas preparadas con un porcentaje
superior fueron detectadas en el 100 % de los casos. Por otra parte Povolo
et al (1999), utilizando el método de perfil de TAG, para la detección
de grasas extrañas en mantequilla, lograron límites de detección
de grasas vegetales y animales entre un 4 y 6 %.
Las funciones discriminantes obtenidas para las regiones VIII, IX y X, pueden
clasificar correctamente muestras adulteradas hasta en un 5% con grasa no láctea,
en el 91,6%, 95,8% y 77,7% de los casos respectivamente y con un 95% de nivel
de confianza, lo cual representa un avance importante para la certificación
de la autenticidad de los productos que incorporan grasas lácteas.
Esta investigación fue patrocinada y financiada en parte por la Dirección
de Investigación y Desarrollo DID-UACH proyecto S-1999040 y por el proyecto
FONDECYT Nº 1961046.
Especiales agradecimientos al Sr. Carlos Quintana, estadístico, por su
valioso aporte en los análisis estadísticos de los resultados
en la presente investigación y a la Srta. Shaparak Shamshiri-Amirkolai
B., por su colaboración en el manejo computacional.
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