AGRO SUR 37(1) 60-83 2009
DOI:10.4206/agrosur.2009.v37n1-07

ARTÍCULOS ORIGINALES

ESTRUCTURA POBLACIONAL Y DIVERSIDAD GENÉTICA DE REBAÑOS BOVINOS DE CARNE DEL SUR DE CHILE

Population structure and genetic diversity of bovine meat herds of Southern Chile

Mª Gabriela Pizarro ⁽¹⁾, Fernando Mujica ⁽²⁾, Ricardo Felmer ⁽³⁾

⁽¹⁾ Universidad Católica de Temuco, kalufour@yahoo.es.
⁽²⁾ Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia.
⁽³⁾ Instituto de Investigación Agropecuaria, Carillanca. Casilla 58 D, Temuco.

ABSTRACT

The genetic variability observed in domesticated animal species is progressively disappearing due to breed replacement and introgressions aimed at improving productivity and quality. These actions have eroded important adaptation traits, such as disease resistance and tolerance to harsh environments, usually found in local breeds. Currently, there is not sufficient information to understand the relationships among bovine breeds locally adapted and those of exotic origin and recently introduced. In the last decades, a number of genetic markers have become available to study the genetic diversity in a number of domestic animal species. In the present work, 10 microsatellite markers were used to study the genetic diversity and population structure of 212 bovine individuals (eight genotypes) distributed in several geographical Chilean zones. The microsatellites were amplified using PCR and the fragments were separated electrophoretically using the sequencer ABI PRISM 310. The results showed a clear evidence of population structure among eight bovine genotypes found in southern Chile. Estimate the genetic variability through the calculation of gene frequency allowed heterozigosity per locus to be determined, which varied between 0.61 SPS115 to 0.85 TGLA227. The average heterozigosity of the population was 0.73. According to the PIC, all loci studied were informative, with values that ranged from 0.58 SPS115 to 0.84 TGLA227, with an average population of 0.70. It was concluded that among the microsatellite markers analyzed there was a high degree of polymorphism; the number of alleles per locus in the population varied between nine for the SPS115 marker and 19 for the TGLA122 and INRA23 markers, respectively. In this way, the genetic analysis carried out revealed a high hybridization between beef breeds with subsequent probability of 0.99 and an average Fst (Index of genetic differentiation) in the population of 0.1371 (13.7%), which confirm the high genetic variation existing in the populations studied.

Key words: bovine, microsatellites, PCR, heterozigosity, polymorphism, genetic diversity.

RESUMEN

La variabilidad genética presente en especies animales domesticadas ha desaparecido progresivamente debido, en gran parte, a la sustitución de razas y cruzamientos dirigidos destinados a incrementar la productividad y calidad de los productos animales. Lo anterior, ha erosionado características adaptativas presentes en razas locales, tales como resistencia a enfermedades y tolerancia a climas adversos. Actualmente, no existe información suficiente que permita comprender las relaciones genéticas entre los genotipos bovinos localmente adaptados y aquellos exóticos introducidas con posterioridad al país. En las últimas décadas ha existido un notorio aumento en la disponibilidad de marcadores genéticos destinados al estudio de la diversidad genética de especies domesticadas. En este estudio, 10 marcadores microsatélites fueron utilizados para estudiar la diversidad genética y estructura poblacional en un total de 212 individuos (ocho genotipos) distribuidos en diferentes zonas geográficas del país. Los microsatélites fueron amplificados mediante reacciones PCR y los fragmentos amplificados separados electroforéticamente en un secuenciador automático ABI PRISM 310. El estudio describió la estructura poblacional y diversidad genética en ocho genotipos. La determinación de la variabilidad genética mediante el cálculo de frecuencia génica permitió estimar la heterocigosidad por locus que varió entre 0,61 para el marcador SPS115 y 0,85 para el marcador TGLA227, obteniéndose una heterocigocidad media de la población de 0,73. Según el PIC (Contenido de información polimórfica) todos los loci estudiados fueron informativos, encontrándose que para la población de animales analizados los rangos variaron entre 0,58 para el marcador SPS115 y 0,84 para el marcador TGLA227, con un promedio de la población de 0,70. Se concluyó así que dentro de los marcadores microsatelitales analizados se encuentra un alto grado de polimorfismo, variando el número de alelos por locus en la población entre nueve para el marcador SPS115 a 19 para los marcadores TGLA122 e INRA23. De esta forma, el análisis genético realizado evidenció una elevada hibridización entre las razas de carne, con una probabilidad posterior de 0,99 y un promedio de Fst (Indice de diferenciación genética) en la población de 0,1371 (13,7%), lo que confirma una alta variación genética entre las poblaciones analizadas.

Palabras clave: bovinos, microsatélites, PCR, heterocigocidad, polimorfismo, diversidad genética.

INTRODUCCIÓN

El proceso constante de domesticación y mejoramiento genético de animales ha permitido la selección de fenotipos con mejores atributos que han formado una población en constante crecimiento. La variabilidad o diversidad genética hace posible la adaptación de los animales a enfermedades, parásitos, diversas condiciones climáticas, de alimentación y otros factores como las cambiantes exigencias del mercado (Mujica, 2005). La pérdida de la diversidad genética no sólo pone en riesgo la desaparición de ciertas razas tradicionales o nativas, sino que además limita los progresos del mejoramiento genético a desarrollarse en el futuro (Barker, 1999). La genética molecular ofrece actualmente una serie de herramientas que pueden aplicarse para facilitar la identificación y registro de individuos (Cornide, 2002), en la determinación del grado de consanguinidad (Wright, 1969) y diversidad genética existente entre y dentro de las distintas poblaciones animales, así como también en la estimación de las distancias genéticas (Nei, 1987; Weir, 1996; Beaumont et al., 1998) presentes entre las poblaciones animales y en la definición de sus orígenes y procesos evolutivos (Nagamine y Higuchi, 2001). Para el desarrollo y futuro de una industria animal altamente productiva y competitiva en el entorno mundial, la evaluación, el aprovechamiento y la conservación de la biodiversidad presente en las poblaciones animales resulta fundamental. Por lo tanto, es importante establecer esquemas de evaluación sistemáticos de la capacidad productiva de las poblaciones locales, tanto en aquellas consideradas como razas exóticas, criollas o nativas. Esta información es crucial para la selección de los individuos que pueden formar parte de un futuro banco nacional de los recursos genéticos animales. En tal sentido, la explosión del conocimiento del genoma y las innovaciones tecnológicas que acompañan este conocimiento (marcadores moleculares) han abierto la posibilidad para la caracterización de la diversidad genética de poblaciones animales, y al mismo tiempo para la selección directa de animales que lleven la mejor combinación de genes, facilitando de esta forma las decisiones en programas de mejoramiento y selección de genotipos.

De esta forma, el objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad genética y estructura poblacional de ocho genotipos de bovinos del Sur de Chile, empleando para ello un panel de 10 marcadores microsatélites específicos del bovino. La comparación de estos genotipos permitirá contribuir al conocimiento genético de la especie, aportando información sobre las variantes alélicas, genotípicas, heterocigosidad por locus, contenido de información polimórfica (PIC) y la estimación de la diversidad genética en poblaciones de ganado destinados a la producción de carne y leche. Con esta información, se espera entonces establecer una base genética que permitirá la comparación de estas razas con otras razas que han sido o que están siendo actualmente introducidas en el país.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo de animales

Se recolectaron 212 muestras de pelo correspondientes a animales de ocho genotipos bovinos de la Región de La Araucanía, Región de Los Lagos y Región de Aysén General Carlos Ibáñez del Campo, entre las que se incluyeron el Overo Colorado de Vilcún (OCV, 25 Animales), Overo Colorado de Coyhaique (OCC, 15 Animales), Clavel de Carne Chileno (CC, 18 Animales), Angus Rojo (AR, 16 Animales), Hereford (HERF, 27 Animales), Charoláis (CH, 20 Animales), Overo Negro (ON, 52 Animales) y Holstein Friesian (HF, 39 Animales). Los animales fueron debidamente identificados mediante el número de crotal asignado por el productor y un número de laboratorio correlativo asignado por el investigador. Las muestras de pelo (mayor a 20 unidades) se obtuvieron, con la ayuda de un alicate, directamente desde el lomo, cruz, flancos y/o paleta de animal, teniendo el cuidado de que contenga el folículo piloso que es donde se encuentran las células nucleadas y por lo tanto el ADN. Estas muestras fueron almacenadas en bolsas individuales de papel debidamente rotuladas y llevadas para su análisis al Laboratorio de Biotecnología Animal de INIA - Carillanca. Las muestras fueron conservadas a 4° C hasta su procesamiento.

Extracción del ADN a partir de muestras de pelo

El protocolo usado para este estudio fue establecido previamente en el Laboratorio de Biotecnología Animal de INIA - Carillanca. Se seleccionaron 10 pelos con folículo piloso visible de cada animal, los cuales se lavaron brevemente con agua destilada y se cortaron a 1 cm del bulbo. Estas muestras se dispusieron en un tubo Eppendorf, al cual se le agregaron 100 uL de "tampón de lisis de pelo" (Tween 20 0,5 %, NP-40 0,6%, MgCl2, 5 mM, Tris-HCL 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM) y 0,6 uL de proteinasa K (20 mg mL-1). Las muestras se incubaron a 60° C por 1 h en un termomixer (Eppendorf) con agitación de 800 r.p.m. y luego durante 15 min a 99°C, para inactivar la proteasa. Antes de ser utilizada para su amplificación mediante PCR, se centrifugó la muestra por 2 min a 14.000 r.p.m., para separar las impurezas.

Elección de microsatélites y amplificación mediante la técnica de PCR

Para el análisis genético se utilizaron 10 micro-satélites recomendados por la Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG; http://www.isag.org.uk/) (ETH3, TGLA122, TGLA227, BM1824, ETH10, ETH225, BM2113, INRA23, SPS115, TGLA126), los que fueron marcados con los fluoróforos Hex, Fam y Ned para su análisis en el secuenciador automático. Para el análisis de microsatélites se utilizó la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) la que permite amplificar grandes cantidades de una región particular de ADN, a partir de una pequeña cantidad original de ADN, gracias al uso de dos secuencias cortas e informativas de oligonucleótidos, denominadas "partidores" que son específicos de la región que se quiere amplificar. Estos microsatélites se amplificaron en tres reacciones múltiplex en un termociclador (Perkin Elmer modelo 9700), para evitar la manipulación de un mayor número de muestras, disminuyendo así el riesgo de contaminación. Cada reacción de PCR (volumen final 20 uL) contenía entre 20 ng a 100 ng de ADN genómico, utilizado como templado, dNTPs 100 uM, MgCl2 1,5 mM, partidores (0,1 mM a 0,3 mM dependiendo del partidor), tampón de PCR 1 X y 1 U de ampliTaqGold ADN polimerasa (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción incluyeron una etapa inicial de denaturación del ADN por 5 min a 94° C, seguido de 35 ciclos de amplificación consistentes en: denaturación por 1 min a 94° C, hibridación por 1 min a 55° C (o 62° C dependiendo del partidor) y elongación por 1 min a 72° C, para terminar con una etapa de extensión de 10 min a 72° C.

Análisis de microsatélites en secuenciador automático

El análisis de los microsatélites amplificados por PCR se realizó mediante un secuenciador automático de electrofóresis capilar y detección fluorescente ABI PRISM 310 de Applied Biosystems. El sistema discrimina los fragmentos de ADN por tamaño y por la fluorescencia que emite el fluoróforo. Los resultados se analizaron por medio del software de análisis GeneScan (Applied Biosystems).

Análisis genético de los datos

Una vez recolectados los datos en el secuenciador ABI PRISM 310, se elaboró una planilla con el cual se incluyó la información de los tamaños y números de alelos obtenidos (genotipos) en los animales, para cada uno de los microsatélites analizados, agrupados de acuerdo a la raza de cada animal. En aquellos casos en que no se pudo disponer de información para un alelo determinado, se le asignó un valor arbitrario (9), valor que sería posteriormente interpretado por el Software de análisis, como dato perdido. La frecuencia alélica se calculó por conteo simple, mediante la división entre el número de alelos obtenidos y la sumatoria de éstos. La heterocigosidad (H) se estimó mediante la formula de Nei y Roychoudhry (1974), mientras que el PIC se calculó según la formula descrita por Botstein et al., (1980). Los datos poblacionales obtenidos fueron analizados mediante los programas PAUP3.0 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) y Structure 2.2. El programa Structure pone en práctica un método a base de modelo de agrupamiento para deducir la estructura de población usando datos genotípicos. Pritchard et al., (2000), y Falush et al., (2003). Sus aplicaciones incluyen la deducción de la presencia de poblaciones distintas, para asignar individuos a las poblaciones, estudiar y estimar frecuencia de alelos de la población en situaciones donde están muchos individuos mezclados. El programa PAUP3.0, fue elaborado por el profesor David L. Swofford (Laboratorio de Sistemática Molecular, Instituto Smithsoniano Washington, DC). Incorpora la gran mayoría de los algoritmos para la elaboración de árboles genéticos y filogenéticos, según los criterios de distancia y parsimonia. Los datos analizados fueron previamente identificados por raza y número asignado por el investigador, los tamaños de alelos obtenidos para cada microsatélite, Las bandas fueron identificadas con un patrón de números de acuerdo a la forma de codificación binaria 0, 1 y -, indicando para cada caso la presencia, ausencia o falta de dato, respectivamente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Heterocigosidad y Contenido de información polimórfica (PIC)

En los 212 animales analizados se encontraron un total de 135 alelos para los 10 loci microsatélites empleados. Como se muestra en el Cuadro 1, todos los microsatélites analizados presentaron polimorfismo, variando el número de alelos por locus en la población entre 9 (SPS115) y 19 (TGLA122 e INRA23). En cuanto a los microsatélites con mayor polimorfismo presente entre las poblaciones, se puede destacar los micro-satélites TGLA122 e INRA23 que presentaron entre tres a 10 alelos más que el resto de los microsatélites. La frecuencia alélica promedio encontrada en la población de las razas fue de 13,5 alelos por locus. Estos datos concuerdan con lo descrito por Brenneman et al. (2006), quienes encontraron un promedio de 12 alelos por locus en razas bovinas y se correlacionan con lo obtenido por otros autores con estos mismos microsatélites (Bedoya et al., 2001; Zamora et al., 2004). Mediante el genotipado de las diferentes razas analizadas se puede destacar que los valores de la heterocigosidad por locus varían entre 0,61 para el microsatélite SPS115 y 0,85 para el microsatélite TGLA227 (Cuadro 2). Estos datos se diferencian con los encontrados por Machugh et al., (1994), quienes obtuvieron valores de heterocigosidad comprendidos entre 0,55 y 0,80 en razas europeas bovinas, aunque en este caso, los autores emplearon un panel distinto de microsatélites. La heterocigosidad media de la población fue 0,73 (Cuadro 2), lo cual está dentro del rango de valores previamente publicados por Moazami-Goudarzi et al., (1997), quienes obtuvieron un valor de 0,70 utilizando 17 microsatélitales en 10 razas de bovinos europeos. Por otro lado resulta superior al valor descrito por Del Bo et al., (2001), en un total de 13 razas europeas del área alpina. Valores similares fueron estimados por Zamorano et al., (1998), en la raza española berrenda en negro.

Cuadro 1. Frecuencia alélica de la población en ocho genotipos de la zona Sur de Chile. Table 1. Allele frequency in eight cattle genotypes from the area South of Chile.

Microsatélites

Definición: T (Tamaño); N° AL (Número de Alelos); Fr (Frecuencia); Genotipos (OCV; OCC; CC; AR; HERF; CH; ON; HF)

Cuadro 2. Heterocigocidad por locus (H) y contenido de información polimórfica (PIC) de 10 microsatélites en ocho poblaciones de ganado de carne del Sur de Chile. Table 2. Heterozigosity (H) and polymorphic information content (PIC) from 10 microsatellites from eight populations of beef cattle of the South of Chile.

A nivel de raza, se puede observar en el Cuadro 2 que la heterocigosidad promedio varió entre los rangos 0,66 en la raza CH y 0,76 en las razas OCV y CC, de lo cual se puede inferir que probablemente no existirían problemas de consanguinidad en los grupos de animales estudiados. Con respecto al PIC (contenido de información polimórfica), índice que evalúa la informatividad de cada microsatélite en la población de acuerdo a las frecuencias de sus alelos, se puede observar que todos los loci estudiados fueron altamente informativos, encontrándose rangos entre 0,58 para el marcador SPS115 y 0,84 para el marcador TGLA227, con un promedio de la población de 0,70 (Cuadro 2).

Análisis de parsimonia

Figura 1. Dendograma de siete razas de ganado bovino del sur de Chile. Figure 1. Dendogram of seven races of cattle from the South of Chile.

Figura 2. Análisis de probabilidad posterior de K (subpoblaciones) de toda la población, incluyendo razas de doble propósito. Figure 2. Probability analysis of subsequent K (subpopulations) for the entire population, including dual-purpose breeds.

Figura 3. Análisis de probabilidad posterior de K en todas las poblaciones de carne, excluyendo las razas de doble propósito. Figure 3. Probability analysis of subsequent K in all populations of meat herds, excluding dual purpose races

 

Figura 4. Análisis de estimaciones de Q en seis genotipos bovinos de carne de la zona Sur de Chile. Cada individuo es representado por una barra de colores divididos en K, según los cluster encontrados. Figure 4. Analysis of estimates of Q in six genotypes of beef cattle in the South of Chile. Each individual is represented by a color bar divided into K, according to the clusters found.

 

CONCLUSIONES

La variabilidad genética estimada para los microsatélites permitió confirmar que dentro de los ocho genotipos estudiados existe polimorfismo, encontrando 135 alelos por locus para los 10 loci microsatélitales analizados, los que variaron según el número de alelos por locus en la población entre nueve para SPS115 y 19 para TGLA122 e INRA23, respectivamente.

∑ El análisis de parsimonia realizado permitió establecer que los animales tienden agruparse en relación a sus respectivas razas formando cluster o grupos claramente diferenciables entre sí. Además, el análisis reveló que las razas Overo Colorado de Vilcún y Overo Colorado de Coyhaique se encontraban en grupos diferenciados.

∑ Según la relación genética, se pueden destacar dos genotipos con un alto grado de pureza, las que corresponden a las razas Angus Rojo y Hereford, en los cuales se obtuvo un índice de diferenciación genética (Fst) de 0,212 y 0,171, respectivamente. Además, se encontró evidencia de panmixia en las razas Overo Colorado de Coyhaique y Clavel de Carne Chileno con una diferenciación genética (Fst) de 0,069, lo que indica la alta variación genética existente entre las poblaciones.

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Recepción originales: 14 de octubre de 2008