CIENCIAS VEGETALES: CROP SCIENCE

Caracterización de secuencias de los genes Ahas y psbA relacionados con resistencias a herbicidas en Lupinus albus L.

Characterization of sequence of Ahas and psbA genes related to herbicide resistance in Lupinus albus L.

Vásquez, S.^{a,
c}, Mestanza, C.^a, ^d, Riegel, R.^b*

^a Escuela de Graduados, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. ^b Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
^c Universidad Politécnica Salesiana, Cuenca, Ecuador. ^d Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Ecuador.

Correspondencia a:

ABSTRACT

White lupine (Lupinus albus L.) is an important legume for human and animal consumption. However, this crop is a poor competitor with weeds, so their management is essential to increase yield. Among the herbicide most widely used for weed control in major crops, are inhibitors of acetohydroxyacid synthase (Ahas) (imidazolinone and sulfonylurea) and inhibitors of photosystem two (PII) (triazines, triazinones ureas). This study aimed to isolate and characterize Ahas and psbA genes related to resistance to herbicides inhibitor of Ahas and PII respectively. The coding region of these genes in Lupinus albus was amplified (PCR) and sequenced. These are potential sites containing the mutation involved in resistance to the described herbicides. In the gene Ahas we confirm the existence of a mutation (Gly₆₅₄ → Asn) at a site previously reported to cause resistance to imidazolinones in other species. This point mutation is conserved in various legumes.

Keywords: Acetohydroxyacid synthase, acetolactate synthase, Ahas, Als, psbA, D1, Lupinus albus.

RESUMEN

El lupino blanco (Lupinus albus L.) es una importante leguminosa para la alimentación humana y animal. Sin embargo, este cultivo es un pobre competidor con las malezas, por lo que su manejo es fundamental para incrementar el rendimiento. Entre los herbicidas más utilizados para control de malezas en los principales cultivos están los inhibidores del acetohidroxiácido sintasa (Ahas) (imidazolinonas y sulfonilureas) y los inhibidores del fotosistema dos (PII) (triazinas, triazinonas, ureas). Este trabajo tuvo por objeto aislar y caracterizar los genes Ahas y psbA relacionados con la resistencia a herbicidas inhibidores de Ahas y PII respectivamente. Se amplificó (PCR) y secuenció la región codificante de Ahas y PsbA en Lupinus albus, los cuales están conteniendo los sitios cuya variación nucleotídica se asocia con la resistencia a estos herbicidas. En el gen Ahas se reporta la existencia de una mutación en un sitio previamente informado como causante de la resistencia a imidazolinonas (Gly₆₅₄ → Asn), y se encuentra conservado en varias leguminosas.

Palabras clave: Acetohidroxiácido sintasa, Acetolactato sintasa, Ahas, Als, psbA, D1, Lupinus albus.

INTRODUCCIÓN

Lupinus es un género relativamente amplio y uno de los geográficamente más extensos, con una rica diversidad de especies (Gladstones, 1998). Las principales especies cultivadas a nivel mundial son: lupino de hoja angosta o australiano (Lupinus angustifolius L.), lupino blanco (Lupinus albus L.), lupino amarillo (Lupinus luteus L.), y lupino andino (Lupinus mutabilis Sweet.), las cuales presentan auto y polinización cruzada (Langridge y Goodman, 1985; Tay, 2009). Estas especies son consideradas de origen paleopoliploide (Atkins et al., 1998; Gladstones, 1998). En su temprana evolución probablemente ocurrieron eventos de auto y/o haloploidización y posteriormente un proceso de divergencia del genoma llevando a una "diploidización" (Wendel, 2000). En la actualidad, las formas de lupino son funcionalmente diploides, sin embargo, los niveles de ploidía aún no están claros en muchas especies de este género (Naganowska et al., 2003). La domesticación de las especies cultivadas de lupino ocurrió paralelamente en regiones del Mediterráneo y los Andes, sin embargo, tienen una historia relativamente corta de domesticación en comparación con la mayoría de los cultivos (Cowling et al., 1998; Clements et al., 2005).

El grano de Lupinus albus es utilizado tanto para alimentación humana como animal debido a su alto contenido de proteína (Lagunes-Espinoza et al., 2000). Además, Lupinus albus tiene un bajo índice glucémico por lo que tiene importantes implicaciones para la salud humana (Phan et al., 2007). El lupino blanco es usado en la rotación de cultivos para reducir los agentes causantes de enfermedades, y para mantener la fertilidad del suelo a través de la fijación de nitrógeno atmosférico (Jones et al., 2003). Además, Lupinus albus se adapta bien a los suelos que tienen bajos niveles de fósforo debido a sus raíces proteiformes (Neumann y Martinoia, 2002).

El lupino blanco a pesar de ser un cultivo de follaje denso, es un mal competidor con las malezas debido a su lenta tasa de crecimiento en las primeras etapas, especialmente en el establecimiento del cultivo. Las malezas compiten con el lupino por el agua, nutrientes, luz solar y espacio, además pueden albergar plagas y patógenos causantes de enfermedades. Si no se realiza un adecuado control, las malezas pueden reducir el rendimiento significativamente. En Lupinus albus (Silva y Acevedo, 2003; Tay, 2009) y Lupinus angustifolius (Allen, 1977) informan que las malezas pueden ocasionar perdidas en el rendimiento de hasta el 70%.

Dentro de un sistema de cultivo con mínima labranza, los herbicidas se utilizan ampliamente para controlar las malezas. Así mismo, la tolerancia a los herbicidas amplía las opciones de manejo de malezas en un sistema productivo. Por ejemplo, en Australia, el manejo de las malezas ha sido fundamental para el desarrollo de Lupinus angustifolius como un cultivo exitoso, y los productos químicos han desempeñado un papel clave en este manejo (Bowran y Hashem, 2008), sin ellos es poco probable que este cultivo haya podido llegar a la superficie actual de 450.200 Ha (FAOSAT, 2014). Por lo tanto, un manejo adecuado de las malezas es fundamental para maximizar el rendimiento en lupino.

Las sulfonilureas (SU) e imidazolinonas (IMI) son familias de herbicidas de amplio uso. Estas se encuentran entre las opciones más populares para los agricultores de todo el mundo, porque no son tóxicos para los animales y son altamente selectivos (McCourt et al., 2006). Estos herbicidas son eficaces para matar plantas susceptibles mediante la inhibición de la acetohidroxiácido sintasa AHAS (EC 4.1.3.18), también conocida como acetolactato sintasa (ALS) (Duggleby y Pang 2000), que es una enzima clave en la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada tales como la valina, leucina e isoleucina en eucariotas y procariotas (McCourt et al., 2006). La inhibición de AHAS conduce a la muerte de la planta, principalmente debido a la inanición por falta de aminoácidos específicos, aunque otros efectos secundarios de la inhibición de AHAS también han sido implicados en el mecanismo de muerte de la planta (Shaner, 1991).

Otros grupos químicos como las triazinas, triazinonas, ureas y uracilos, también son herbicidas ampliamente utilizados para el control de malezas. Estos herbicidas a pesar de ser estructuralmente diversos tienen el mismo mecanismo de acción, inhiben la fotosíntesis de las plantas debido a que compiten con la plastoquinona (PQ) en el sitio de unión de la PQ con la proteína D1 dentro del complejo fotosistema dos (PSII). La inhibición del transporte de electrones del PSII detiene la producción de NADPH y ATP provocando una reducción del ciclo del carbono, lo que provoca una inanición de carbohidratos y estrés oxidativo (Powles y Yu, 2010). En Australia, donde el lupino de hoja angosta es la principal leguminosa cultivada, la metribuzina (triazinona) se usa ampliamente como herbicida post-emergente para el control de malezas dicotiledóneas (Perry et al., 1998; Bowran y Hashem 2008). Este tipo de herbicidas también se usa como pre-emergente para el control de malezas mono y dicotiledóneas en otros cultivos como soya (Glycine max L.) (Barrentine et al., 1982) y trigo (Triticum aestivum L.) (Kleemann y Gill, 2007).

Estudios sobre la resistencia a herbicidas en varios cultivos han encontrado diferentes modos de herencia y de acción genética. En diversas investigaciones ha sido posible inducir artificialmente mutaciones que otorgan resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS. Estas estarían controladas por un gen semi-dominante en soya (Sebastian et al., 1989; Ghio et al., 2013), trigo (Newhouse et al., 1992) y raps (Brassica napus L.) (Swanson et al., 1989). En arroz (Oryza sativa L.) un gen estaría controlando la tolerancia a imidazolinona, mientras que en maíz (Zea mays L.) y raps dos genes con efecto aditivo estarían involucrados en la tolerancia a imidazolinona (Tan et al., 2005). Por otro lado, un solo gen dominante controla la tolerancia a metribuzina en genotipos de soya (Glycine max) (Edwards et al., 1976), y soya silvestre (Glycine soja Sieb. y Zucc.) (Kilen y He, 1992). Múltiples genes con efectos aditivos se han encontrado para la tolerancia metribuzina en los cultivares de trigo duro (Triticum durum Desf.) (Villarroya et al., 2000). En lupino de hoja angosta dos genes de naturaleza no alélica y con efecto aditivo estarían involucrado en la resistencia a metribuzina (Si et al., 2011), sin embargo, el mecanismo de tolerancia al herbicida no estaría basado en un sitio-objetivo, surgiendo que probablemente el metabolismo de la metribuzina está mediada por citocromo P450 (Pan et al., 2012). Para el lupino blanco a la fecha no hay descritas variantes nucleotídicas asociadas a la resistencia a herbicidas. Siendo las herramientas de control químico de malezas limitadas principalmente a herbicidas preemergentes.

El conocimiento del control genético, así como la ubicación y la secuencia de los genes implicados en la tolerancia a los herbicidas pueden ser de mucha utilidad para estrategias de mejoramiento genético en las que se combina el mejoramiento convencional y molecular. Por ejemplo, mediante la aproximación de la genética reversa usando la técnica de TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) se inducen mutaciones y se identifican a nivel de ADN las plantas poseedoras de la mutación en el/los genes de interés. Este trabajo tuvo por objeto sentar las bases moleculares para una estrategia de este tipo, al identificar y caracterizar en Lupinus albus los genes Ahas y psbA asociados a resistencia a herbicidas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y aislamiento de ADN

Semillas de Lupinus albus cv. Rumbo fueron sembradas en macetas y crecidas en invernadero, se cosecharon 5 hojas jóvenes de plantas individuales para el aislamiento del ADN. La extracción del ADN genómico se realizó utilizando bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (Almeyda et al., 1999) con adaptaciones realizadas por Muñoz (2011). La calidad y cantidad de ADN extraído fue evaluado por electroforesis en geles de agarosa al 1,5%. El ADN fue cuantificado mediante espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 260 nm. El ADN fue diluido a una concentración final de 50 ng/μl.

Amplificación PCR y secuenciación de los genes psbA y Ahas

No existe información disponible en las bases de datos sobre las secuencias de los genes Ahas y psbA de Lupinus albus. En consecuencia, las secuencias de Ahas1 de soya (Glycine max) y fréjol (Phaseolus vulgaris L.) (Accesiones Genbank FJ581423.1 y GQ466185.1, respectivamente), y datos de secuenciación masiva de L. angustifolius (secuencia WGS) (GenBank: AOCW01146481.1) (Yang et al., 2013) se utilizaron para diseñar una serie de partidores para amplificar el gen Ahas. Mientras que para la amplificación del gen psbA se diseñaron partidores en base a la secuencia genómica del gen psbA de Lupinus luteus (NCBI: NC_023090.1) (Martin et al., 2014). El diseño de los partidores se realizó mediante el software Primer3 v.0.4 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) (Cuadro 1).

Cuadro 1. Conjunto de partidores utilizados para la amplificación de los genes Ahas y PsbA.
Table 1. Primer sets used for Ahas and psbA genes amplification.

F: forward primer; R: reverse primer.
^a La numeración de los nucleótidos se indican a partir del extremo 5' de la región codificante
(CDS), en base a la secuencias de Ahas1 y psbA de Arabidopsis thaliana.

Para Ahas y psbA, la reacción PCR se llevó a cabo en un volumen de 50 μl que consistió en 2 μL de ADN, 36,6 μL de agua desionizada estéril, 5μL de Taq buffer 10X (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc., USA), 1 μL de dNTPs (10 mM) (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc., USA), 3 μL de MgCl2 (25 Mm) (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc., USA), 1 μL de cada partidor (10 pmol/μL) y 0,4 μL de Taq polimerasa (5u/μL) (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc., USA). La PCR se realizó en un termociclador Labnet Multigene Gradient con el siguiente perfil: 94 °C 3 min, 37 ciclos a 94 °C 45s, 1min a temperatura de alineamiento variable (Cuadro 1), y 72 °C 1 min, y una extensión final de 7 min a 72 °C. Los fragmentos de los genes psbA y Ahas fueron visualizados en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio (0,5 μg/mL), los productos PCR fueron purificados y secuenciados directamente mediante método Sanger en un secuenciador capilar ABI 3730 xl (Macrogen Inc., Seúl, Korea).

Análisis de secuencias

Las secuencias fueron visualizadas mediante el software Chromas Lite 2.1.1. Para confirmar que las secuencias codifican los genes de interés, se comparó con secuencias existentes en la base de datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando el programa de búsqueda Basic Local Alignment Search (BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Se realizaron alineamientos usando el programa Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) con secuencias codificantes de los genes psbA y Ahas de otras leguminosas existentes en la base de datos GenBank. Las secuencias de aminoácidos fueron predichas mediante el software Orf-Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis del gen Ahas

El set de partidores permitieron amplificar la región codificante (CDS) parcial del gen Ahas de Lupinus albus, el fragmento corresponde a 1651 pb de nucleótidos. Ahas de L. albus mostró alineamiento significativo con el gen Ahas1 de Cicer arietinum L. 84% (XM_004485696.1); Ahas2 de Glycine max 84% (XM_003543011.2); Ahas de Phaseolus vulgaris 83% (KF378787.1). Además, se realizó un análisis Blast con datos de secuenciación masiva del genoma de Lupinus angustifolius (whole genome shotgun sequence) (Yang et al., 2013), este análisis mostró alineamiento significativo sólo con dos secuencias (GenBank: AOCW01126472.1 y AOCW01146481.1) 96 y 89 % respectivamente, estos resultados sugieren que son genes homólogos de Ahas en Lupinus angustifolius.

La región del gen Ahas en Lupinus albus no está interrumpida por intrones, lo que está de acuerdo con los genes Ahas reportados. Ésta es característica de casi todas las plantas superiores en las que se ha estudiado este gen, hasta la actualidad en sólo tres especies vegetales se han reportado intrones, en Lindernia spp, (Uchino y Watanabe, 2002), Schoenoplectus juncoides Roxb. (Uchino et al., 2007) y Schoenoplectus mucronatus L (Scarabel et al., 2010).

Algunos productos secuenciados se descartaron por la presencia de pics solapados en el cromatograma, lo que probablemente sugiere la presencia de más de una copia de Ahas en L. albus; de hecho las plantas superiores tienen un número variable de genes Ahas, lo que depende principalmente del nivel de ploidía (Azevedo et al., 2006). Por ejemplo Arabidospsis thaliana L. (diploide) tiene una copia constitutiva, Nicotiana tabacum L. (alotetraploide) tiene dos loci disociados de Ahas, cuyos genes tienen expresión coordinada en todos los órganos (Mazur et al., 1987); Zea mays, considerado un alopoliploide críptico, tiene dos genes Ahas muy similares; Brassica napus, un anfidiploide de Brassica campestris L. y Brassica oleracea L., tiene cinco genes Ahas, las diferentes isoformas son reguladas en el desarrollo de tejidos específicos (Singh, 1999). Estudios recientes en Glycine max (fabaceae) (Ghio et al., 2013), encontraron cuatro copias del gen Ahas, sin embargo solo una (Als1) sería la que más se expresa en las hojas y estaría controlando la resistencia a SU. Mientras que Walter et al. (2014) aislaron cinco genes Ahas y dos de estos (Als1 y Als2) estarían involucrados en el control de la resistencia a SU en soya.

Los antecedentes de la literatura y los resultados de secuenciación, sugieren que probablemente existe más de una copia del gen Ahas en Lupinus albus, lo que abre nuevas perspectivas en el control genético de la resistencia a herbicidas útiles para el mejoramiento genético de este cultivo. De confirmarse la presencia de más copias del gen Ahas se requiere profundizar en su estudio para determinar el papel que jugarían en el control de la resistencia a herbicidas inhibidores de la enzima AHAS.

A nivel de aminoácidos AHAS de Lupinus albus, predijo una secuencia (parcial) de 550 aa lo que está de acuerdo con la mayoría de plantas en donde estos genes se componen de aproximadamente 660 aa variando entre las especies (Pang et al., 2002). La secuencia de L. albus en aminoácidos exhibe identidad significativa con AHAS1 de Cicer arietinum 89% (XP_004485753.1); AHAS2 de Glycine max 89% (XP_003543059.1); AHAS de Ricinus communis L. 90% (Xp_002511176.1) y AHAS de Phaseolus vulgaris 88% (ACV84152.1, resultados que confirman que se trata del gen Ahas.

Estudios de AHAS indican que presenta cinco dominios discretos (A, B, C, D y E), cada dominio comprendido entre 4 y 19 aa (12 a 57 pb) (Boutsalis et al., 1999). Los dominios C, A y D abarcan los residuos 115 a 133, 191 a 203 y 205 a 210 del gen Ahas respectivamente; el dominio B comprende los residuos 573 a 576 y el dominio E abarca los residuos 651 a 655 (Park y Mallory-Smith, 2004). Las mutaciones que se producen en posiciones aminoacídicas específicas dentro de cada uno de estos dominios resultan en una reducción de la sensibilidad a ciertas clases de inhibidores de Ahas (Tan et al., 2005).

La región amplificada en Lupinus albus está conteniendo todos los sitios cuya variación nucleotídica se asocia a la resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS descritas hasta ahora, tanto en malezas como en cultivos (Figura 1). Las mutaciones en las posiciones Ala₁₂₂→ Thr y Tyr, Ala₂₀₅ → Val, Ser₆₅₃ → Thr, Asn, Ile y Gly₆₅₄→ Glu y Asp (de acuerdo con la numeración adoptada para la secuencia de Ahas de Arabidopsis thaliana) provocan resistencia a los herbicidas IMI; particularmente la mutación en Ser₆₅₃ que confiere tolerancia a IMI, pero no tolerancia cruzada a otros inhibidores de Ahas, ha sido utilizada para el desarrollo de cultivos tolerantes a IMI (Sathasivan et al., 1991; Dietrich, 1998; Lee et al., 1999; Tranel y Wright, 2002). Las mutaciones en Ala₁₂₂ y Ala₂₀₅ también han sido elegidas para el desarrollo de cultivos tolerantes a IMI (Bright et al., 1992; Tranel y Wright, 2002; White et al., 2003). Las mutaciones en Pro₁₉₇ están asociadas con la resistencia sólo a los herbicidas SU, con la excepción de Leu, que también provoca la resistencia a IMI (Powles y Yu, 2010).

Figura 1. Comparación de secuencias de aminoácidos de Ahas1 entre diferentes
especies. Los sitios en negro indican las mutaciones reportadas que causarían
resistencia a herbicidas inhibidores de Ahas. Los aminoácidos en rojo indican la
mutación encontrada en Lupinus albus y otras leguminosas (Gly₆₅₄ → Asn).
Accesiones Genbank: Arabidopsis thaliana (NP_190425.1); Phaseolus vulgaris
ACV84152.1; Setaria viridis (AGU13757.1); Glycine max (AGL09062.1) Medicago
truncatula (AES73057).
Figure 1 . Comparison of Ahas1 amino acid sequences between different species.
The sites in black indicate the reported mutations cause resistance to Ahas
inhibiting herbicides. Amino acids in red indicate the mutation found in Lupinus
albus and other legumes (Gly₆₅₄ → Asn). Genbank accessions: Arabidopsis
thaliana (NP_190425.1); Phaseolus vulgaris ACV84152.1; Setaria viridis
(AGU13757.1); Glycine max (AGL09062.1) Medicago truncatula (AES73057).

Mutaciones en la posición Asp₃₇₆→ Glu y Trp₅₇₄→ Leu, Arg confieren resistencia a todas las clases de inhibidores de Ahas en diferentes grados, mientras que una sustitución en Arg₃₇₇→ His conferiría la resistencia a SU, SCT (sulfonilaminocarboniltriazolinonas) y TP (triazolopyrimidinas) (Massa et al., 2011). La mutación en la Trp₅₇₄ provoca tolerancia cruzada a diferentes familias de herbicidas que inhiben Ahas y ha sido utilizado para el desarrollo de cultivos tolerantes a IMI (Bernasconi et al., 1995; Tranel y Wright, 2002). La mayoría de cultivos comercializados como tolerantes a IMI han sido desarrollados ya sea por una mutación puntual o una combinación de Ala₂₀₅, Trp₅₇₄ y Ser₆₅₃ (Bernasconi et al., 1995; Dietrich, 1998; Croughan, 2002; Tan et al., 2005).

El análisis a nivel de aminoácidos de Lupinus albus presenta una mutación en el aminoácido Gly₆₅₄→ Asn (Figura 1). Una mutación en el aminoácido Gly₆₅₄ → Asp ha sido reportado como un sitio que confiere resistencia a IMI en Setaria viridis L. (Poaceae) (Laplante et al., 2009). Sin embargo, AHAS de Lupinus albus al comparar con AHAS1 de otras leguminosas como: Medicago truncatula L., Glycine max, Phaseolus vulgaris, se observa que estas especies también presentan la mutación Gly₆₅₄→ Asn, lo que parece ser una característica propia de varias leguminosas. De hecho, para determinadas zonas de EEUU, el herbicida Imazethapyr (IMI) (Pursuit-FASF) (Ihibidor de AHAS), es comercializado para su uso pre y post-emergente, en alfalfa, trébol y varias leguminosas comestibles incluyendo maní, frejol, arveja y soya.

Para Lupinus albus, desde la decada del 90, hay datos promisorios para el uso de imazethapyr (IMI) como herbicida selectivo postemergencia (Yates, 1993). Sin embargo, como demuestran Pooran et al. (2013) en Cicer arietinum, el nivel de resistencia a imazethapyr dentro de la misma especie puede presenter gran variabilidad. Descrita la secuencia del gen Ahas, se pueden aplicar estrategias moleculares como el EcoTILLING, que usa las técnicas del TILLING para identificar mutaciones naturales en plantas individuales dentro de un banco de germoplasma o poblaciones naturales (Comai et al., 2004; Nieto et al., 2007).

Análisis del gen psbA

El set de partidores amplificaron la región codificante (CDS) completa del gen psbA (1062pb) de Lupinus albus, esta región mostró 99% de identidad con el gen psbA de Lupinus luteus (GenBank: KC695666.1) (Martin et al., 2014), y 97% con los genes psbA de otras leguminosas como: Lens culinaris Medik. (KF201590.1), Glycyrrhiza glabra L. (KF186232.1) y Vicia faba L (KF042344.1).

En el análisis a nivel de aminoácidos, psbA está codificando la proteína D1 que tiene 353 aa. La proteína D1 de Lupinus albus mostró 99% de identidad con D1 de Lupinus luteus (YP_008963581.1); Phaseolus vulgaris (YP_001122788.2), Glycine max (YP_538745.1); Lotus japonicus L. (NP_084778.1) y Cicer arietinum (YP_002149715.1). Se observa que el gen psbA está altamente conservado entre las leguminosas, presentado la misma longitud y alta similitud entre las secuencias. De hecho, se conoce que la mayoría de las angiospermas fotosintéticas tienen una organización, estructura y contenido génico del cloroplasto altamente conservado (Clegg et al., 1994; Timmis et al., 2004; Landau, 2008; Jansen y Ruhlman, 2012).

Por lo tanto, estos resultados sugieren que el gen amplificado corresponde al gen psbA de Lupinus albus. El alineamiento entre las secuencias codificantes de psbA de Lupinus albus y Lupinus luteus revelan una mutación de un nucleótido, C₁₀₃₇ → T que está modificando el aminoácido Ala₃₄₆→ Val en la proteína D1(Figura 2).

Figura 2. Comparación de secuencias de aminoácidos de la Proteína D1 entre
diferentes especies. Los sitios en negro indican las mutaciones que causarían
resistencia a herbicidas inhibidores de PSII. Accesiones Genbank: Arabidopsis
thaliana: (NP_051039.1); Medicago truncatula: (AGV52623.1); Phaseolus vulgaris:
(Q01366.2); Lupinus luteus: (YP_008963581.1); Medicago sativa (P04998.1);
Glycine max: (YP_538745.1).
Figure 2. Comparison of amino acid sequences of the D1 protein from different
species. The sites in black indicate the mutations cause resistance to PSII
inhibiting herbicides. Genbank accessions: Arabidopsis thaliana: (NP_051039.1);
Medicago truncatula: (AGV52623.1); Phaseolus vulgaris: (Q01366.2); Lupinus luteus:
(YP_008963581.1); Medicago sativa (P04998.1); Glycine max: (YP_538745.1).

Una de las características más relevantes de la resistencia a la triazina (inhibidor del PSII), es que una mutación única estaría controlando el mecanismo de resistencia. Esta mutación puntual se encuentra en el gen psbA cloroplastídico de herencia materna y provoca una sustitución de aminoácidos Ser₂₆₄→ Gly en el sitio de unión de la PQ (Goloubinoff et al., 1984; Hirschberg y McIntosh., 1983). Con algunas excepciones, prácticamente todas las especies de malezas resistentes a triazina tienen esta mutación (Powles y Yu, 2010). Sin embargo, los herbicidas PSII no triazinas tienen una actividad normal debido a que tienen una distinta unión química, es decir los herbicidas no triazinas a pesar de ser inhibidores del PSII, actuarían normalmente en plantas resistentes a las triazinas. Por lo tanto, la resistencia a los herbicidas PSII no triazinas requieren de diferentes mutaciones, y de hecho cinco de estas mutaciones se han reportado en algunas malezas. En Portulaca oleracea L. seleccionada por resistencia a herbicidas inhibidores del PII como triazina y urea, muestran una mutación Ser₂₆₄ → Thr en la proteína D1 que confiere resistencia a ambos herbicidas (Masabni y Zandstra, 1999). Una mutación puntual Val₂₁₉→ Ile en dos malezas, Kochia scoparia L. y Poa annua L. provoca resistencia a metribuzina (triazinona) y diuron (urea) (Mengistu et al., 2000; Mengistu et al., 2005). La mutación Asn₂₆₆→ Thr en la maleza Senecio vulgaris L. provoca resistencia a bromoxynil y terbacil (Park y Mallory-Smith, 2006). La mutación Ala₂₅₁→ Val en Chenopodium álbum L. provoca resistencia a metamitron (metamitrona) (Mechant et al., 2008) y finalmente la mutación Phe₂₅₅ → Ile en la maleza Capsella bursa-pastoris L. provoca resistencia a triazinonas (Perez-Jones et al., 2009).

La región amplificada del gen psbA de Lupinus albus está conteniendo todos los sitios cuya mutación potencial es asociada con la resistencia a herbicidas. Por lo tanto, esta región contendría importante información del control genético de la resistencia a herbicidas que inhiben el PSII.

CONCLUSIONES

Se logró aislar y amplificar una región parcial del gen Ahas y la región codificante completa del gen psbA de L. albus, los cuales están conteniendo todos los sitios descritos hasta ahora cuya variación nucleotídica comúnmente se asocia a la resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS y PII respectivamente.

La información generada para esta especie permite complementar a futuro estrategias de mejoramiento convencional con herramientas moleculares como la genética reversa.

Se confirma la existencia de una mutación en un sitio previamente reportado como causante de la resistencia a imazethapyr (Gly₆₅₄→ Asn) y está conservado en varias leguminosas.

Agradecimientos.

Agradecemos especialmente a Judith Carrasco P., y al personal del Laboratorio de Biotecnología Silvoagrícola por la asistencia técnica.

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Received 02.10.2014
Accepted 14.04.2015

* Corresponding author: Santiago Vásquez, Ricardo Riegel
E-mail address: rriegel@uach.cl