ARTICULOS ORIGINALES

Efecto de la naltrexona sobre el perfil de secreción de hormona luteinizante en ovejas prepúberes^*

Secretion of LH is inhibited by opioid peptides during the prepubertal period in ewe lambs. The chronic blockade of opioid receptors with a long acting opioid receptor antagonist might accelerate the increase of LH secretion observed before the initiation of puberty. The objective of the present study was to explore the effect of naltrexone –a long acting opioid receptor antagonist– on the 24 h pattern of LH secretion and on the pulsatile LH secretion after 3 days of treatment. Ewe lambs (4 months old, 21 ± 1 kg, n=5) were given 1.5 mg naltrexone/kg body weight every 12 h for 3 days with a total of 7 doses. Pattern of LH secretion was assessed in plasma samples obtained at hourly intervals for 24 h which were analyzed with the COSINOR program; and with plasma samples obtained at 15 min intervals for six hours, which were analyzed with the PULSAR program before naltrexone treatment and before the treatment ended. Naltrexone did not modify the 24 h rhythm of LH secretion. On the other hand, the LH pulse frequency diminished from 7.8 ± 0.5 to 4.8 ± 0.4 pulses/6 h (p < 0.05). The mean pulse amplitude decreased from 0.83 ± 0.1 to 0.44 ± 0.07 (p < 0.05). Results suggest that naltrexone may be acting as an opioid agonist instead of antagonist in immature ewes.

 Palabras claves: borregas, naltrexona, hormona luteinizante.
 
Key words: ewe lambs, naltrexone, luteinizing hormone.

* Proyecto DIUC 92.24.23-1 de la Universidad de Concepción

INTRODUCCION

En varias especies animales, durante la transición del período infantil al puberal, se ha observado un aumento en la frecuencia de pulsos de hormona luteinizante (LH), el cual sería resultado de una mayor secreción pulsátil de la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH). El aumento en la frecuencia de pulsos de GnRH podría ser consecuencia de una disminución en la inhibición que ejercen los péptidos opioides sobre la secreción de esta neurohormona hipotalámica (Wilkinson y Landymore, 1989). La existencia de un tono opioide inhibidor de la secreción de LH se ha demostrado en la oveja prepúber (Recabarren y col., 1989), y tanto directa (Goodman y col., 1995) como indirectamente se ha demostrado que el bloqueo de receptores opioides aumenta la secreción de GnRH en ovejas (Recabarren y col., 1991) .

En la rata, el bloqueo crónico de receptores opioides con naloxona durante el período neonatal adelantó la pubertad (Sirinathsinghji y col., 1985), lo cual sugiere que al antagonizarse la inhibición ejercida por los péptidos opioides sobre la secreción de GnRH, se desencadenaría tempranamente el aumento en la secreción pulsátil de GnRH y por consiguiente la pubertad. En la oveja no se ha estudiado si el bloqueo crónico de los receptores opioides con naloxona podría desencadenar en forma precoz el aumento tónico de la secreción de LH conducente a la primera ovulación. Sin embargo, como la vida media de la naloxona es de pocos minutos, un estudio de este tipo requeriría una infusión constante o bien la administración repetida a intervalos horarios. Un método alternativo sería el uso de antagonistas de receptores de opioides de larga duración. La naltrexona es un antagonista de receptores opioides de larga duración, con una vida media de 10 horas (Vereby y col., 1976) y cuyo efecto antagonista sobre los efectos inhibitorios ejercidos por el agonista opioide morfina en la secreción de LH puede persistir hasta por 24 horas (Van Vugt y col., 1989). Por lo tanto, la administración de naltrexona cada 12 horas por 3 días sería suficiente para mantener bloqueados los receptores de opioides e influir en la secreción de LH en la oveja.

El presente estudio tuvo como objetivo estudiar el efecto de la administración de naltrexona sobre la secreción pulsátil de LH y sobre el patrón de secreción de 24 horas en ovejas prepúberes. El bloqueo crónico de receptores opioides podría estimular un cambio en la secreción de LH en una etapa del desarrollo del animal en la cual hay baja secreción de LH y de esa forma acelerarse los eventos endocrinos que anteceden a la pubertad.

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron 5 ovejas de raza Suffolk de 4 meses de edad, nacidas en septiembre, y destetadas a los tres meses de edad, provenientes de la Unidad de Producción Ovina de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Concepción, con un peso promedio de 21 ± 1 kg. Previo al experimento, las borregas se mantuvieron durante el día en pradera mejorada, y suplementadas con heno al estabularlas en la noche. El agua se proveyó a libre disposición. El día anterior al experimento, las ovejas se trasladaron al laboratorio y se colocaron en bretes individuales con acceso a heno y agua. Ese mismo día las ovejas recibieron un catéter de Silastic en la vena yugular bajo anestesia local con lidocaína al 2%. Los catéteres se lavaron diariamente y se mantuvieron con suero salino heparizado (1.000 UI/mL) para evitar la formación de coágulos.

El experimento consistió en la administración endovenosa de 1.5 mg/kg P.V. de naltrexona cada 12 horas, con un total de siete dosificaciones. La primera dosis se inyectó a las 8:00 h del día l, y la última a las 8:00 h del día 4. Se obtuvieron muestras de sangre de 1.5 mL cada hora y durante 24 h a partir de las 18:00 h dos días antes del tratamiento con naltrexona para conocer las concentraciones plasmáticas basales de LH en 24 horas. Además, se obtuvieron muestras de sangre cada 15 min desde las 8:00 y hasta las 14:00 h para determinar las características basales de la secreción pulsátil de LH antes del tratamiento con naltrexona. Este mismo procedimiento se repitió a partir de las 18:00 h en el día 3 de tratamiento para determinar el efecto de largo plazo sobre el patrón de secreción de 24 h y desde las 8:00 hasta las 14:00 h del día 4 para conocer las características de la secreción pulsátil de LH. Este período de muestreo se inició en el momento que se inyectó la última dosis de naltrexona. Las muestras obtenidas cada hora durante la noche se obtuvieron bajo luz roja proveniente de una ampolleta de 20 W colocada a l m sobre la cabeza de los animales.

Las muestras de sangre se recibieron en tubos heparinizados, se centrifugaron y el plasma se separó, conservándose congelado hasta la posterior medición de LH. La medición de LH plasmática se realizó por radioinmunoensayo en duplicados de 100 µL de acuerdo al método descrito anteriormente (Recabarren y col., 1989). El coeficiente intra- e interensayo fue de 6.4 y 13.1% respectivamente, con un nivel de detectabilidad de 0.1 ng/mL.

Las concentraciones plasmáticas de LH de las muestras de sangre obtenidas cada hora, de cada oveja, antes y durante la última fase de la administración de naltrexona, se analizaron con un programa computacional llamado COSINOR, creado por el Dr. Marek Vockac, de la Universidad de Oslo (Vockac, 1984). Este programa calcula la mejor curva coseno para un período dado y la probabilidad de que esta curva coseno sea diferente de una línea recta. El programa además calcula el mesor: promedio de la variable V en un período dado; la acrofase: el tiempo cuando la función alcanza su máximo, medido en horas; la amplitud: diferencia entre el valor de V al tiempo de la acrofase y el mesor (Vockac, 1984). Este análisis se utiliza para reconocer la presencia de ritmos circadianos (Serón-Ferré y col., 1993).

Las características de la secreción pulsátil de LH en el período de 6 horas, antes y al final del tratamiento con naltrexona, se reconocieron mediante el programa PULSAR (Merriam y Wachter, 1982), modificado para computador PC por James F. Gitzen y Víctor D. Ramírez (University of Illinois, USA). Este programa calcula el promedio de la concentración de una hormona por período de tiempo estudiado (NPT), identifica las elevaciones significativas de la hormona en la serie de datos y que se conocen como pulsos, determina el número de pulsos en el período estudiado y además calcula la amplitud promedio de los pulsos.

El mesor y la amplitud antes y durante el tratamiento con naltrexona, así como el nivel promedio total, amplitud promedio y frecuencia de pulsos antes y durante la naltrexona, se compararon con el test de Student. Se consideró un p < 0.05 como estadísticamente significativo. Los datos se entregan como promedio ± error estándar de la media (E.E.M.).

 

RESULTADOS

El cuadro 1 muestra un resumen de los resultados obtenidos con el análisis de las concentraciones plasmáticas de LH en 24 horas con el programa COSINOR. No se encontraron diferencias entre la amplitud, el mesor y la acrofase de las concentraciones de LH como consecuencia del tratamiento con naltrexona. Sin embargo, las acrofases tendieron a presentarse más sincronizadas en las primeras horas de la noche y por su parte, la oveja 3, luego de 3 días de tratamiento, mostró un ritmo circadiano de LH.

En la figura 1 se entregan los perfiles individuales de las concentraciones plasmáticas de LH durante seis horas antes del tratamiento con naltrexona y durante la fase final del tratamiento. En el cuadro 2 se muestran las características de la secreción pulsátil de LH en cada oveja analizadas con el programa PULSAR. El número de pulsos promedio de LH antes del tratamiento con naltrexona fue mayor que durante la fase final: 7.8 ± 0.5 y 4.8 ± 0.4 pulsos/6 h, respectivamente (p < 0.05). La amplitud de los pulsos fue mayor antes del tratamiento con naltrexona que durante la fase final: 0.83 ± 0.1 y 0.44 ± 0.07 ng/mL, respectivamente (p < 0.05). El nivel promedio de LH durante las seis horas de muestreo antes y durante la administración de naltrexona no se diferencia entre sí: 0.95 ± 0.2 y 0.8 ± 0.14 ng/mL/6 h, respectivamente.

DISCUSION

La secreción de LH estaría modulada por opioides en la oveja prepúber (Ebling y col., 1989; Recabarren y col., 1989). De acuerdo a ello, como consecuencia lógica, se podría esperar que la administración repetida de un antagonista de receptores opioides debería conducir a una mayor secreción de LH, similar al aumento de la secreción de LH que antecede a la pubertad. Este razonamiento ha sido comprobado en otras especies animales. En ratas (Sirinathsinghji y col., 1985) y hamsters (Donham y col., 1986), la administración repetida de naloxona adelantó el inicio de la pubertad. El uso de antagonistas de receptores de opioides que se mantienen ligados al receptor por más tiempo como la naltrexona sería un método más adecuado que la administración de naloxona. Así, por ejemplo, Wildt y Leyendecker (1987) consiguieron maduración folicular, ovulación y formación de cuerpo lúteo en mujeres con amenorrea hipotalámica secundaria tratadas con naltrexona (50 mg/kg). Sin embargo, los resultados del presente experimento muestran que la naltrexona no estimuló un aumento sostenido en las concentraciones plasmáticas de LH como se esperaba. Por el contrario, las concentraciones promedio de LH durante las últimas 24 horas del tratamiento con naltrexona no se diferencian de aquellas presentes antes del tratamiento. Por otro lado, la frecuencia de pulsos de LH así como la amplitud promedio de los pulsos de LH disminuyeron con el tratamiento con naltrexona. Estos resultados no esperados podrían deberse a los efectos antagónicos que presentaría la naltrexona de acuerdo a la dosis. En ratas, la administración de 50 mg/kg por día, desde el día l al día 21 de edad, aumentó el peso corporal, el peso del cerebro y otros órganos, mientras que dosis de l mg/kg tuvieron el efecto opuesto (Zagon y McLaughlin, 1983, 1984).

En otro estudio en ratas, la administración de naltrexona (50 mg/día) no adelantó el inicio de la pubertad (Landymore y Wilkinson, 1988). Es posible, entonces, que la ocupación prolongada de los receptores de opioides se transforme en inefectiva a pesar de un aumento inicial de la secreción de LH (Gabriel y Simpkins, 1983). Estos resultados en animales de experimentación y los del presente estudio sugieren que de acuerdo a la dosis y a la duración del tratamiento, la naltrexona podría actuar como agonista de receptores opioides. Mauras y col. (1986) observaron que en niños prepúberes tratados crónicamente con naltrexona (50 mg cada 2 días por 4 semanas) hubo una disminución en la frecuencia de pulsos y en la concentración de LH. En contraste, niños púberes exhibieron un aumento en la frecuencia de pulsos de LH. Ellos atribuyeron este fenómeno a que la naltrexona estaría actuando en los niños prepúberes como un agonista opioide. Si se toman curvas de peso y crecimiento de ovejas y humanos, la edad y peso de las ovejas de nuestro estudio corresponderían a niñas de 8 años (Foster, 1988). Por lo tanto, es posible que la respuesta al tratamiento con naltrexona sea similar en humanos como en ovejas durante el período prepuberal. No obstante, es posible que, en ovejas más avanzadas en su desarrollo y con un tratamiento más prolongado, la naltrexona podría elevar las concentraciones de LH e inducir ovulación precoz.

Figura 1. Perfiles de las concentraciones plasmáticas de LH en ovejas prepúberes antes (lado izquierdo) y durante la administración de naltrexona (lado derecho). Las muestras de plasma se obtuvieron cada 15 minutos por seis horas. Las características de la secreción pulsátil se entregan en el cuadro 2.
Plasma LH concentrations before (left side) and during naltrexone administration (right side) in ewe lambs. Blood samples were obtained at 15-min intervals for 6 hours. Summary of LH pulsatile secretion is given in table 2.
 

Además de la posibilidad de que la naltrexona actúe como un agonista opioide, no se puede descartar el hecho de que la naltrexona haya aumentado la secreción de la hormona estimulante de la corteza adrenal (ACTH), tal como se ha demostrado en monas (Teoh y col., 1988). La activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal tiene efectos inhibitorios sobre la secreción de LH (Rivier y Rivest, 1991). De tal forma que la reducción en la secreción pulsátil de LH podría en parte ser consecuencia de las acciones inhibitorias que ejercen los esteroides adrenales.

En relación al patrón de secreción de LH en 24 horas, la naltrexona tendió a sincronizar las acrofases en un período de 4 horas (19:00 a 23:00 horas), mientras que las acrofases exhibidas antes del tratamiento se distribuyeron a lo largo del día. Más aún, las concentraciones de LH en 24 horas en una oveja (oveja n° 3) siguen un patrón oscilatorio que se podría definir como ritmo circadiano. En ovejas prepúberes no se ha estudiado la presencia de un ritmo circadiano de actividad opioide sobre la secreción de LH. El hecho de que la naltrexona tendió a sincronizar la secreción de LH sugiere que la oveja prepúber podría presentar un ritmo circadiano de inhibición opioide sobre la secreción de LH. En resumen, la administración de naltrexona por tres días disminuyó la frecuencia y la amplitud de pulsos de LH en ovejas prepúberes. Sin embargo, el tratamiento tendió a sincronizar la secreción de LH de 24 h. Otras dosis y duraciones del tratamiento con naltrexona permitirán reconocer el uso potencial de esta droga en el inicio precoz de la secreción puberal de LH en ovejas.

RESUMEN

La secreción de LH está inhibida por péptidos opioides durante el período prepuberal en la oveja. El bloqueo crónico de los receptores opioides con un antagonista de larga duración podría acelerar el aumento en la secreción de LH que se ha observado previo a la pubertad en la oveja. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la administración de naltrexona, un antagonista de receptores opioides de larga duración, sobre el patrón de secreción de LH en 24 h y sobre las características de la secreción pulsátil de LH previo y al final del tratamiento. Borregas Suffolk (4 meses de edad, 21 ± 1 kg, n=5) recibieron 1.5 mg naltrexona/kg P.V. cada 12 h por 3 días con un total de 7 dosis. El patrón de secreción de LH en 24 h antes y al final de la administración de naltrexona fue caracterizado con el uso de un programa computacional llamado COSINOR, y las características de la secreción pulsátil con el programa computacional PULSAR. La naltrexona no modificó el ritmo de secreción de LH en 24 h. La frecuencia de pulsos de LH disminuyó de 7.8 ± 0.5 a 4.8 ± 0.4 pulsos/6 h (p < 0.05). La amplitud promedio de los pulsos disminuyó de 0.83 ± 0.11 a 0.44 ± 0.07 ng/mL (p < 0.05). Los resultados sugieren que la naltrexona podría estar actuando como un agonista opioide reduciendo la secreción pulsátil de LH.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Prof. Dr. Ludwig Wildt (Universidad de Erlangen, Alemania) por el generoso aporte de naltrexona y a la Dra. Marcela Vergara (Lab. de Endocrinología, P. Universidad Católica de Chile) por el uso del programa COSINOR.

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 Aceptado: 15.07.96