Arch. Med. Vet. XXIX, Nº 1, 1997
DOI: 10.4067/S0301-732X1997000100019

COMUNICACIONES

Effect of a surfactant on the integrity of frozen ram spermatozoa

In order to test the effect of the addition of the commercial surfactant Equex STM to TRIS and Na-Citrate extenders on the survival of ram semen, four trials using factorial designs were conducted freezing separate ejaculates collected from 2 Austral and l Border Leicester rams. Common for all trials was a monophasic dilution at room temperature, with 20% egg-yolk containing extenders split in fractions with 0.5% and without surfactant, packing of extended semen in 0.25 Minitüb-straws, an adaptation period at 5°C for 3-4 h, a freezing rate of about 5°C/min performed 10 cm above level of liquid nitrogen, and thawing of straws for 15 seconds in a 40°C water bath. Quality criteria for thawed semen were motility index (MI) and normal intact acrosomes (NA). With the use of STATGRAF 5.1, results were submitted to ANOVA and Duncan test, complemented with "t"-test (TWOSAM), assuming P < 0.05.
In the 1st trial, the comparison of TRIS-extender (T) vs. 2.9% Na-Citrate extender (C), MI was significantly lower in C-extenders, specially in C-extender without surfactant, which caused high rates of bent tails indicating osmotic damage. This was not observed in C with surfactant nor in T- fractions. The effect of surfactant on NA was significant with both extenders. In the 2nd trial, Citrate extender was comparatively modified, adding 0.3% (w/v) Sulphanilamide to increase osmolarity and pH. The results were basically the same as in the 1st trial: addition of surfactant gave significantly higher NA-rates in TRIS and Citrate extenders and significantly higher MI in both Citrate-extenders. In the 3rd trial, designed to compare two concentrations of Na-Citrate (2.9% vs. 3.1% w/v), and to compare a fast vs. a slow dilution, no differences between extenders nor between fast and slow dilution were found. Again, the effect of the surfactant on NA and MI was significant. In the 4th trial, conducted mainly to compare fast and slow dilution with TRIS extender, no difference was found. Again there was a significant effect of the surfactant on NA. There was no interaction between tested variables. It was concluded that Na-Citrate extenders without surfactant are deleterious to ram spermatozoa, as was evident by bent tails immediately after dilution. The addition of surfactant to TRIS extender yielded about 60% more intact spermatozoa after freezing. This would make it possible to reduce spermatozoa concentration per frozen straw in order to obtain a better sperm survival.

Palabras claves: semen, ovino, congelación, crioprotección, surfactante.

Key words: semen freezing, ram, cryopreservation, surfactant.

INTRODUCCION

En la especie ovina, la baja fertilidad del semen crioconservado es atribuida a cambios ultraestructurales, bioquímicos y funcionales que sufre una proporción significativa de las células espermáticas y que conducen a un transporte insuficiente y pérdida de viabilidad de los espermatozoides en el tracto genital (Salamon y Maxwell, 1995a, 1995b). Los cambios ultraestructurales afectan principalmente a las membranas, debido a reordenación de los lípidos membranosos durante la congelación-descongelación, alterando las asociaciones lípido-lípido y lípido-proteínas, necesarias para una función normal de las membranas (Parks y Graham, 1992). Se ha constatado que el daño por la congelación es más severo en espermatozoides ovinos que en espermatozoides bovinos, particularmente sobre la integridad de su borde apical, área que es más sensible que el segmento postacrosomal y de la pieza intermedia. Por ello, la motilidad espermática de los espermatozoides ovinos crioconservados es habitualmente mayor que la integridad morfológica de sus acrosomas (Salamon y Maxwell, 1995b).

Graham y col. (1971) utilizaron sustancias tenso activas en ensayos de criopreservación de semen porcino. Entre 78 compuestos ensayados, la adición al diluyente de un detergente comercial (Orvus Es Paste OEP1) demostró tener un efecto favorable sobre la integridad de los acrosomas en presencia de yema de huevo. El compuesto comercial utilizado fue descrito como un tensido constituido por una mezcla de Na- y trietanolamino-laurilsulfato (STLS). De acuerdo con esa definición, contiene tanto una sal sódica anionactiva (dodecilo hidrógeno-sulfato, sal sódica), como también una sal de etanolamonio (no ionogénica) del laurilsulfato (Habermehl, 1987).

El efecto favorable del tensido nombrado sobre la integridad de las membranas de espermatozoides porcinos fue corroborado por Graham y Crabo (1972) y Pursel y col. (1978), quienes observaron que su efecto sobre la motilidad espermática e integridad de acrosomas se relacionaba con la concentración de yema de huevo en el diluyente de congelación. El mismo surfactante se ha ensayado también en semen de otras especies, como conejo (Hellemann, 1976; Weitze, 1977), equino (Martin y col, 1978), caprino (Velasco, 1985; Strohmeyer, 1988; Hellemann y col., 1992), bovino (Arriola y Foote, 1987; Foote y Arriola, 1987) y ovino (Tekin, 1982; Sánchez y Hellemann, 1993).

El objetivo del presente trabajo fue determinar en semen ovino el efecto crioprotector del detergente Equex STM®, agregado comparativamente a diluyentes tris y citrato de Na.

MATERIAL Y METODOS

 Se colectó semen de dos carneros de raza Austral de 2 años y un carnero Border Leicester de 8 años de edad. Los eyaculados obtenidos mediante vagina artificial se sometieron a una estimación de porcentaje de motilidad por microscopía de contraste de fases (x200) sobre platina temperada (38° a 40°C), descartando del ulterior procesamiento el semen con menos de 70% de células con movimiento progresivo. La concentración espermática se midió con contador de partículas.

Se realizaron cuatro ensayos. Fue común para ellos el procesamiento individual de los eyaculados, la determinación de la concentración espermática por dosis a un total de 150 millones de células espermáticas totales. Todos los diluyentes utilizados tuvieron un contenido final de 20% de yema de huevo. La concentración de glicerina fue de 6.4% (v/v) en los diluyentes tris (Steinbach y Foote, 1966) y de 7% (v/v) en los de citrato de Na (Salisbury y VanDemark, 1961). La dilución de todas las fracciones se realizó en forma monofásica, con los diluyentes glicerinados a temperatura de laboratorio (18° a 22°C). Las fracciones diluidas se envasaron en pajuelas Minitüb® de 0.25 ml, las cuales se colocaron dentro de tubos de aluminio, sometiéndolas a un período de adaptación a +5°C por 3 a 4 h antes de su congelación. La congelación misma se realizó a 10 cm sobre el nivel de nitrógeno líquido (N2L), por 15 min., en una caja de poliestireno expandido, logrando una curva de congelación de aproximadamente 5°C/min, tras lo cual el semen se sumergió en N2L y almacenó por al menos una semana.

Se evaluó el efecto de los diferentes tratamientos en el semen descongelado mediante microscopía de contraste de fases (x200), por la estimación del porcentaje de motilidad progresiva (MOT) y de la intensidad del movimiento (I) en una escala ascendente de 1 a 5. Ambos parámetros se transformaron a un índice de motilidad (IM), de acuerdo a la fórmula: IM = MOT (I x 20) / 100. Como segundo criterio de evaluación se utilizó el porcentaje de células espermáticas que mantuvieron la integridad del borde apical de sus acrosomas (AN), observadas con microscopio de contraste de fases (x 1000) en semen fijado con una solución de citrato de Na al 2.9% adicionada con 2% de formalina comercial al 40%.

En filas: a¹b (p£ 0.05).
En columnas: c¹d (p£0.05).

El diseño que se siguió en los cuatro ensayos fue el siguiente:

    1er. ensayo. Se fraccionaron 29 eyaculados, que, siguiendo un diseño factorial 2 x 2, se diluyeron paralelamente en diluyentes tris (Solución madre: tris-[hidroximetil]aminometano 3.29% p/v, ác. cítrico 1.85% p/v, fructosa 1.36% p/v, 335 mOsm, pH 6.8) y diluyentes citrato de Na (Solución madre: citrato de Na 2H2O 2.9% p/v, ácido cítrico. H2O 0.03% p/v, 270 mOsm, pH 6.7), sin y con 0.5% (v/v) Equex STM®2. La dilución se realizó en forma rápida, incorporando a las fracciones de semen la totalidad del respectivo diluyente en aproximadamente 3 segundos.

    2º ensayo. Se fraccionaron 10 eyaculados de acuerdo a un diseño factorial 3 x 2, utilizando, como en el primer ensayo, los diluyentes tris y citrato de Na, pero agregando como tercer diluyente una variante del diluyente de citrato de Na con sulfanilamida (citrato de Na 2H2O 2.9% p/v, ácido cítrico H2O 0.03% p/v, sulfanilamida 0.3% p/v, 280 mOsm, pH 7.6) descrito por Eibl (1978). Los tres diluyentes se utilizaron sin y con 0.5% v/v de surfactante, respectivamente, y, a semejanza del primer ensayo, se incorporaron en aproximadamente 3 segundos a las fracciones de semen.

    3er. ensayo. Se fraccionaron 12 eyaculados que se diluyeron respectivamente en diluyente citrato de Na (2.9%) con sulfanilamida y una variante del mismo diluyente con 3.1% de citrato de Na (citrato de Na 2H2O 3.1% p/v, ácido cítrico H2O 0.03% p/v, sulfanilamida 0.3% p/v, 335 mOsm, pH 7.6). De acuerdo a un diseño factorial 2x2x2, ambas formulaciones de diluyentes se utilizaron sin y con surfactante (0.5% v/v), sometiendo a todas las fracciones a una dilución rápida por un tiempo aproximado de 3 segundos y dilución lenta, respectivamente, la cual se extendió por períodos de 5 a 10 min.

    4º ensayo. Se fraccionaron 10 eyaculados, que, conforme a un diseño factorial 2x2, se procesaron en diluyente tris (utilizado en los ensayos 1 y 2), sin y con 0.5% v/v surfactante, comparando una dilución rápida con una lenta, de acuerdo a lo descrito en el ensayo anterior. Se sometió el efecto de los tratamientos sobre IM y AN a análisis de varianza y test de Duncan, complementado con test de "t" (TWOSAM), asumiendo Ho con p­0.05. Se utilizó el paquete estadístico STATGRAF 5.1.

RESULTADOS

Los parámetros evaluados de motilidad e integridad de acrosomas en la comparación de los diluyentes tris vs. citrato de Na del 1er. ensayo se presentan en el cuatro 1.

En el cuadro 1 se observa que el índice de motilidad es significativamente inferior en las fracciones diluidas con citrato de Na, y en especial en la de citrato de Na sin surfactante. En 22 de las 29 muestras (75.9%) que constituyeron esta fracción, se registró alta proporción de flagelos espermáticos inflectados, no observados en la fracción con surfactante, ni tampoco en las fracciones procesadas en diluyente tris.

El efecto de las formulaciones de tris vs. citrato de Na no es significativo sobre la integridad de los acrosomas, pero, en cambio, es significativa en ambos diluyentes la diferencia atribuible al surfactante.

Los resultados del 2º ensayo, en el cual se agregó a las dos formulaciones del 1er. ensayo una variante del diluyente citrato de Na con sulfanilamida, están representados en el cuadro  2.

En el cuadro 2 se observa que IM en ambas fracciones con diluyentes citrato de Na sin surfactante es significativamente menor, como consecuencia de numerosas inflexiones de flagelo de las células espermáticas, registradas ya tras la dilución en todas las muestras de dichas fracciones. La alteración no se observó en las fracciones con surfactante. El porcentaje de acrosomas normales es significativamente mayor en las fracciones procesadas en diluyente de citrato de Na con surfactante, tendencia que no fue significativa en el diluyente tris.

Los resultados del 3er. ensayo, destinado a comprobar posibles efectos de la rapidez de dilución, como también de la osmolaridad de diluyentes de citrato de Na, se desprenden del cuadro 3.

En filas: a¹b (p£0.05).
En columnas: c¹d (p£ 0.05).

 

Del cuadro 3 se desprende que IM y AN no difieren por efecto de la concentración del citrato de Na. Las diferencias atribuibles a la velocidad de dilución no son significativas, aun considerando la muestra en su conjunto. En cambio es significativo el efecto del surfactante sobre AN, como también sobre IM al establecer la comparación por bloques. No se observaron interacciones entre las variables computadas (p>0.05).

Los resultados obtenidos en el 4º ensayo, diseñado para comprobar un posible efecto de la velocidad de dilución sobre los parámetros IM y AN, al utilizar diluyente tris se reflejan en el cuadro 4.

Las diferencias atribuibles al efecto del surfactante sobre la integridad de los acrosomas son significativas. No son significativas las diferencias atribuibles a la velocidad de dilución. No se observó interacción (p>0.05) entre las variables computadas. 

DISCUSION

En la comparación de ambas formulaciones, tris vs. citrato de Na (cuadro 1) es destacable, en primer lugar, el efecto protector del surfactante sobre la integridad de los acrosomas, tanto en tris como en citrato de Na. Pero no menos interesante fue el efecto de la presencia o ausencia del surfactante sobre la motilidad de las fracciones procesadas con diluyente citrato de Na. En este diluyente, sin surfactante, se observaron proporciones altas de espermatozoides con flagelos inflectados, como indicación de un shock osmótico. Esta alteración secundaria de los espermatozoides, que probablemente pasó desapercibida y no se registró en los primeros exámenes, se atribuyó inicialmente a una falla del diluyente respectivo. Sin embargo, en el transcurso del ensayo, con nuevas partidas de diluyente sin surfactante, la misma alteración se observó en forma constante, inmediatamente tras la dilución, lo que no se observó en las fracciones adicionadas del surfactante.

Los ensayos 2º y 3º se diseñaron como consecuencia de las alteraciones morfológicas observadas en el ensayo 1º. Aumentada la osmolaridad del diluyente, tanto por la adición de sulfanilamida (ensayo 2º, cuadro 2) como por una mayor concentración de citrato de Na a 3.1% (ensayo 3º, cuadro 3), los resultados fueron similares: de motilidad baja en comparación a las fracciones con surfactante, ligada a las inflexiones de flagelo descritas. La dilución comparativamente lenta, incluida en el ensayo 3º, mostró una tendencia a menores inflexiones flagelares y mejor motilidad, sin que esta última fuera estadísticamente significativa.

En el ensayo 4º (cuadro 4), en que se comparó el efecto de una dilución rápida con una dilución lenta de semen en tris, los valores de AN fueron similares y las diferencias de los valores de IM no fueron significativas. Se corroboró, nuevamente, el efecto protector del surfactante sobre la integridad morfológica de acrosomas y una tendencia a elevar la motilidad, significativa al considerar la muestra en conjunto.

El efecto de algunos surfactantes o tensidos sobre las membranas de las células espermáticas aparece ligado a la constitución del diluyente, particularmente a la presencia de lecitina aportada por la yema de huevo. Mann (1964) ya describe que Na dodecil-sulfato (SDS), componente del tensido por nosotros utilizado, causa la completa inhibición de la fructolisis y abolición de la motilidad del semen ovino en concentraciones de 0.0015 M (0.043% p/v). En semen porcino, Pursel y col. (1978) observaron un efecto protector del OEP al 1-1.5% en diluyente Beltsville F5 (BF5) con 20% de yema de huevo, pero un efecto deletéreo de OEP al 0.1% sobre motilidad e integridad de acrosomas de semen incubado por 1 h en diluyente sin yema de huevo. Tales resultados reforzaron la hipótesis sustentada por Graham y col. (1971), de que OEP ejercería su acción beneficiosa, más bien a través de la alteración de los constituyentes de la yema de huevo que por un efecto directo sobre las membranas celulares.

Los estudios de Quinn y col. (1980) sobre la susceptibilidad de las células espermáticas al shock térmico -atribuido primariamente a ruptura irreversible de las membranas con pérdida de los constituyentes intracelulares- demostraron que el efecto protector de la fosfatidilcolina exógena se debe a una interacción reversible de las estructuras lipídicas con los fosfolípidos de las membranas espermáticas. En sus experimentos con espermatozoides lavados, la protección al shock térmico fue inmediata por la adición 0.5 o 1 mg/ml de fosfatidilcolina, pero la susceptibilidad al shock aumentó después de 3 horas de incubación a 37°C, independientemente de la concentración del fosfolípido. Es más, dichos autores concluyeron que la presencia de concentraciones mayores de fosfolípidos exógenos pueden ser lesivas debido a la transformación del lípido con formación de lisofosfátidos y otros productos de degradación.

El mecanismo bioquímico por el cual el detergente produce la estabilización de la membrana espermática en presencia de la fosfatidilcolina aportada por la yema de huevo no está claramente dilucidado. Menos aún lo está el efecto de dicha estabilización de las membranas. Por una parte podría suponerse que la aparente estabilización de las membranas, apreciable a través del examen microscópico, pudiera deberse a una mayor permeabilización de ellas. Haciéndola más permeable a los solutos, a través de microporos, se evitaría una ruptura mayor, a consecuencia de los desequilibrios osmóticos durante la dilución y congelación/des-congelación de las células. De una mayor permeabilidad de la membrana debiera esperarse también una posible pérdida de los constituyentes intracelulares. Pero, por otra parte, podría suponerse que una estabilización artificial de la estructura membranosa pudiera interferir en la capacidad de reacción acrosomal, necesaria para el proceso de penetración espermática al ovocito. En contra de ambas suposiciones está el hecho de que, desde los ensayos de Graham y col. (1971), OEP viene utilizándose por más de 20 años en la crioconservación de semen porcino y por un período algo menor en crioconservación de semen equino (Martin y col., 1978; Cochran y col., 1984), si bien la fertilidad obtenida en esas especies, aun utilizando cantidades comparativamente altas de células espermáticas por dosis inseminada, no alcanza a la del semen no congelado. En un reciente ensayo de inseminación con semen fresco, aplicado en ovejas el día de la colección, tras utilizar como diluyente tris-yema-glicerina con 0.5% de Equex STM, Martínez (1996)* obtuvo 66.7% de preñez. Con semen bovino, congelado comparativamente en tris, con y sin el mismo tensido, Mercado (1996) obtuvo resultados de penetración espermática de ovocitos in vitro de 75.4% y 73.4%, respectivamente, los que no difieren significativamente entre ellos.

Es probable que el efecto protector del tensido utilizado sobre la integridad espermática en semen ovino no conduzca per se a elevar la fertilidad del semen aplicado por la vía cervical. El mayor obstáculo para una aplicación cervical profunda o una siembra del semen en el lumen uterino lo seguirá constituyendo la estructura del cervix (Kristinson y Wissdorf, 1985; Reinhold y col., 1987; Halbert y col., 1990a). Las técnicas de inseminación transcervical, descritas por Andersen y col. (1973), Halbert y col. (1990b y 1990c), requieren de destrezas especiales, son estresantes y no se logran en todas las hembras, lo cual mantiene limitada su difusión a terreno. En opinión de Salamon y Maxwell (1995b), en la actualidad sólo la inseminación laparoscópica ofrece índices de fertilidad satisfactorios y repetibles, permitiendo una reducción sustancial del número de espermatozoides mótiles inseminados.

Independientemente del destino que se dé al semen ovino crioconservado, estimamos que la adición del tensido al semen procesado en tris permite aumentar en cerca de 60% los espermatozoides aparentemente intactos, en comparación al diluyente sin el aditivo. Una reducción de la gran cantidad de espermatozoides congelados por dosis contribuye a una mejor sobrevivencia de ellos (Sánchez, 1994), por la menor cantidad de células que comparten las fracciones fluidas remanentes durante la cristalización (Amann y Pickett, 1987; Parks y Graham, 1992).

RESUMEN

Con el objetivo de comprobar el efecto de la adición de un tensido comercial (Equex STM® a diluyentes tris y citrato de Na en la sobrevivencia de semen ovino, se realizaron 4 ensayos con diseño factorial de crioconservación de eyaculados de 2 carneros de raza Austral y un carnero Border Leicester, procesados separadamente. Fue común para todos los ensayos la dilución monofásica rápida a temperatura ambiente, en diluyentes con 20% (v/v) de yema de huevo, divididos en fracciones sin y con 0.5% (v/v) de Equex STM, el empaque en minitubos de 0.25 ml, períodos de adaptación a +5°C de 3 a 4 h, la curva de congelación en vapor de nitrógeno a 10 cm sobre la fase líquida de aproximadamente 5°C/min y la posterior descongelación en agua a 40°C por 15 s. Los criterios de evaluación del semen descongelado fueron el índice de motilidad (IM) y la integridad del borde apical de los acrosomas (AN). Los resultados se sometieron a análisis de varianza, test de Duncan y test de "t" (TWOSAM) del paquete STATGRAF 5.1, asumiendo p­0.05%.
La comparación en el 1er. ensayo de los diluyentes tris y citrato de Na al 2.9% mostró diferencias significativas de IM, causadas principalmente por daño osmótico, manifiesto por la inflexión de los flagelos espermáticos en la fracción diluida en citrato de Na sin la adición del tensido. La alteración no se observó en tris. Tanto en tris como en citrato de Na el efecto favorable del tensido sobre la integridad de los acrosomas fue significativo.
En el 2º ensayo, con el cambio comparativo de la formulación del diluyente citrato de Na por la adición de sulfanilamida, que elevó la osmolaridad y el pH, se repitió lo observado en el ensayo anterior: el efecto significativo del tensido sobre AN en tris y citrato de Na como también sobre IM en ambas formulaciones del diluyente citrato de Na.
En el 3er. ensayo, destinado a comparar la sobrevivencia espermática en dos concentraciones del diluyente citrato de Na (2.9% vs. 3.1%), y a comparar un posible efecto deletéreo de la dilución rápida frente a una dilución lenta, no hubo diferencia entre las concentraciones del citrato de Na, como tampoco hubo una diferencia estadísticamente significativa entre ambas velocidades de dilución. El efecto del tensido sobre AN fue nuevamente significativo, como también sobre IM, al considerar las diferentes fracciones en conjunto.
En el 4º ensayo, destinado a probar el efecto de una dilución lenta con diluyente tris, no se apreciaron diferencias frente a la dilución rápida. Nuevamente las fracciones con el tensido mostraron valores de AN significativamente mayores, tendencia que para IM sólo fue significativa al considerar la muestra en conjunto.
De los ensayos se concluyó que diluyentes de citrato de Na sin surfactante son mal tolerados por     espermatozoides ovinos, que presentaron múltiples inflexiones flagelares espermáticas como señal de shock osmótico consecutivo a la dilución. Dicha alteración no se observó con el surfactante. La adición del surfactante al diluyente tris permitió recuperar cerca del 60% más de espermatozoides aparentemente intactos después de la congelación, lo cual permitiría reducir la cantidad de espermatozoides congelados por dosis, factor que, por su parte, también favorece la sobrevivencia espermática del semen ovino crioconservado.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Centro de Inseminación Artificial y a la Unidad Ovina de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, que otorgaron personal de apoyo y permitieron el uso de sus animales e infraestructura; al Dr. B. Mercado por su colaboración durante la realización de los ensayos experimentales.

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1 OEP (Nombre comercial actual "Equex STM"®).

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* Comunicación personal 

Aceptado: 25.11.96