J.F. COX, P. FERNANDEZ, F. SARAVIA, M. BRIONES, A. SANTA MARIA
Depto. Ciencias Pecuarias, Facultad de Medicina Veterinaria,
Universidad de Concepción, Casilla 537, Chillán, Chile.
SUMMARY
Effect of heparin on the in vitro fertilizing ability of
goat spermatozoa as assessed
by heterologous solubilized zona pellucidae
Heparin has been shown to improve the fertilizing ability of goat spermatozoa in a dose-dependent manner. The present study assessed the mechanism involved in the stimulatory effect by using solubilized zona pellucidae from bovines.
Bovine cumulus-oocyte complexes were matured in 199 plus serum and insuline. Thereafter, oocytes were denuded from granulosa cells and used either to obtain zona pellucidae or for fertilization. Free zonae were collected by mechanical means, solubilized in heated acetic acid, liofilized and stored at -20° C until their reconstitution in Talp plus serum.
In Experiment 1, spermatozoa were suspended either in non-capacitated conditions
or in Talp plus heparin and Talp plus heparin and zonae, and incubated for 90
min at 39° C in 5% CO2 in air. In Experiment 2, spermatozoa were grouped
as before and co-incubated with matured oocytes for 18 hr to assess their fertilizing
ability. In Experiment 3, spermatozoa were suspended either in seminal plasma,
Talp plus heparin or Talp without heparin for 90 min. At 0, 45 and 90 min, semen
samples were exposed to solubilized zonae and were further incubated for 30
min. Acrosome disruption in Experiment 1 and 3 was assessed by staining spermatozoa
with PI/PSA. Fertilization in Experiment 2 was verified by the presence of pronuclei
and sperm tail.
The results in Experiment 1 showed that the acrosome disruption rate increased
above the control groups after 90 min of incubation only in zonae-treated spermatozoa
(P<0.001). In Experiment 2, fertilization was seen only when spermatozoa
were previously incubated in conditions known to capacitate them. In Experiment
3, the results showed that the acrosome disruption rate first increased when
spermatozoa were exposed to zonae after 45 min of incubation (P<0.01).
The cumulative results suggest that heparin improves fertilization by stimulating sperm capacitation. The effect is expressed after 45 min of sperm incubation.
Palabras claves: heparina, capacitación espermática, caprinos.
Key words: heparin, sperm capacitation, goats.
INTRODUCCION
La heparina ha demostrado mejorar la capacidad fecundante in vitro de espermatozoides de bovinos (Parrish y col., 1989), ovinos (Cox y col., 1992) y caprinos (Cox y col., 1995). En bovinos, la heparina facilita la capacitación espermática de espermatozoides eyaculados, uniéndose a residuos sulfatos (Miller y Ax, 1989) y probablemente removiendo factores decapacitantes adheridos a la membrana plasmática, tales como proteínas fijadoras de calmodulina (Leclerc y col., 1992; Therien y col., 1995).
Para demostrar el efecto de la heparina en la capacitación espermática en bovinos, Parrish y col., (1989) utilizaron lisofosfatidilcolina, un lípido fusogénico capaz de desencadenar la reacción de acrosoma sólo en espermios capacitados. Más recientemente, Florman y col. (Florman y First, 1988; Florman y col., 1990) utilizaron zonas pelúcidas solubilizadas para evaluar el estado funcional de espermatozoides de bovinos. La solubilización de las zonas pelúcidas permite la liberación a la solución de ZP3, glicoproteína estructural de la zona pelúcida, responsable de la fijación espermática y de la inducción de la reacción de acrosoma a nivel de la zona pelúcida (Wassarman, 1987). Como sólo los espermios capacitados son capaces de ligar ZP3, la adición de zonas pelúcidas solubilizadas a preparaciones espermáticas en asociación con una evaluación de la integridad acrosomal, constituye un modelo útil para la identificación fisiólogica del estado funcional de los espermatozoides.
En caprinos, la heparina aumenta la capacidad fecundante in vitro de
los espermatozoides, siguiendo un patrón dosis-respuesta que se asemeja
para los distintos machos (Cox y col., 1995). En el mismo estudio
se mostró que el efecto en la capacidad fecundante toma un tiempo mínimo
que se aproxima a una hora y que la eficiencia es influida por la actividad
biológica de la heparina. El objetivo del presente trabajo fue precisar
el efecto de la heparina en la función fecundante de los espermatozoides
caprinos.
MATERIAL Y METODOS
Colección y maduración de oocitos. Ovarios de vacas fueron colectados en un matadero local y transportados al laboratorio en PBS a unos 35° C. Los complejos oocito-cúmulus (COC) fueron obtenidos aspirando folículos de 1-5 mm de diámetro con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 10 ml. Una vez lavados en Hepes-199 (Medio 199 con sales Earle y 20 mM de Hepes suplementado con 10% v/v de suero de oveja en estro y 75 µm/ml de kanamicina; pH 7.3), los COC fueron cultivados por 24 h en gotas de 50 µl bajo parafina líquida liviana, a 39° C y 5% de CO2 en aire humedecido. El medio de cultivo de maduración consistió en Medio 199 más 20% v/v de suero de oveja en estro, 2 µg/ml de insulina, 10 mM de Hepes y 75 µg/ml de kanamicina (pH 7.5).
Colección y procesamiento del semen. Semen de 4 chivatos sexualmente maduros fue colectado por vagina artificial, evaluado en función del movimiento progresivo en microscopia de contraste de fase y procesado para capacitación. La preparación espermática para capacitación in vitro fue llevada a cabo de acuerdo a Cox y col. (1994). En resumen, el semen fue lavado en medio Talp sin calcio (Talp-Ca libre) y los espermatozoides fueron recuperados por centrifugación a 300 g por 5 min e incubados a temperatura de laboratorio por 4 h.
Posteriormente, el semen fue lavado una vez más y la concentración espermática fue ajustada a 1.5 x 108 espermatozoides/ml utilizando Talp FIV (Medio Talp, con 10 µg de heparina, 2.7 mM de calcio y 10% v/v de suero caprino en estro tratado térmicamente), e incubado por 60 min a 39° C y 5% de CO2 en aire en una atmósfera humedecida. Luego, la concentración esper-má-tica fue ajustada a 50 x 106 espermatozoi-des/ml en los experimentos basados en la tinción espermática o 1.5 x 106 espermios/ml cuando hubo interacción entre gametos.
Fecundación in vitro. Después de la incubación, los COC fueron lavados 2 veces en Talp-Ca-libre y las células de la granulosa fueron completamente removidas pasando los COC a través de una pipeta fina. Posteriormente, los oocitos maduros fueron distribuidos al azar en las suspensiones espermáticas previamente preparadas. Sólo fueron utilizados oocitos con un cúmulus expandido y citoplasma granular y homogéneo.
Preparación de zonas pelúcidas solubilizadas. Oocitos de bovinos fueron colectados por aspiración de folículos de ovarios provenientes de mataderos, de acuerdo a Cox y col. (1994). Posteriormente fueron desnudados mecánicamente de células de la granulosa utilizando una pipeta Pasteur fina y las zonas pelúcidas fueron colectadas removiendo los oocitos con una pipeta con punta aguzada. Las zonas pelúcidas fueron lavadas y almacenadas a -196° C en medio HBS-PVP (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 0.4% de PVP-40; pH 7.4) con 10% de glicerol. Las zonas pelúcidas fueron solubilizadas resuspendiéndolas en ácido acético diluido (pH 2.5), en una concentración de 1.25 mg de proteína/ml (Florman y First, 1988), e incubándolas a 80° C por 20 min. La solución fue luego liofilizada y almacenada a -20° C hasta su reconstitución en medio Talp Ca-libre.
Tinción espermática. La lectina Pisum sativum (PSA) conjugada con isotiocianato de fluores-ceí-na (FITC; 2.5 moles FITC/mol de PSA) y el yoduro de propidio (PI) fueron preparados en una solución stock de 0.1 y 0.125 mg/ml de PBS respectivamente y almacenados protegidos de la luz a -20° C. Para evaluar la integridad de acrosoma, la concentración espermática fue ajustada a 50 x 106 espermios/ml en una solución de fijación (5 cc de formaldehído/lt solución de citrato de sodio al 2.9%) e incubada por 10 min a 39° C. Posteriormente, los espermatozoides fueron teñidos con 16 ul de PSA y 8 ul de PI en 0.2 ml de la suspensión anterior. La evaluación fue realizada en un microscopio de epifluorescencia Nikon a un aumento de 40X. El PI tiñe a los espermatozoides de color rojo gracias a la permeabilización de membranas llevada a cabo por el formaldehído, mientras que el PSA tiñe a los acrosomas dañados de un color verde amarillento.
Los químicos y plásticos fueron graduados para cultivo de tejidos y obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO, USA).
Experimento 1. Efecto de la heparina en la inducción de reacción de acrosoma. Para evaluar el efecto de la heparina en la reacción de acrosoma, 50 x 106 espermios/ml fueron suspendidos en microtubos Eppendorf de 1.5 ml en las siguientes preparaciones:
Grupo 1: Plasma seminal + 10% v/v de suero de cabra en estro + 2.7 mM
de calcio.
Grupo 2: Plasma seminal + 10% v/v de suero de cabra en estro-calcio.
Grupo 3: Talp FIV-calcio.
Grupo 4: Talp FIV-heparina.
Grupo 5: Talp FIV.
Grupo 6: Talp FIV + 100 ng/ml de zonas pelúcidas solubilizadas.
Los primeros 4 grupos son controles negativos expuestos a condiciones decapacitantes conocidas, mientras que los grupos 5 y 6 son los grupos en evaluación. Posteriormente los espermatozoides fueron incubados por 90 min a 39° C y 5% de CO2 en aire. Tanto en el tiempo 0, 45 y 90 min se obtuvieron alícuotas de 200 µl que se utilizaron para evaluar la integridad de acrosoma.
Experimento 2. Efecto de la heparina en las tasas de fecundación in vitro. Para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides expuestos a los grupos experimentales anteriores, se coincubaron espermatozoides con oocitos madurados in vitro en gotas de 50 µl de medio Talp FIV, durante 18 h a 39° C y 5% de CO2 en aire humedecido. Posteriormente, los oocitos fueron removidos, limpiados mecánicamente de es-permatozoides adheridos a la zona pelúcida y fijados en una solución de aceto-alcohol (1:3 v/v) y teñidos con 1% de aceto-lacmoid para evidenciar la fecundación. Se consideraron fecundados los oocitos que mostraron pronúcleos y cola espermática en su citoplasma.
Experimento 3. Evaluación del tiempo de capacitación mínimo de espermatozoides de chivos. El tiempo de capacitación se evaluó como el primer aumento significativo en las tasas de reacción de acrosoma ante estímulos fisiológicos apropiados. Para lo anterior, 50 x 106 espermios/ml fueron incubados a 39° C y 5% de CO2 en aire humedecido, suspendidos en 2 ml de los siguientes tratamientos.
Grupo 1: Plasma seminal + 10% v/v de suero de cabra en estro + 2.7 mM
de calcio.
Grupo 2: Talp FIV - heparina.
Grupo 3: Talp FIV + 10 µg/ml de heparina.
En el tiempo 0, 45 y 90 min, 500 µl de las suspensiones espermáticas fueron colectadas y expuestas a 100 ng/ml de zonas pelúcidas solubili-zadas; posteriormente las preparaciones fueron incubadas en microtubos Eppendorf por 30 min a 39° C y 5% de CO2 en aire y los espermatozoides teñidos para evaluar su integridad acrosomal.
Análisis estadístico. Los porcentajes obtenidos fueron
transformados por el método de Bliss y los resultados evaluados mediante
ANDEVA de mediciones repetidas y por la prueba de comparación múltiple
de Tukey en el programa estadístico Systat®. Se consideró
como estadísticamente significativo un P< 0.05.
RESULTADOS
Para evaluar el efecto de la heparina, los eyaculados se procesaron sólo si presentaban un movimiento progresivo superior a 65%. En la tabla 1 se muestran los resultados de la evaluación del efecto de la heparina en la inducción de reacción de acrosoma.
Los resultados muestran que los espermatozoi-des suspendidos en plasma seminal no experimentaron modificaciones en la integridad de acrosoma en el transcurso de la incubación. Asimismo, los espermatozoides suspendidos en Talp FIV presentaron un aumento significativo en la pérdida acrosomal en el primer período de incubación independiente de la presencia de los moduladores de la fecundación utilizados en este estudio (calcio y heparina); sin embargo, la integridad de acrosoma en el grupo expuesto a zonas pelúcidas solubilizadas fue significativamente inferior a los 90 min de incubación. El hecho de que las zonas pelúcidas solubilizadas aumenten significativa-mente la inducción de reacción de acrosoma en espermios tratados con heparina sugiere que ésta actúa sobre el proceso de capacitación y no induce directamente la reacción de acrosoma en caprinos.
Para verificar si el aumento en el daño acrosomal que se observó en el primer período de incubación tiene alguna importancia funcional en la fecundación, se incubaron oocitos maduros con los espermatozoides tratados de acuerdo al experimento anterior. Los resultados se muestran en la tabla 2.
De acuerdo a los resultados, sólo los esperma-tozoides expuestos a condiciones conocidas de capacitación tuvieron tasas de fecundación consistentes, por lo que es probable que el aumento en el daño acrosomal en el experimento anterior represente un resultado inespecífico.
En el experimento siguiente se evaluó en qué momento del período de incubación los espe-rma-tozoides se tornaban sensibles a la inducción de reacción de acrosoma por zonas pelúcidas solubi-lizadas. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Los resultados de la tabla 3 muestran que en el Tiempo 1 las tasas de integridad de acrosoma son similares en todas las poblaciones espermáticas y sólo se modificaron significativamente cuando los espermatozoides fueron incubados en presencia de heparina. Adicionalmente, es posible observar que el aumento de la sensibilidad a las zonas pelúcidas solubilizadas de los espermato-zoides tratados con heparina, medido como aumento en las tasas de acrosomas reaccionados, es creciente a medida que aumenta el período de incubación y que se evidencia a partir del Tiempo 2.
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Efecto de la heparina en la inducción de reacción
de acrosoma en espermios caprinos. |
|||||
|
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|||||
| Repeticiones |
Desprendimiento de acrosoma (%)
|
||||
| Tratamientos1 |
media + E.E.
|
Significancia
|
|||
|
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|||||
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Tiempo 12
|
Tiempo 2
|
Tiempo 3
|
|||
|
|
|||||
| Plasma seminal + calcio |
8
|
21.8 ± 2.5af3 |
24.6 ± 1.8af
|
26.8 ± 1.2af |
|
| Plasma seminal - calcio |
8
|
21.3 ± 1.7af |
22.1 ± 1.8af
|
24.9 ± 0.5af
|
|
| Talp FIV-calcio |
8
|
20.2 ± 1.9af |
28.1 ± 1.3ag
|
28.9 ± 1.2ag
|
T1-T2=0.001
|
| Talp FIV - heparina |
8
|
16.6 ± 2.1af |
23.6 ± 1.7ag
|
24.2 ± 1.5ag
|
T1-T2=0.001
|
| Talp FIV |
8
|
19.7 ± 2.8af |
24.9 ± 1.1ag
|
27.4 ± 0.9ag
|
T1-T2=0.001
|
| Talp FIV + zonas |
8
|
21.3 ± 1.4af |
27.9 ± 1.4ag
|
35.5 ± 0.8bh
|
T1-T2=0.000
|
| pelúcidas solubilizas |
T2-T3=0.000
|
||||
| Significancia4 |
G5-G6=0.003
|
||||
|
|
|||||
| 1 Ver texto por detalles. | |||||
| 2 Tiempos (T) 1.2 y 3 = 0, 45 y 90 min respectivamente. | |||||
| 3 Letras diferentes (a,b, f, g,h) indican diferencias estadísticas en columnas y filas respectivamente. | |||||
| 4 G5,6 = Tratamientos 5 y 6 respectivamente. | |||||
|
Efecto de diferentes medios de fecundación en las
tasas de penetración |
|||
|
|
|||
| Tratamientos |
Repeticiones
|
Tasas de penetración de oocitos
|
|
|
Media
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Rangos (%)
|
||
| Plasma seminal + calcio |
4
|
3/52 (5.8%)a |
0.0-0.2
|
| Plasma seminal - calcio |
4
|
0/50 (0.0%)a
|
0.0
|
| Talp FIV - calcio |
4
|
0/47 (0.0 %)a
|
0.0
|
| Ta lp FIV - heparina |
4
|
0/44 (0.0%)a
|
0.0
|
| Talp FIV |
4
|
30/51 (58.8%)b
|
33.3 -75.0
|
| Talp FIV + zonas | |||
| pelúcidas solubilizadas |
4
|
26/54 (48.1%)b
|
15.4-75.0
|
|
|
|||
|
1 Letras distintas en columnas indican diferencias estadísticamente significativas (P< 0.05). |
|||
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Integridad de acrosoma en espermatozoides de caprinos
tratados con heparina y expuestos a zonas pelúcidas |
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|
Repeticiones
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Repeticiones Desprendimiento de acrosoma
(%)
|
|||
| Tratamiento 1 |
media + E.E.
|
Significancia
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Tiempo 12
|
Tiempo 2
|
Tiempo 3
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|||
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|
|||||
| Plasma seminal + calcio |
4
|
20.3 ± 0.3af3 |
20.5 ± 1.3af
|
25.0 ± 0.6af
|
|
| + zonas pelúdicas | |||||
| Talp FIV-heparina + | |||||
| zonas pelúdicas |
4
|
20.7 ± 0.8af
|
23.2 ± 1.5af
|
26.5 ± 1.4ag
|
T2-T3 = 0.04
|
| Talp FIV+zonas pelúdicas |
4
|
21.5 ± 0.7af
|
30.3 ± 1.0bg
|
35.8 ± 0.9ch
|
T1-T2 = 0.01
|
|
T2-T3 = 0.01
|
|||||
| Significancia4 |
G1-G3=0.000
|
G1-G3=0.000
|
|||
|
G2-G3=0.01
|
G2-G3=0.000
|
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|
|
|||||
| 1 Ver texto por detalles. | |||||
| 2 Tiempos (T) 1.2 y 3 = 0, 45 y 90 min respectivamente. | |||||
| 3 Letras diferentes (a,b, f,g,h) indican diferencias estadísticas en columnas y filas respectivamente. | |||||
| G1, 2, 3 = Tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente. | |||||
DISCUSION
La validación de la fecundación de oocitos de vaca para el estudio de la función espermática en caprinos (Cox y col., 1994) permite un fácil acceso a números significativos de oocitos. Florman y First (1988) mostraron que por el método de solubilización de zonas pelúcidas utilizado en el presente estudio, se obtenía un promedio de 3 µg de proteína de zona y que se requerían 10 ng de proteínas/ml de medio de fecundación para asegurar una tasa de inducción de reacción de acrosoma máxima en espermios capacitados. En el presente trabajo se utilizó una concentración fija de 100 ng de proteína por ml de medio Talp FIV, lo que sumado a la alta eficiencia de fecundación observada en trabajos previos (Cox y col., 1994; 1995), permite asumir que la concentración de proteína de zona utilizada no es un factor limitante en los resultados obtenidos.
Los resultados obtenidos en el Experimento 1, diseñado para definir la etapa en que la heparina ejerce el efecto estimulatorio en el proceso de fecundación, muestran que con el transcurso de la incubación las poblaciones espermáticas ex-pues-tas a condiciones de capacitación presentan un aumento en las tasas de acrosomas dañados sólo en presencia de zonas pelúcidas solubilizadas, lo que permite establecer que la heparina afecta la capacitación espermática pero no tiene un efecto directo sobre la reacción de acrosoma.
En este experimento, el patrón de daño acrosomal fue similar para los espermatozoides suspendidos en medio Talp FIV, excepto para el grupo tratado con zonas pelúcidas, aun en ausencia de calcio, molécula que reconocidamente interviene en la inducción de la reacción acrosomal, lo que sugiere que el desprendimiento es un efecto inespecífico. Los resultados observados con plasma seminal probablemente se deben a la mayor estabilidad en el plasmalema que corrientemente se observa en estas condiciones (Bedford, 1991). De hecho, la ausencia de fecundación de oocitos maduros observado para los grupos de espermatozoides expuestos a condiciones no capacitantes, en contraste con la eficiencia obtenida para los grupos suspendidos en Talp FIV, sugiere que efectivamente las tasas de reacción de acrosoma obtenidos en el Experimento 1 pueden ser interpretadas como funcionalmente no relevantes.
Al exponer los espermatozoides a zonas pelúcidas solubilizadas, luego de períodos de incubación definidos, permite establecer aproximadamente el tiempo mínimo requerido por los espermatozoides para experimentar el proceso de capacitación (Parrish y col., 1989). En efecto, un aumento significativo en la tasa de acrosomas dañados en respuesta a la exposición espermática a proteína de zona, puede ser interpretado como un aumento significativo en la proporción de espermios capacitados. En ese contexto, los resultados obtenidos en el Experimento 3 muestran que el período de capacitación mínimo para espermatozoides caprinos suspendidos en Talp FIV es de aproximadamente 45 min. Asimismo, en ausencia de condiciones de capacitación adecuadas, la exposición espermática a proteína de zona produce un aumento reducido en las tasas de daño acrosomal sólo en espermios suspendidos en medio Talp, lo que sin embargo puede ser interpretado de acuerdo a la información previa como un resultado inespecífico.
Thompson y col. (1992), en base a la rápida fecundación obtenida, sugieren que los esper-matozoides caprinos no requerían de un período de capacitación; sin embargo, el presente trabajo demuestra que se requieren por lo menos unos 45 min para que los espermios empiecen a reaccionar a la presencia de proteína de zona. Basados en que los elementos participantes en el modelo están presentes en forma natural en la interacción entre gametos (Lee y col., 1986), en que la eficiencia del sistema de fecundación in vitro y del desarrollo pronuclear es relativamente alta (Bavister, 1990; Cox y col.. 1994), y en que se ha demostrado en bovinos que el período de capacitación in vitro con heparina es similar al período de capacitación normal (Parrish y col., 1989; Toyoda y Naito, 1990), es probable que en caprinos el período de capacitación natural mínimo se acerque a los 45 min.
En resumen, los resultados obtenidos muestran que la heparina ejerce un aumento
en las tasas de fecundación facilitando la capacitación espermática
y que el tiempo mínimo que necesitan los espermatozoides para completar
el proceso de capacitación es alrededor de 45 min.
RESUMEN
El presente estudio está destinado a establecer la etapa del proceso de fecundación en que la heparina ejerce el efecto estimulatorio de la fecundación en caprinos.
Oocitos bovinos fueron madurados en medio 199 y alternativamente utilizados para la producción de zonas pelúcidas solubilizadas o para estudios de fecundación. Las zonas pelúcidas, colectadas eliminando mecánicamente al oocito, fueron solubilizadas en ácido acético, liofilizadas y almacenadas a -20° C, hasta su reconstitución. Los espermatozoides fueron colectados con vagina artificial, lavados y capacitados por incubación en medio Talp con suero y heparina.
En el Experimento 1, los espermatozoides fueron suspendidos en Talp más heparina, Talp más heparina y zonas pelúcidas o en condiciones no capacitantes y fueron incubados por 90 min a 39° C y 5% de CO2 en aire. En el Experimento 2, los espermatozoides agrupados como en el experimento anterior fueron coincubados por 18 h con oocitos. En el Experimento 3, los espermatozoides fueron suspendidos en plasma seminal y Talp con y sin heparina e incubados por 90 min a los 0, 45 y 90 min, muestras de suspensión fueron expuestas a zonas solubilizadas e incubadas por otros 30 min. En los experimentos 1 y 3, el daño acrosomal fue evaluado usando la tinción PI/PSA y en el Experimento 2, la fecundación fue verificada por la presencia de pronúcleos y cola espermática en el oocito.
Los resultados en el Experimento 1 muestran que a los 90 min de incubación el daño acrosomal aumenta en los espermios tratados con zonas en relación a los controles (P< 0.001). En el Experimento 2. sólo hubo fecundación en los grupos espermáticos incubados en condiciones capacitantes. En el Experimento 3, los resultados muestran que el daño acrosomal aumenta ya a los 45 min de incubación (P<0.01).
Aceptado: 29.07.97.
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