ARTICULOS ORIGINALES

Actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en rebaños lecheros a pastoreo: variación según edad y época del año*

A. Ceballos, M.V.Z., M. Sc.; F. Wittwer, M.V., M.V. Sc.; P.A. CONTRERAS, M.V., M. Phil.; H. Böhmwald, T.M.

Instituto Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.

INTRODUCCION

La mayoría de las moléculas presentes en el organismo son químicamente estables, es decir, tienen un número par de electrones en su orbital externo; pero, existen otras cuyo número de electrones en el orbital externo es impar, estas sustancias químicas altamente inestables y reactivas se conocen como radicales libres (Barquinero, 1992). Cuando un radical interactúa con una sustancia estable, toma de ella un electrón cargando positivamente la molécula; así, el compuesto estable (no radical) se convierte en un radical libre altamente agresivo, pudiendo generar más radicales, dando lugar a una reacción en cadena (Halliwell, 1992).

El oxígeno, aún siendo escencial para la vida, es también tóxico por ser una substancia oxidante ya que puede aceptar electrones desestabilizando la molécula que lo pierde; por lo tanto, en el metabolismo aerobio se producen oxidantes denominados metabolitos oxigenados reactivos (MOR), entre los que se cuentan el anión superóxido (O₂^•)¹ , radicales hidroxilo (OH^•) y radicales alkoxy (RO^•). Otras moléculas, como el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), no son radicales libres; pero, químicamente se comportan como oxidantes (Barquinero, 1992); (Halliwell, 1992)). Existen otras fuentes de MOR como las reacciones inflamatorias, la degradación de los ácidos grasos, la acción del citocromo P-450 o en forma ocasional durante el metabolismo de ciertas sustancias exógenas (Miller y col., 1993).

Bajo condiciones normales el organismo puede neutralizar la capacidad reactiva de los MOR por la acción del sistema antioxidante; pero, hay momentos en que se supera la capacidad antioxidante quedando el organismo expuesto a la acción de los metabolitos oxigenados en lo que se conoce como estrés oxidativo (Miller y col., 1993).

La glutatión peroxidasa (GSH-Px; EC 1.11.1.9) es una metaloenzima que forma parte del sistema glutatión, señalado como el principal sistema antioxidante del organismo. Hasta ahora se han identificado tres tipos de GSH-Px: celular, extracelular (plasmática) y fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa. La estructura de la enzima celular está conformada por cuatro subunidades de 22.000 daltons cada una donde cada subunidad contiene un residuo de selenio (Se) en forma de selenocisteína (Burk y Hill, 1993).

La deficiencia de Se induce una baja actividad de GSH-Px, dejando la célula expuesta a la acción nociva de los MOR, lo que produce alteraciones en la estructura de los lípidos, proteínas, polisacáridos, DNA y otras macromoléculas celulares (Miller y col., 1993). No sólo se altera la funcionalidad celular sino también la estructura de organelos intracelulares como mitocondria, lisosoma, pared y estructura celular (Combs y col., 1975). Como producto de la deficiencia de Se, el estrés oxidativo se ha asociado con la presentación de algunas patologías en el bovino como enfermedad del músculo blanco, retención de placenta, inmunosupresión y mastitis, entre otras (Van Saun, 1990; Eicken y col., 1992).

En Chile se han reportado casos de deficiencia de Se en equinos (Contreras y col., 1991; Ceballos y col., 1996); además, se han realizado algunos estudios para conocer la composición mineral de forrajes (Haardt y col., 1976; Egaña y col., 1987; Wittwer y col., 1988); pero no hay estudios acerca de la concentración edáfica o forrajera de Se o de su balance nutricional en bovinos.

En consideración a lo anterior, este trabajo tiene por objeto conocer, caracterizar y evaluar, en diferentes épocas del año, el balance metabólico nutricional de Se en bovinos de diferentes grupos etarios y productivos de rebaños lecheros del sur de Chile.

MATERIAL Y METODOS

En el valle central de la provincia de Valdivia, Chile (39° LS y 73° LO) fueron seleccionados ocho rebaños lecheros segun su ubicación geográfica, actividad productiva, masa ganadera, tipo de alimentación del rebaño y que los animales no estuvieran recibiendo una cantidad de Se adicional al consumido en la pradera, el concentrado o la sal mineralizada.

La región presenta un clima oceánico con influencia mediterránea húmeda y con una pluviosidad anual de ±1.800 mm. La distribución anual de lluvias se caracteriza por presentar dos períodos definidos de baja y alta pluviosidad, alternados con dos períodos de pluviosidad intermedia. El año 1995 el período verano-otoño presentó una baja pluviosidad, concentrando el 35% del total anual, mientras que el período invierno-primavera tuvo el 65% de las lluvias. La temperatura en los períodos de alta pluviosidad disminuye alcanzando un promedio de 7° C, mientras que en la época de baja pluviosidad es más elevada alcanzando un promedio de 17° C (Goic y Siebald, 1987).

La superficie de los predios varió entre 100 y 700 hectáreas aproximadamente. La topografía dominante es plana con pendientes simples a ondulada. Los suelos son trumaos con una reacción ligera a fuertemente ácida, predominando los pH fuertemente ácidos y el drenaje fluctúa entre moderado a excesivo. En el área destinada a la ganadería predominaban las praderas mejoradas, en las que se encuentran especies forrajeras como ballicas (Lolium sp.) y tréboles (Trifolium sp.), en menor proporción pasto ovillo (Dactylis glomerata), pasto miel (Holcus lanatus), pasto oloroso (Anthoxanthum odoratum), pasto cebolla (Arrhenatherum elatius) y chépica (Agrostis capillaris). La utilización de la pradera era con pastoreo directo y la conservación de excedentes de forraje mediante ensilaje al final de la primavera o henificación en el verano.

El sistema de producción de leche correspondía a un modelo con tendencia estacional, concentrando en primavera y otoño el mayor número de partos, con una alimentación basada en la utilización de pradera, forrajes conservados en la época invernal y alimentos concentrados como suplementación para las vacas en producción. Las terneras estaban mantenidas en estabulación, y su alimentación se basaba en el suministro de leche o sustituto lácteo hasta los 60 días, más concentrado y heno a voluntad, en dos predios no recibían concentrado. Después de los dos meses de edad se pasaban a pastoreo las terneras nacidas en primavera, mientras que las nacidas en otoño iniciaban el pastoreo a los seis meses, suspendiéndose el suministro de alimentos concentrados. Las vaquillas y vacas preparto estaban en pradera; la suplementación con ensilaje o heno elaborados en el mismo predio, era sólo en invierno.

La suplementación con sales minerales era principalmente para las vacas en lactancia; sólo en cuatro predios se mantenía sal mineralizada a voluntad para las vaquillas. En tres de los productos usados como suplemento para las vacas, aparece el Se como componente de la mezcla mineral en una concentración entre 5 y 13 ppm; de las sales utilizadas para las vaquillas sólo una contiene Se como ingrediente.

Toma de muestras. En mayo de 1995 se seleccionaron en cada rebaño 5 grupos de animales conformados por 7 terneras entre 15 y 60 días de nacidas (terneras lactantes), 7 terneras entre 6 y 12 meses (terneras de recría), 7 vaquillas entre 13 y 24 meses, 7 vacas preparto (no lactantes) y 7 vacas en el inicio de la lactancia. Se obtuvieron entre 5 y 10 ml de sangre heparinizada mediante venopunción coccígea o yugular empleando el sistema de tubos al vacío, los tubos se trataron previamente con una solución de ácido nítrico (HNO₃) al 15%. Las muestras se llevaron dentro de 24 horas al Laboratorio de Patología Clínica Veterinaria de la Universidad Austral de Chile.

En noviembre de 1995 en los mismos rebaños se seleccionaron dos grupos de animales igualmente elegidos al azar y conformados por 7 vaquillas entre 13 y 24 meses y 7 vacas en el inicio de la lactancia.

Análisis. La concentración de hemoglobina se determinó mediante el método de la cianometahemoglobina (Jain, 1986). Posteriormente se preparó 1 ml de un hemolizado de la muestra de sangre conservándolo a –25° C en envases plásticos debidamente identificados hasta su posterior análisis. La actividad sanguínea de GSH-Px se analizó mediante la utilización de un juego de reactivos comercial (Ransel®. Laboratorios Randox, Crumlin, Irlanda del Norte) basado en una técnica cinética NADPH-dependiente según una modificación del método descrito por Paglia y Valentine (1967). Los resultados se expresan en U/g Hb.

Análisis estadístico. El tipo de distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de normalidad descrita por Pearson y Stephens (1964). Se obtuvieron para cada grupo etario y estado productivo, el rango de actividad y las estimadas promedio (x) y desviación estándar (DE) (Domènech, 1980). Para establecer si las muestras procedían de poblaciones diferentes se utilizó el método de Kruskal-Wallis para el análisis de varianza por rangos; las diferencias entre los grupos fueron establecidas utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Dunn con una probabilidad de error a = 0.01 (Daniel, 1978). La comparación entre los períodos de otoño y primavera se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney con una probabilidad de error a = 0.01(Daniel, 1978).

Para la técnica analítica se ha señalado una actividad enzimática igual o menor a 60 U/g Hb (Randox, 1990) como límite bajo el cual se considera que hay deficiencia nutricional de Se, por lo que se presenta la frecuencia de individuos, rebaños y grupos de animales con valores de actividad igual o inferior Se consideró que en el grupo había deficiencia de Se, al encontrar una actividad de GSH-Px en promedio igual o inferior a la cifra señalada o cuando tres o más individuos en el grupo presentaron valores bajos en la actividad enzimática.

RESULTADOS

En el otoño, el promedio y la desviación estándar de la actividad sanguínea de GSH-Px en los grupos estudiados fue 145 ± 90 U/g Hb, con un rango de 26-426 U/g Hb. Las terneras lactantes presentaron la mayor actividad enzimática, mientras que las terneras de recría y las vaquillas tuvieron una actividad enzimática menor, encontrándose diferencias entre los grupos (P<0.01). Las vacas preparto y en el inicio de la lactancia presentaron una actividad enzimática similar (P>0.01) con valores que se ubicaron entre los encontrados para los grupos anteriores (cuadro 1). Igualmente, se encontraron diferencias (P<0.01) en la actividad sanguínea de GSH-Px entre los grupos de cada rebaño, situación que fue similar en los ocho rebaños estudiados.

En las terneras lactantes se observó el menor número de individuos con una actividad enzimática inferior al valor señalado como marginal, encontrándose sólo 3 (5.5%) animales con valores bajo 60 U/g Hb. En el grupo de las terneras de recría se encontraron 20 (36.4%) individuos y en el grupo de las vaquillas 13 (23.6%) con una actividad de GSH-Px en sangre inferior al valor marginal. En las vacas sólo se observaron 4 (7.3%) hembras preparto y 8 (14.5%) en el inicio de la lactancia con una actividad enzimática disminuida.

En el rebaño 2 se encontraron todos los grupos de animales con una actividad enzimática promedio menor al valor marginal. En el rebaño 6 se encontraron todos los grupos, excepto las terneras lactantes, con un bajo valor promedio en la actividad enzimática. En los rebaños 1 y 3 sólo se encontraban afectados los grupos de terneras de recría y las vaquillas con una actividad enzimática promedio más baja, siendo su valor inferior al reportado como marginal (figura 1). En los rebaños 4, 5, 7 y 8 la actividad enzimática promedio en los grupos analizados se encontraba mayor a 60 U/g Hb.

Figura 1. Actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en otoño en bovinos de cinco categorías etarias productivas de ocho rebaños lecheros. Cada columna corresponde al  ± DE (n=7).
Blood glutathione peroxidase activity during autumn, in five categories of animals from dairy herds. Each column represents  ± SD (n=7).

En la primavera, la actividad enzimática observada en las vaquillas fue significativamente menor que la observada en otoño (P<0.01). Contrariamente, la actividad sanguínea de GSH-Px en las vacas en el inicio de la lactancia no presentó diferencias (P>0.01) entre períodos (cuadro 2). Asimismo, en la primavera aumentó la frecuencia de individuos en el grupo de las vaquillas con una actividad enzimática inferior a 60 U/g Hb, las que se encontraban en los rebaños 1, 3 y 6. En el grupo de las vacas en el inicio de la lactancia, en primavera aumentó la frecuencia de individuos con una actividad enzimática bajo el valor marginal en los rebaños 2 y 6 (figura 2).

Cuadro 2 Promedio, desviación estándar y rango de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en vaquillas y vacas en el inicio de lactancia en otoño y primavera en ocho rebaños lecheros. Mean, standard deviation and range of blood glutathione peroxidase activity in groups of heifers and early lactating cows from dairy herds.
	Actividad de GSH-Px
	(U/g Hb)
Grupo
	Otoño		Primavera
	± DE*	Rango	± DE*	Rango
Vaquillas	99 ± 42 a	26 – 190	70 ± 24 b	15 – 128
13-24 meses
Vacas	143 ± 65 c	35 – 404	125 ± 80 c	18 – 407
Inicio de lactancia
* Promedio de 8 rebaños con 7 observaciones por grupo. Letras diferentes (P<0.01) .

VACAS EN EL INICIO DE LA LACTANCIA

Figura 2. Frecuencia de vaquillas y vacas en el inicio de la lactancia con actividad sanguínea de GSH-Px menor a 60 U/g Hb en otoño y primavera en ocho rebaños lecheros.

Frequency of heifers and early lactating cows with low blood glutathione peroxidase activity during autumn and spring in dairy herds.

El número de grupos de vaquillas y vacas en el inicio de la lactancia que presentaron valores promedio bajos en la actividad sanguínea de GSH-Px, se mantuvo igual tanto en otoño como en primavera. encontrándose en ambos períodos 3 de los 8 grupos de vaquillas y 2 de los 8 grupos de vacas en el inicio de la lactancia, con una baja actividad sanguínea de GSH-Px.

DISCUSION

La mayor actividad sanguínea de GSH-Px se observó en el grupo de las terneras lactantes, mientras que en las terneras de recría y las vaquillas la actividad enzimática fue menor (cuadro 1), observándose diferencias entre los grupos (P<0.01).

Una concentración de Se adecuada en los primeros días de vida refleja la transferencia materna del mineral durante la gestación. En el feto se ha comprobado que el hígado almacena el Se transferido por la madre; así, este órgano tiene una reserva que puede ser movilizada rápidamente permitiendo una actividad enzimática alta en las primeras semanas de vida (House y Bell, 1994; Kirk y col., 1995). En los grupos de terneras de recría y vaquillas se observaron desbalances nutricionales de Se en 6 de los 16 grupos estudiados, al encontrarse una actividad enzimática inferior a 60 U/g Hb (figura 1). En estos grupos se encontró una disminución en la actividad enzi-mática en la mayoría de los individuos muestreados, lo que estaría indicando que el desbalance nutricional de Se obedece a un problema de grupo más que a la afección de individuos en forma aislada.

Resultados similares se han observado en Nueva Zelanda, encontrándose una baja actividad enzimática en vaquillas, con una disminución entre el 35 y 65% respecto al valor mínimo de referencia (Wichtel y col., 1994). En Uruguay. se encontró en vaquillas un valor promedio de 26 U/g Hb, considerando como valor marginal una actividad de GSH-Px inferior a 30 U/g Hb (Ricciardino y col., 1991).

Una vez producida la depleción de la reserva de Se almacenada durante la gestación y después del destete, las terneras de recría y las vaquillas dependen únicamente del forraje y otros suplementos nutricionales para satisfacer su requerimiento de minerales. Por lo anterior, si la suplementación con Se en este período no es adecuada disminuye su concentración en la sangre trayendo como consecuencia una actividad sanguínea de GSH-Px disminuida (Weiss y col., 1984). Los forrajes que crecen en suelos deficitarios en Se presentan un bajo contenido de este mineral; así, el consumo de estos forrajes y la falta de una suplementación mineral, según el requerimiento, producirían una disminución en la actividad sanguínea de GSH-Px (Jukola, 1994).

En consideración a lo anterior, es posible observar en los animales a pastoreo una disminución de la actividad sanguínea de GSH-Px, siendo las terneras de recría y las vaquillas los grupos más afectados (figura 1), ya que éstos dependen del consumo de forrajes para satisfacer no sólo su requerimiento de minerales sino de otros nutrientes.

Las vacas preparto y en el inicio de la lactancia no presentaron diferencias en la actividad enzimática (P>0.01), y sus valores se ubicaron entre los observados para las terneras lactantes y las vaquillas (cuadro 1). En el preparto no se observaron grupos de vacas con desbalances nutricionales de Se; mientras que en las vacas en lactancia se encontraron dos grupos con valores disminuidos (figura 1). En otros estudios igualmente se ha señalado que en las vacas la actividad de GSH-Px en sangre es adecuada, habiéndose reportado valores superiores al que los autores consideraron bajo o marginal (Backall y Scholz, 1979; Calamari y col., 1989).

En los predios estudiados se observaron cambios en la alimentación de las vacas con respecto a los demás grupos de animales. El uso de alimentos concentrados de origen industrial contribuye a aumentar el contenido de Se en la ración; así, se elevaría la concentración del mineral en el hígado, la sangre y otros tejidos, como también en la leche (Binnerts y col., 1993). Como respuesta biológica frente a un mayor aporte de selenio, se producirá un aumento en la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa (McDowell, 1992).

El aumento de Se en la ración producirá una elevación de la actividad sanguínea de GSH-Px en un lapso entre l a 4 semanas después de la suplementación (Knight y Sunde, 1988). Así, un cambio en la alimentación entre el período seco y el inicio de la lactancia no tendría un efecto inmediato sobre la actividad sanguínea de GSH-Px, lo que explicaría por qué entre las vacas preparto y las vacas en el inicio de la lactancia no se observaron diferencias (cuadro l) en la actividad enzimática (P>0.01). Además, en las vacas preparto la actividad sanguínea de GSH-Px se mantendría elevada gracias a la alimentación recibida al final de la lactancia, la que es similar a la alimentación en el inicio de la lactancia, presentando diferencias sólo en la cantidad de alimentos consumidos.

La disminución en la actividad sanguínea de GSH-Px que se observó en algunos grupos de vacas en el inicio de la lactancia (figura 1), estaría dada por el consumo de un forraje con un bajo contenido de Se y no recibir una suplementación adecuada durante el preparto, situación similar a la encontrada en las terneras de recría y las vaquillas.

Sólo en las vaquillas se observaron diferencias en la actividad sanguínea de GSH-Px entre otoño y primavera (P<0.01) encontrándose en primavera los valores más bajos (cuadro 2) En primavera aumentó la frecuencia de animales, tanto vaquillas como vacas al inicio de lactancia, con valores bajos en la actividad enzimática (figura 2). Resultados similares se han observado en otros estudios donde al final de primavera se presentó una disminución en la actividad sanguínea de GSH-Px (Clark y col., 1992; Mee y col., 1994; Wichtel y col., 1996).

Anteriormente se había señalado que la concentración de Se en la ración es el principal factor para inducir cambios en la actividad de GSH-Px; así, cualquier variación estacional que se presente en la actividad enzimática será una consecuencia de las variaciones en la concentración de Se en la pradera, las que igualmente son estacionales y dependerían del régimen de lluvias en cada período del año donde una alta pluviosidad produce una disminución del contenido de Se (Grant y Sheppard, 1983; Clark y col, 1992).

La actividad de GSH-Px refleja el estado metabólico de Se en el organismo, que a su vez depende del consumo del mineral en los dos o tres meses anteriores al análisis (Whitaker y Kelly, 1994); así, se encontrarían en primavera valores bajos en la actividad enzimática por un bajo consumo de Se en invierno. En vaquillas se ha observado una disminución en la actividad enzimática cuando el animal retorna al pastoreo después de la época invernal. Esta baja actividad sería una consecuencia del aporte deficitario de Se durante la estabulación invernal (Hakkarainen y col., 1987).

En la provincia de Valdivia se concentra el 65% de la pluviosidad anual en el período invierno e inicio de primavera, lo que induciría una disminución en la concentración de Se en el forraje en esta época. Asimismo, el crecimiento abundante del forraje, característico del inicio de primavera, guarda una relación inversa con la concentración de Se, contribuyendo a disminuir el aporte del mineral en la ración (Grant y Sheppard, 1983).

Por otra parte, el crecimiento del forraje en primavera presenta un aumento en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados, nitrógeno, oxalatos y potasio, siendo éstos algunos factores que pueden inducir un aumento en el requerimiento de antioxidantes, entre ellos el Se (Ardüser y col., 1985; Wichtel y col., 1994; Wichtel y col., 1996). El aumento en la demanda de Se va a contribuir a acrecentar la deficiencia del mineral en primavera, y por ende la disminución en la actividad de glutatión peroxidasa.

Al analizar los resultados obtenidos y bajo las condiciones de este estudio, es posible concluir que en el sur de Chile se presentan valores disminuidos en la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa, compatibles con la deficiencia de Se. Además, existen diferencias en la actividad sanguínea de GSH-Px según el grupo de animales y la época del año, encontrándose en las terneras de recría y en las vaquillas, al igual que en primavera, la mayor frecuencia de individuos y grupos con valores de actividad enzimática disminuidos; diferencias que obedecen principalmente a cambios en la alimentación.

RESUMEN

Con el objeto de estudiar en rebaños lecheros a pastoreo el estado nutricional de selenio (Se) mediante el análisis de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa (GSH-Px), se tomaron muestras de sangre en el otoño de 1995 a diferentes grupos de bovinos en 8 rebaños de la provincia de Valdivia, Chile (39° LS y 73° LO). En los mismos rebaños, en primavera, se repitió el muestreo sólo en dos grupos.

La actividad enzimática fue analizada mediante una técnica cinética enzimática (Ransel®, Randox Lab., Crumlin, UK). Los resultados fueron descritos empleando estadística descriptiva y las comparaciones se hicieron mediante análisis estadísticos no paramétricos.

Las terneras lactantes presentaron la mayor actividad enzimática y el menor número de animales con actividad disminuida (5.5%), mientras que las terneras de recría y las vaquillas presentaron los valores más bajos (P<0.01), así como un mayor número de animales afectados (30%). Las vacas preparto y en el inicio de lactancia presentaron una actividad enzimática similar (P>0.01), con valores ubicados entre los observados para los grupos anteriores. En primavera se hallaron valores de actividad enzimática más bajos que en otoño, aumentando la frecuencia de individuos afectados (P<0.01).

Por lo anterior, es posible concluir que rebaños lecheros de la provincia de Valdivia presentan deficiencias nutricionales de Se, siendo más afectados los animales en crecimiento que son mantenidos en pastoreo y con mayor intensidad en primavera.

Aceptado: 13.08.97.

* Proyecto FONDECYT-Chile 195 1062.

1 Los MOR se simbolizan con • (Halliwell, 1992).