Estudio de la cinética de la fermentación in vitro y del residuo no fermentado del forraje disponible en la pradera y del aparentemente consumido por vacas lecheras

R. Pulido¹, M.V., Mg. Sc., Ph.D.; C. D. Wood², B.Sc., Ph.D.; J.D. Leaver³, B.Sc., Ph.D.

¹ Instituto de Zootecnia, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, casilla 567, Valdivia, Chile.
²Natural Resources Institute, Central Avenue, Chatham Maritime, Kent ME4 4TB, U.K.
³ Wye College, University of London, Wye, Ashford, Kent TN25 5AH, U.K.

Study of in vitro fermentation kinetics of herbage mass samples and simulated grazing samples for dairy cows

An experiment to study the characteristics of in vitro fermentation of forage was carried out in herbage mass samples (FD) and simulated grazing samples (FA), at two sward heights of a permanent pasture. The digestion kinetics of the forage was studied using in vitro gas production method. Data collected were fitted according to the equation of Orskov and McDonald. Gas production was greater (P<0.05) from herbage mass samples than simulated grazing samples at 12, 21, and 27 hours of incubation (161.7 v/s 150.6, s.e.d.= 4.23; 217.6 v/s 209.2, s.e.d.= 3.65; and 242.1 v/s 234.7, s.e.d.= 3.34, respectively). However, after 27 hours of incubation, no significant effect (P>0.05) of type of sample, either on the amount of gas produced or on the kinetic of fermentation, were found. The dry matter disappearance after 96 hours of incubation was significantly lower (P<0.05) for herbage mass samples compared with simulated grazing samples (0.908 v/s 0.873, s.e.d.= 0.005), but with no effect of sward height (P>0.05). These findings show the benefits of complementing in vitro gas production measurements with post digestion residue determinations to improve the knowledge on the nutritive value of feed fermented in the rumen.

La degradación de alimentos por los microorganismos del rumen produce gas. El estudio de la producción del gas de fermentación in vitro puede ser utilizado para describir la digestibilidad del forraje y la cinética de la fermentación ruminal de los alimentos (Schofield y Pell, 1995). La técnica in vitro de Theodorou y col. (1994), al medir la producción periódica de gas en un solo frasco de fermentación, aparece como una alternativa para reducir la necesidad de los estudios con gran número de muestras, a objeto de medir la cinética de la degradación de un alimento (Pichard, Troncoso y Bruni, 1995). Se ha demostrado que el método puede estimar la degradabilidad in vivo y la digestibilidad aparente de la materia seca de forrajes con bastante precisión (Blummel y Orskov, 1993).

En el presente experimento se utilizó la técnica in vitro de producción periódica de gas de Theodorou y col. (1994), con el objeto de estudiar la producción de gas y la fermentación de la materia seca, en muestras provenientes de forraje disponible a ras de suelo en la pradera (FD) y en muestras del forraje aparentemente consumido por el animal en pastoreo (FA), en muestras de una pradera permanente, manejadas a dos alturas de pradera (Pulido, 1997).

El experimento fue llevado a cabo en el Laboratorio de Nutrición Animal del NRI (Natural Resources Institute), en Wye, Kent, Gran Bretaña, desde enero a febrero de 1996.

Alimentos. Se tomaron muestras de forraje de una pradera permanente compuesta principalmente de gramíneas perennes (Lolium perenne). La pradera fue manejada a dos alturas de pastoreo (altura de pradera baja (PB) y altura de pradera alta (PA)), bajo un sistema de pastoreo continuo controlado. Además, se estudió el forraje disponible (FD) en la pradera desde el suelo y el forraje aparentemente consumido (FA) por el animal en pastoreo, ambos a las dos alturas de pradera (cuadro 1). El FA se obtuvo cortando y colectando el forraje inmediatamente adyacente a aquel forraje consumido por el animal en pastoreo. Este proceso de selección del forraje se realizó siguiendo a siete vacas por cada altura de pradera. Las muestras compuestas fueron secadas a 60º C en un estufa con circulación de aire por 48 horas, y luego se molieron en un molino de cuchillos con una criba de 1 mm. Las determinaciones realizadas en todas las muestras de forraje fueron materia seca (MS), proteína cruda (PC) y cenizas totales (CT) (A.O.A.C. 1980), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) (Goering y Van Soest, 1970) y celulasa neutro detergente (CND) (Jewell et al. 1986), para determinar la energía metabolizable (EM) según M.A.F.F. (1993).

Dos ovinos canulados ruminalmente fueron usados para suplir de líquido ruminal. Los animales recibieron una ración de heno de pradera permanente y un concentrado comercial (220 g PC/kg MS y 13,2 MJ / kg MS) en una proporción aproximada de 3:1. Las raciones fueron calculadas para lograr un consumo diario de 1.0 a 1.5 veces el nivel de mantenimiento (AFRC, 1993). Los alimentos se ofrecieron en dos raciones iguales durante el día. Los animales disponían de libre acceso al agua.

La técnica de producción de gas fue realizada usando 1 g de sustrato (± 0.002 g) (base seca) por tratamiento y en triplicado. Cada muestra fue fermentada en forma independiente.

Preparación de las botellas. El medio Theodorou fue preparado de acuerdo a un protocolo de producción de gas NRI 1996. El medio se hirvió y luego se enfrió y se gasificó con CO₂. El medio Theodorou (90 ml) fue puesto en botellas con capacidad de 125 ml, bajo continua gasificación con CO₂. Una vez llenas, éstas fueron selladas con tapas de goma y luego almacenadas a 4º C por 60 horas. Posteriormente, los sustratos a incubar fueron transferidos a las botellas que contenían el medio. Estas se gasificaron con CO₂ y fueron selladas nuevamente con tapón de goma, y puestas a incubar a 4º C por 10 horas, para posteriormente pasar a temperatura de incubación de 39º C.

La inoculación. El fluido ruminal se obtuvo de dos ovejas usando una bomba aspiradora y guardado en termos a temperatura de 39º C. El líquido ruminal fue filtrado a través de 4 capas de muselina y se almacenó bajo una atmósfera de CO₂.

Inoculación de las botellas. Mientras el inóculo estaba siendo preparado, las botellas cerradas fueron ajustadas a la presión atmosférica. Posteriormente, se inyectaron 10 ml de inóculo a cada botella mediante una jeringa. Luego las botellas fueron agitadas y devueltas a la estufa de incubación a 39º C, momento que se consideró como el comienzo del experimento (tiempo cero = 0). Las lecturas fueron llevadas a cabo a los siguientes tiempos, después del tiempo cero: 3, 6, 9, 12, 15, 21, 27, 33, 39, 48, 60, 72 y 96 h.

Composición química (base materia seca) de muestras de forraje disponible (FD) a ras del suelo y del forraje aparentemente (FA) consumido, obtenidas a dos alturas, baja (PB) y alta (PA), (g/kg. MS).

Chemical composition of herbage samples offered at ground level (FD) and simulated grazing samples (FA), at two sward height, low (PB) and height (PA) (g/kg., DM).

	Muestras de forrajes (Forage samples)
	FD		FA
Altura de pradera (Sward height)	PB	PA	PB	PB
Altura de pradera, cm	6.4	10.7	6.4	10.7
Materia seca (MS)	?	?	202	207
Materia orgánica (MO)	913	913	904	908
Cenizas totales (CT)	87	87	96	92
Proteína cruda (PC)	169	135	226	231
Fibra detergente neutro (FDN)	465	473	448	421
Fibra detergente ácido (FDA)	243	245	232	222
Energía metabolizable ( EM, MJ/kg. MS)	11.9	11.8	12.4	12.6

Registro de producción de gas. Se utilizó un transductor de presión (Bailey y Mackey Ltd., Birmingham 342 1 DE, UK) para medir la presión dentro de las botellas. El transductor tuvo un rango de presión de 0 a 25 psi (± 0.1) y las lecturas fueron registradas en unidades psi. En cada tiempo de lectura, se retiraron las botellas desde el incubador, y se insertó una aguja de jeringa desechable conectada al transductor a través de la tapa de goma de la botella. La presión de gas fue leída en el transductor y se extrajo el volumen de gas producido hasta ajustar a la presión atmosférica (0.0 psi). Las botellas fueron agitadas y devueltas al incubador.

La desaparición de la materia seca (DHS) fue determinada a las 96 horas de incubación (final del ensayo de producción de gas) (DMS96). Los contenidos de cada botella fueron aspirados y filtrados a través de filtros medidos (goosh, vidrio cinta, porosidad 1 - graduado P160). La botella fue lavada con agua destilada y los residuos obtenidos fueron lavados en el filtro. Los filtros de vidrio fueron puestos a la estufa durante la noche a 105º C y luego dejados enfriar en un desecador y pesados. La desaparición de la materia seca fue expresada como una proporción de la materia seca inicial.

Análisis estadístico. Los datos de producción acumulada de gas (PAG) fueron corregidos a 1 g de materia seca. La cinética de producción de gas (desde las 12 horas de incubación) fue descrita ajustándose a la ecuación exponencial y = a+b (1-exp (-ct)), (Orskov y McDonald, 1979), donde:

y = gas producido al tiempo t
a = es intercepto de la función
b = gas producido en el tiempo infinito de incubación
c = tasa fraccional de cambio en producción de gas

La PAG después de 12, 21,27, 48 y 96 horas fue usada para la comparación entre sustratos. Se realizó un análisis de varianza en un diseño completamente al azar, con un arreglo factorial de 2 x 2, considerando tipo de muestra de forraje obtenido (FD y FA) y altura de pradera (PA y PB), para evaluar si existían diferencias en la cinética degradativa usando la técnica in vitro de producción de gas. Estos análisis se realizaron utilizando el programa estadístico Genstat (1987).

La composición nutritiva de los forrajes en estudio se presenta en la cuadro 1. Las muestras de FD a ras suelo mostraron concentraciones mayores de FDN y FDA y menores de proteína cruda que en el forraje aparentemente consumido. Estos valores no se compararon estadísticamente, por carecerse de repeticiones (muestras compuestas).

Los volúmenes de gas acumulado en diferentes tiempos para los forrajes son presentados en la cuadro 2. Se observa para todos los tiempos de incubación una mayor producción de gas en el FD a ras del suelo que en el FA consumido por el animal, la cual sólo fue significativa sólo hasta las 27 horas (P<0.05). Esta mayor producción de gas acumulada indica que el FD fermenta más rápidamente que el FA consumido. Sin embargo, a partir de las 27 horas (cuadro 2) de incubación no hubo diferencias significativas entre los forrajes estudiados (P>0.05), en producción de gas acumulado ni en la tasa de fermentación en el período total (cuadro 3). La altura de la pradera no tuvo efecto sobre los parámetros estudiados (P>0.05).

El cuadro 3 muestra que la desaparición de materia seca in vitro después de 96 horas de incubación fue mayor para el FA consumido (P<0.001), pero no hubo diferencias en la producción acumulada de gas (P>0.05).

El bovino en pastoreo selecciona una dieta que contiene una mayor proporción de hojas verdes y una menor proporción de tallos y material muerto, en relación al que se encuentra disponible en el forraje total (Hodgson, 1990). Este proceso selectivo aparecería evidenciado en las muestras de los forrajes en estudio (FD y FA), indicando a la vez que la selección del FA consumido por los bovinos fue adecuada.

La tasa y extensión de la fermentación de un sustrato puede ser determinada midiendo la producción de gas acumulada y el volumen de gas que refleja la producción de ácidos grasos volátiles y la producción de CO₂ y CH₄ (Kibon y Orskov, 1993). Se ha demostrado (Blümmel y Orskov, 1993; Blümmel y Bullerdieck, 1997), que la proporcionalidad de los ácidos grasos volátiles en el gas fermentado influye sobre el de volumen de gas producido, ya que sólo la fermentación de acetato y butirato produce CO₂ y posteriormente metano. Este comportamiento (cuadro 2) podría observarse hasta las 27 horas de incubación en este trabajo al comparar la producción de gas acumulada del FD y del FA. Prasad y col. (1994) agregan que la producción de gas después de 12 horas de incubación es un indicador de fermentación inicial y después de 52 horas es un indicador de extensión de fermentación in vivo.

Valores observados de producción acumulada de gas (ml /g MS) a diferentes tiempos de incubación (PAG), de muestras de forraje disponible (FD) a ras de suelo y de forraje aparentemente (FA) consumido, a dos alturas, baja (PB) y alta (PA).

Cumulative gas production (ml/g DM) for forages samples of herbage mass (FD) and simulated grazing samples (FA), at two sward height, low (PB) and high (PA).

Horas	Producción Acumulada de Gas (PAG)
Horas	12	21	27	48	96
Muestras de forraje (Forages samples)
FD	161.7	217.6	242.1	290.2	315.5
FA	150.6	209.2	234.7	285.7	309.6
Sig.	**	**	**	NS	NS
Altura de pradera (Sward height)
PA	155.0	212.6	237.8	288.0	312.8
PB	157.3	212.6	237.8	287.9	312.3
Sig.	NS	NS	NS	NS	NS
s.e.d.	4.23	3.65	3.34	3.60	4.52
Interacción
Muestras de forraje x altura de pradera.	NS	NS	NS	NS	NS

	Cinética producción gas
	DMS96	b (ml)	c (h-1)
Muestras de forraje (Forages samples)
FD	0.873	317.7	0.048
FA	0.908	312.2	0.050
Sig.	***	NS	NS
Altura de pradera (Sward height)
PA	0.891	315.4	0.049
PB	0.890	314.6	0.049
Sig.	NS	NS	NS
s.e.d.	0.005	4.75	0.000
Interacción
Muestras de forraje x altura de pradera.	NS	NS	NS

En este experimento, probablemente la menor producción de gas en el FA consumido (cuadro 2) podría haber sido resultado de una mayor cantidad de sustrato fermentable capaz de producir ácido propiónico y por lo tanto una menor producción de gas, concordando con lo señalado por Blümmel y Orskov, (1993), ya que estas mismas muestras de forraje mostraron mayores valores de degradabilidad inicial in vivo (Pulido, 1997). Además, Blümmel y col. (1994) señalaron que en un tiempo de incubación de 24 horas todo el sustrato celular soluble debería estar fermentado. Asimismo, Menke y col. (1979) indicaron que la producción de gas reflejaba más el contenido de carbohidratos digeribles que los de proteína y grasa digeribles. Por lo tanto, el volumen de gas producido refleja la fermentación del sustrato hacia la formación de ácidos grasos volátiles y así participa como un estimador de la digestibilidad aparente en el rumen (Blümmel y Orskov, 1993).

A partir de las 27 horas de incubación no hubo diferencias en producción de gas acumulado entre los forrajes estudiados (cuadro 3). Por lo tanto, es posible suponer que a partir de esta hora de incubación la estequiometría de la fermentación tomó vías similares para los sustratos en estudio. Además, Blümmel y Orskov (1993) indican que las fermentaciones secundarias producto de la fermentación de las bacterias muertas y desechos celulares podrían ser una fuente de error en el análisis de producción in vitro de gas.

La mayor desaparición de materia seca después de 96 horas de incubación para el FA consumido (cuadro 3) coincide con la desaparición de materia seca in vivo a las 72 horas para las mismas muestras (Pulido, 1997) y con lo expuesto anteriormente en relación a la estequiometría de la fermentación. Por lo tanto, sustratos con diferentes composiciones pueden tener diferentes características de fermentación in vitro, dependiendo de si ellos son medidos en base a producción de gas o desaparición de materia seca (Sampath y col., 1995). La correcta interpretación de las relaciones observadas entre tasa de producción de gas y tasas de desaparición del sustrato (tasa de degradabilidad) requiere la elaboración de balances estequiométricos que permitan asociarla producción de gas con los compuestos orgánicos (Pichard, Troncoso y Bruni, 1995). Entonces, es posible esperar que la desaparición de materia seca indicaría cuánto de sustrato estuvo disponible para la fermentación y la producción acumulada de gas, y de cómo este sustrato fue usado para la producción de gas (Blümmel y Orskov, 1993).

La técnica in vitro de producción de gas parece ser una herramienta útil para estudiar las características de degradabilidad ruminal de la materia seca en el ID en la pradera y el FA consumido. Sin embargo, la asociación, ya sea con el estudio estequiométrico de los gases producidos, y/o de la desaparición de la materia seca a un tiempo definido, posibilitarían una mejor comprensión de la utilización del sustrato a nivel ruminal.

Se evaluó la dinámica fermentativa de forrajes, en muestras de una ID, manejada a dos alturas. Las muestras consistieron en forraje disponible a ras de suelo y en forraje aparentemente consumido (FA) por vacas lecheras en pastoreo continuo. La cinética de fermentación de los forrajes se estudió usando la técnica in vitro de producción periódica de gas, utilizando un mismo frasco de fermentación, de Theodorou y col (1994). Los datos de producción acumulada de gas fueron corregidos a 1 g de materia seca, y fueron descritos ajustándolos a la ecuación exponencial de Orskov y McDonald (1979). La producción de gas acumulada (ml/g) fue mayor (P<0.05) para el FD a ras de suelo que para el FA consumido para las 12, 21, y 27 horas de incubación (161.7 v/s 150.6 , s.e.d.= 4.23 ; 217.6 v/s 209.2, s.e.d.= 3.65; y 242.1 v/s 234.7, s.e.d.= 3.34, respectivamente). Después de 27 horas de incubación, no se detectó ningún efecto significativo entre FD y el FA (P>0.05) en la cantidad de gas producido ni en la dinámica fermentativa de estos forrajes. Sin embargo, la digestibilidad de la materia seca (g/r) para el FD a ras de suelo, fue significativamente menor (P<0.05) que en el FA consumido medido a las 96 horas de incubación (0.908 v/s 0.873, s.e.d.= 0.005), pero sin efecto de la altura de pradera (P>0.05). Estos resultados evidencian el beneficio de complementar el registro de la producción acumulada de gas in vitro con el análisis de los constituyentes del gas fermentado y con determinaciones de residuos de la digestión, a fin de mejorar el entendimiento del proceso fermentativo a nivel ruminal.
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Aceptado: 25.08.98.

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