COMUNICACIONES
L. VON BAER, M.V.; C. HELLEMANN, M.V., Dr. Med. Vet.
A semen collection technique with artificial vagina was tested and seminal variables recorded in order to establish possible fertility predictor parameters in male llamas. From 11 of 18 males 72 ejaculates were collected. Seminal variables of 26 ejaculates were submitted to descriptive statistics, after rejection of 31 due to azoospermia or akinozoospermia and 15 in account of missing values.
The recorded means were: volume 3.5 ml, pH 8.6, sperm concentration 84.7 x 103/mm3, normal spermatozoa 32.5%, free heads 6.4%, abnormal heads 6.5%, abnormal midpieces 39.9%, bent tails 8.8%, curled tails 5.3%, motility of native (MOT1) 25.5% and extended semen (MOT2) 32.6%.
Spearman correlation of variable "normal sperm" to MOT1 (r = .39) and MOT2 (r = .46) was significant (p 2 0.5). On the contrary, no significance was found correlating the variable "abnormal midpieces" to MOT. Considering that the tested males had shown normal fertility, the missing significance of the high rates of abnormal midpieces, mitocondrial sheets and proximal protoplasmic droplets suggests that they are of minor importance for fertility.
Palabras claves: llama, colección semen, variables seminales.
Key words: llama, semen collection, semen variables.
INTRODUCCION
La literatura presenta una cantidad apreciable de trabajos sobre camélidos, alpacas y llamas, que abarcan el estudio de su manejo y de la fisiología reproductiva, particularmente de las hembras (Jessup y Lance, 1982; Pugh y Montes, 1994; Bravo, 1994; Smith y col., 1994), incluyendo la aplicación de biotecnología en la recuperación y transferencia de embriones (Gatica y col., 1994; Bourke y col., 1995; Del Campo y col., 1995).
En cambio, son escasas las publicaciones referentes a la obtención, conservación y aplicación del semen (Graham y col., 1978; Sumar y Leyva, 1981; McEvoy y col., 1992; Fernández-Baca, 1993). En trabajos más recientes Gauly (1995) y Lichtenwalner y col. (1996a) describen nuevas técnicas de colección y de protección al semen de los descensos de temperatura durante el prolongado apareamiento y resumen los parámetros seminales obtenidos.
Siendo escasos los estudios y amplios los rangos de los parámetros seminales descritos en llamas, no hay datos que señalen un nivel bajo el cual pueda presumirse una fertilidad alterada. Los criterios habituales (volumen, motilidad, concentración, morfología espermática) para la evaluación del semen en otras especies son de difícil aplicación en la llama, debido a la viscosidad de los eyaculados (McEvoy y col., 1994), que no permiten una preparación adecuada de las muestras para examen (Bravo y col., 1997) y no reflejan necesariamente las características de un eyaculado natural (Johnson, 1989).
Son particularmente contradictorios los parámetros de motilidad y malformaciones espermáticas determinados por diferentes autores. Así Sumar (1991) cita a Mogrovejo (1952), quien encontró 41.2% de células malformadas, como también a Palomino (1962), quien sólo encontró un promedio de 11.6%. Mediante tinción supravital de eosina Gauly (1995) registró un 85% de espermios vivos con bajo porcentaje de malformaciones espermáticas. Lichtenwalner y col. (1996b) determinaron una motilidad de 23.7% (± 20), estimando en 60.3% (±18,5) la cantidad de espermatozoides morfológicamente anormales.
En el presente trabajo básicamente se ensayó la técnica de colección descrita por Gauly (1995), con el objeto de probarla en un grupo de machos de un criadero y registrar los parámetros seminales obtenidos.
MATERIAL Y METODOS
Se utilizaron animales pertenecientes al Criadero Llamas del Sur, ubicado a 12 km al este de la ciudad de Temuco. Los animales fueron mantenidos a pastoreo rotacional en pradera natural mejorada, principalmente con ballicas y festuca, suplementados con heno en períodos de escasez. El período de colecciones se extendió desde julio de 1996 hasta agosto de l997.
Como dadores de semen se seleccionaron 11 de 18 machos adultos de 3 a 6 años de edad, dóciles y de fácil manejo, con fertilidad comprobada por la existencia de descendencia. Como celadoras sirvieron 3 hembras igualmente dóciles con ciclos reproductivos normales.
Se utilizaron vaginas artificiales habituales para carneros, preparadas a 38-39ºC, envolviéndolas en un cojín térmico conectado a la energía eléctrica a través de un reóstato.
Las colecciones seminales se realizaron aprovechando los reflejos de cópula de la especie a nivel del suelo (apareamientos naturales en decúbito esternal), desviando el pene hacia la vagina artificial. Hasta donde fue posible se trató de evitar la salida del pene de la vagina durante los movimientos de reacomodación de los machos, o se les presentó nuevamente después de las habituales interrupciones de la cópula, hasta completar períodos de 10 a 15 minutos. Se registró la aceptación de los machos a la colección y el tiempo de cópula.
Para el procesamiento y evaluación del semen se contó con un laboratorio adyacente a la sala de colección, dotado del equipamiento para este fin. Se evaluaron las siguientes variables: volumen, pH (papel indicador), concentración (cámara de Neubauer, dilución 1:100 en agua destilada), motilidad (MOT), de semen nativo (MOT1)y de semen diluido (diluyente Tris) (MOT2), y morfología espermática (semen diluido 1:1 en solución citrato de Na 3%) de frotis teñidos con Spermac Stain®*. La MOT fue estimada sobre platina temperada con microscopio de contraste de fases (x100) y la observación de los frotis teñidos fue a campo claro (x1000).
El análisis de los parámetros registrados se hizo mediante estadística descriptiva. Se estableció la correlación no paramétrica (Spearman, Statgraf 4.2) entre las variables seminales independientes y la motilidad, tanto de semen nativo como de semen diluido.
RESULTADOS Y DISCUSION
En la tabla 1 se resume el trabajo de selección de los machos y de los eyaculados que se utilizaron para la evaluación de los parámetros seminales.
| N | Descartados | Utilizados | |
| Machos probados |
18 | 7-(39%) | 11 |
| Eyaculados colectados | 72 | 31 (*) - (43%) | 41 |
| Eyaculados evaluados (**) | 26 | 15 - (37%) | 11 |
(*) Eyaculados sin espermatozoides o sin motilidad espermática
(**) Se descartaron de la evaluación eyaculados colectados en el período inicial, que no fueron sometidos a dilución.
El descarte de los machos se debió principalmente a indocilidad, como también al rechazo a la vagina artificial. Sólo el 57% del total de eyaculados colectados mostró algún porcentaje de movimiento espermático, movimiento que en semen nativo fue predominantemente de tipo local. Los descartes se debieron a oligospermia, oligozoospermia, akinozoospermia y azoospermia.
Los parámetros seminales registrados en los eyaculados considerados en la evaluación se presentan en la tabla 2.
En general, la manipulación del semen para la preparación de muestras de examen estuvo dificultada por la viscosidad de los eyaculados, lo que contribuyó a diferencias del N computado de algunas variables. Tanto en nuestro trabajo, como en el de los otros autores (Lichtenwalner y col., 1966b; Gauly, 1995), la medición del volumen de los eyaculados pudo llevar a imprecisiones, provocadas por el carácter viscoso del semen y la abundante espuma que presenta, aun bastante tiempo después de la colección, y cuya desintegración hace disminuir a la mitad el volumen seminal medido inicialmente.
El aspecto viscoso del semen, también descrito por Fernández-Baca y Calderón (1966), Sumar (1991) y Bravo y col. (1997), no tiende a la licuefacción como en semen humano. Su carácter filante dificulta la confección de frotis, como también la succión y vaciado de las micropipetas en la preparación de muestras para la determinación de concentración. Por tal motivo, los recuentos deben ser valorados con mesura. La concentración espermática media de 84.7 x 103 espermatozoides/mm3 obtenida en el presente trabajo difiere sensiblemente de la concentración media de 53.4 x 103 reportada por Gauly (1995), siendo ambos valores muy superiores al 10 x 103 descrito por Lichtenwalner y col. (1996b). Todos los valores mencionados de concentración seminal en llamas son inferiores al promedio de 150 x 103 descrito por Bravo y col. (1997) en alpacas.
Las mediciones de pH realizadas dieron regularmente valores entre 8 y 9, algo mayor al pH 7.7 medido también con papel indicador por Gauly (1995) y cercano al pH 8.1 (±0.1) reportado por Lichtenwalner y col. (1996b), sin indicación del procedimiento utilizado.
| N | Media | Mínimo | Máximo | Desv. est. | |
| Tiempo de colección (min) | 26 | 11.2 | 5.0 | 15.0 | 2.6 |
| pH del semen | 20 | 8.6 | 8.0 | 9.0 | 0.3 |
| Volumen (ml) | 26 | 3.5 | 1.0 | 7.0 | 1.7 |
| MOTI (% motilidad semen nativo) | 26 | 25.5 | 0.0 | 60.0 | 18.7 |
| MOT2 (% motilidad semen diluido) | 25 | 32.6 | 0.0 | 60.0 | 23.4 |
| Concentración (x 103 esp./mm3) | 23 | 84.7 | 5.0 | 405.0 | 88.8 |
| Espermatozoides normales (%) | 26 | 32.5 | 0.0 | 80.0 | 22.3 |
| Cabezas desprendidas (%) | 26 | 6.4 | 1.0 | 20.0 | 4.4 |
| Cabezas malformadas (%) | 26 | 6.5 | 1.0 | 30.0 | 6.1 |
| Piezas intermedias malformadas (%) | 26 | 39.8 | 7.0 | 76.0 | 21.2 |
| Flagelos flectados (%) | 26 | 8.8 | 0.0 | 26.0 | 7.9 |
| Flagelos enrollados (%) | 26 | 5.3 | 0.0 | 15.0 | 4.3 |
La motilidad media de 25.5% registrada en semen nativo es algo mayor que el 23.7% ± 2.0 obtenido por Lichtenwalner y col. (1996b). Sin embargo, la dilución mejoró la motilidad espermática, alcanzando un promedio de 32.6% con una notoria mejoría de la intensidad del movimiento, manifiesta por un incipiente movimiento progresivo. La causa del incremento del movimiento espermático tras la dilución podría deberse a la disminución de la viscosidad del semen por la incorporación del diluyente, como también a su contenido en azúcares metabolizables por las células espermáticas.
El recuento de alteraciones morfológicas, resumidas en la tabla 2, evidenció que sólo un promedio de 32.5% de espermatozoides aparecían morfológicamente normales, proporción notoriamente más baja que en la mayoría de los animales domésticos. Dentro de las malformaciones registradas, predominaron las de piezas intermedias, con engrosamiento y falsa gota citoplasmática proximal, también descritas por Mogrovejo (1952) y Bravo y col. (1997), aplasias segmentarias de vaina mitocondrial y desmembramiento fibrilar. Dentro de las malformaciones de cabeza destacan microcefalias, malformaciones primarias de acrosoma y distribución granular de la cromatina. El porcentaje de malformaciones es algo menor al 39.7% (± 18.5) reportado por Lichtenwalner y col. (1996b) y al 41.2% reportado por Mogrovejo (1952).
Los desvíos apreciables del promedio de malformaciones espermáticas evidencian diferencias individuales entre los machos. Es posible que la gran proporción de espermatozoides malformados o alterados sea consecuencia del hábitat para esta especie, cuyas condiciones de crianza en el valle central chileno contrastan con las condiciones de temperatura y ambiente del altiplano. Considerando que gran parte de las colecciones de semen fueron efectuadas en el período de sequía del otoño de 1997, es posible que las condiciones ambientales hayan repercutido negativamente sobre los parámetros seminales, al afectar la termorregulación corporal y, particularmente, testicular.
La correlación entre las variables seminales y la motilidad del semen
se resumen en la tabla 3.
De la tabla 3 se desprende que el promedio cercano a 40% de malformaciones de
pieza intermedia, registradas en la tabla 2, no tiene
un efecto significativo sobre la motilidad espermática. Debido a que
las referidas dispermias fueron observadas en machos de fertilidad aparentemente
normal, posiblemente deban considerarse como malformaciones menores que, al
no alterar el núcleo de la célula espermática, no inciden
sobre la fertilidad.
| MOTI (semen nativo) |
MOT2 (semen diluido) |
|
| r | r | |
| Volumen | .30 | .53** |
| Concentración | .30 | .09 |
| Espermatozoides normales | .39* | .46 |
| Cabezas despendridas | .27 | .21 |
| Cabezas malformadas | -.03 | -.14 |
| Piezas intermedias malformadas | -.30 | -.22 |
| Flagelos flectados | -.25 | -.64** |
| Flagelos enrollados | -.05 | -.22 |
(*) p < 0.05; (**) p < 0.01
RESUMEN
El objetivo del trabajo fue el ensayo de una técnica de colección de semen de llamas (Lama glama) con vagina artificial y el registro de variables seminales, tendiente a estudiar parámetros indicadores de la fertilidad potencial del macho. De 18 machos en edad reproductiva de un criadero se seleccionaron 11, de los cuales se obtuvieron 72 eyaculados. Descartados 31 eyaculados por azoospermia o akinozoospermia y 15 en que no se obtuvieron todos los registros, quedaron 26 eyaculados cuyas variables se sometieron a estadística descriptiva.
Las medias obtenidas fueron: volumen 3.5 ml, pH 8.6; concentración 84.7 x 103/mm3; espermatozoides normales 32.5%; cabezas desprendidas 6.4%; cabezas malformadas 6.5%; piezas intermedias malformadas 39.9%; flagelos flectados 8.8%; flagelos enrollados 5.3%; motilidad de semen nativo (MOT1) 25.5% y de semen diluido (MOT2) 32.6%.
La correlación de la variable "espermios normales" con MOT1 (r = .39) y MOT2 (r = .46) fue en ambos casos significativa (p<0.05). En cambio, con la variable "piezas intermedias malformadas", que por su magnitud hacía esperar una correlación negativa con la motilidad, no se encontró significancia. Considerando que los machos utilizados en el ensayo tenían antecedentes de fertilidad normal, permite suponer que las piezas intermedias engrosadas, alteraciones de la espiral mitocondrial y las gotas citoplasmáticas proximales profusamente observadas, sean de importancia menor para la fertilidad.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Centro de Inseminación de la Universidad Austral
de Chile las facilidades otorgadas para el uso de su equipamiento.
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Aceptado: 07.07.98.
* Investigación financiada
por FONTEC-CORFO
(Código Fontec Nº 95-0638).
* Spermac®. Minitüb
GmbH, Hauptstrasse 41,
D-84184 Tiefenbach, Germany.
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