N. TADICH¹, M.V., Ph.D.; P.F. NETTLETON², M.V., Ph.D.; K.L. MORGAN³, M.V., Ph.D.; A. HODGSON³, M.V.; R. MACAULAY³, M.V.; G.REINHARDT⁴, M.V., Dr. med. vet.; S. RIEDEMANN⁴, M.V.

SUMMARY

In order to determine the presence of antibodies against the Border disease (BD) virus, 147 blood samples were obtained from 2 large sheep farms (more than 2000 sheep each) and 20 small holdings (less than 30 sheep each) in the south of Chile.

Blood samples were taken from the jugular vein, using sterile plain vacutainers. Sera was separated by centrifugation, frozen and stored at -20°C until tested. Border Disease antibodies were detected using a double- monoclonal-antibody capture - ELISA. A reciprocal titre of 3 100 was considered positive.

Sheep with antibodies to BD where detected on 23 % (5/22) of the sheep farms. The seroprevalence in individual flocks was 8.5%, overall ranging from 0% to 42.8%. In spite of the percentage of sheep farms positive to BD, no clinical cases were reported.

This is the first study that shows the presence of serologically positive animals to BD in Chile. Other studies are needed in order to determine the prevalence of the disease in the sheep populations and the strains of the virus present in Chile.

Palabras claves: Border disease, seroprevalencia, anticuerpos, ovinos.

Key words: Border disease, seroprevalence, antibodies, sheep.

INTRODUCCION

Border disease (BD) es una afección neurológica de los corderos recién nacidos caracterizada por temblores musculares, malformaciones esqueléticas, retardo del crecimiento y un vellón anormal con características de pelo (Nettleton, 1991). La enfermedad fue descrita por primera vez por Hughes y col. (1959), en la región comprendida entre Gales e Inglaterra, de allí su nombre. Desde entonces ha sido reportada en distintas partes de Inglaterra, Escocia, Irlanda, USA, y diversas partes de Europa (Hussin y Woldehiwet, 1994).

La enfermedad es producida por un virus serológicamente relacionado con el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y fiebre porcina clásica; estos tres virus están agrupados en el género Pestivirus, familia Flaviviridae (Nettleton y Entrican, 1995). La diferenciación entre los virus que produce BVDV y BD no es tan clara, los aislados del bovino pueden infectar al ovino y viceversa (Carlsson y Belak, 1994; Campbell y col., 1995). Los antecedentes actuales sugieren que los pestivirus causantes de BD podrían ser estados evolucionarios más jóvenes que los virus que producen BVDV, habiendo tenido una menor cantidad de mutaciones (Nettleton y Entrican, 1995).

La prevalencia de la enfermedad puede variar entre un 0% y un 50% (Heckert y col., 1994; Tabbaa y col., 1995; Nettleton y Entrican, 1995).

La principal fuente de contaminación es la saliva de los animales persistentemente infectados, aunque también se encuentran grandes cantidades del virus en la orina y sangre, siendo menos frecuente su presencia en las heces (Terpstra, 1981). De esta forma la transmisión del virus se produce, principalmente por contacto directo, a través de la orofaringe, por vía vertical de la madre a la progenie y por transmisión mecánica a través de inyecciones intramusculares, subcutáneas, endovenosas o vacunaciones con virus vivo contaminadas con pestivirus (Hussin y Woldehiwet, 1994).

La infección en los ovinos adultos o en los recién nacidos sanos con una ingesta adecuada de calostro sólo produce fiebre moderada y una leucopenia transitoria, debida a una disminución de los linfocitos T y B. Cuando el virus infecta a hembras ovinas gestantes, cruza rápidamente la barrera placentaria y puede producir abortos tempranos, tardíos, o partos prematuros. Si la infección se produce entre los días 16 y 80 de la gestación, nacen corderos inmunotolerantes y persistentemente infectados; estos corderos son débiles y pueden presentar diversos signos clínicos, constituyéndose en la principal fuente de infección para los rebaños (Terpstra, 1981; Fenton y col., 1991; Carlsson, 1991).

Los corderos afectados son generalmente pequeños, débiles y de mala conformación, la espalda es corta y arqueada y la cabeza tiende a ser aguzada, algunos presentan dificultades para pararse y debido a un incremento de los folículos primarios se produce un aumento en la cantidad de pelos largos en el vellón, los que forman un halo especialmente sobre el cuello y espalda. Los signos nerviosos se deben a una demielinización del SNC y los más frecuentes son: contracciones musculares de los miembros anteriores y espalda, temblores musculares de la cabeza, orejas y cola, apoyo de la cabeza contra objetos, ceguera, nistagmos y anormalidades de la marcha. Estos signos pueden desaparecer con la edad, pero los corderos presentan un crecimiento menor al de sus contemporáneos, incluso muchos mueren antes del destete (Nettleton, 1991).

Otra forma de la enfermedad es la conocida como "Enfermedad de Ayveron" o "enterocolitis leucopénica ovina", reportada en 1983 en Francia. Su causa, aunque no ha sido identificada con exactitud, se cree es debida a una cepa muy patogénica de BD. Los signos principales son depresión, pirexia y diarrea; las ovejas que se recuperan producen corderos con una baja viabilidad y con signos nerviosos (Nettleton y Entrican, 1995).
La enfermedad tiene importancia económica debido a su impacto en los índices reproductivos, así como su efecto en la mortalidad neonatal y crecimiento de los corderos (Roeder y col., 1983; Bonniwell y col., 1987).
Los autores no están en conocimiento de reportes previos de seroprevalencia de Border disease en Chile. Sin embargo, se sospechaba de su presencia en base a los hallazgos serológicos de Riedemann y col. (1991), y según informaciones proporcionadas por médicos veterinarios y ovejeros acerca de la presencia de signos clínicos similares a los descritos para la enfermedad.

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia y seroprevalencia de anticuerpos contra BD en algunas ovejerías grandes y pequeñas del sur de Chile.

MATERIAL Y METODOS

Se obtuvieron 272 muestras de sangre de 22 ovejerías de la X Región, Chile. Las ovejerías fueron seleccionadas por conveniencia, en base a su deseo de participar y fácil acceso, y se dividieron en: dos ovejerías grandes, con más de 2.000 ovejas cada una, y 20 pequeñas con menos de 30 ovejas cada una. De las ovejerías grandes, A y B se obtuvieron, cuando fue posible, 25 muestras de sangre de borregas de dientes deciduos, 25 de dos dientes, 25 de cuatro dientes, 25 de seis dientes y 25 de boca llena, completando de esta forma 75 y 72 muestras de sangre, respectivamente. De las pequeñas se obtuvieron dos o más muestras de ovejas de las mismas edades cuando éstas estaban representadas en el predio.

La sangre fue extraída por venopunción yugular, utilizando tubos estériles, al vacío y sin anticoagulante. Posterior a la obtención, las muestras fueron transportadas inmediatamente al laboratorio de Patología Clínica Veterinaria de la Universidad Austral de Chile, donde se centrifugaron a 3.000 rpm para separar el suero y este se almacenó a -20°C hasta su posterior análisis.

La determinación de anticuerpos contra BD se realizó en el Moredun Research Institute, Edinburgo, UK, usando la prueba inmunoenzimática de ELISA de doble captura con anticuerpos monoclonales, VPM 22 y 13G4 (Fenton y col., 1991). Los sueros fueron considerados positivos cuando presentaron un título recíproco igual o mayor de 100. Los principios de la prueba de ELISA utilizada se presentan en el siguiente diagrama.

RESULTADOS Y DISCUSION

Un 23% de las ovejerías muestreadas (5/22) tuvieron títulos positivos a BD.

La seroprevalencia promedio de los rebaños individuales estudiados fue de un 8,5%. Sin embargo, ésta varió entre ovejerías de un 0% a un 42.8% (tabla 1). Las ovejerías B y C-6 presentaron cinco y dos ovejas, respectivamente, con títulos superiores a 3.000. Esto concuerda con sus altos porcentajes de prevalencia.

El mayor porcentaje de seropositividad se encontró entre aquellas ovejas de boca llena, aunque en el caso de la ovejería B, un 30% de las borregas presentaron títulos positivos. Por el contrario, las borregas de los pequeños agricultores no presentaron títulos positivos a BD (tabla 2).

De acuerdo a los antecedentes conocidos por los autores, los resultados de este estudio indicarían, por primera vez, la presencia de animales seropositivos a Border disease en Chile.

La presencia de anticuerpos contra BD no es de extrañar, considerando que un alto porcentaje de la masa bovina en Chile es positiva a BVDV (Reinhardt y col., 1990) y al hecho de que se han reportado infecciones cruzadas entre ambas especies (Carlsson y Belak, 1994; Campbell y col., 1995), las cuales frecuentemente copastorean en nuestro país. Por otra parte, Riedemann y col. (1991) en un estudio realizado en 11 ovejerías grandes y medianas del sur de Chile, encontraron un 18% de seropositividad a la reacción cruzada con el virus de BVDV. Ya que esta prueba no es específica para determinar la presencia de anticuerpos contra BD, sólo se consideró como altamente sugestiva de la presencia del virus en los rebaños ovinos.

De acuerdo con Carlsson (1991), la seroprevalencia de la enfermedad en ovinos puede ser de un 4% a un 11%. Estas cifras varían de acuerdo con los hallazgos de distintos autores; Heckert y col. (1994), en Canadá, reportaron prevalencias de un 0.9% (5/540 ovejas), siendo positivas un 20% (6/15) de las ovejerías muestreadas. Tabbaa y col. (1995), en un estudio seroepidemiológico en 13 provincias de Siria, encontraron una prevalencia promedio de 45.2%, variando ésta de acuerdo al sistema de manejo de las ovejas; los rebaños trashumantes tuvieron un 14% más de ovejas positivas que los sedentarios. Sawyer y col. (1986) reportaron un 82% de ovejas infectadas en un brote de BD en un rebaño de ovejas Hampshire en USA.

La seroprevalencia de la enfermedad en las diferentes ovejerías muestreadas varió desde 0% a un 42.8%. Sin embargo, es interesante el hecho de que ambas ovejerías grandes, donde el rubro ovino es una fuente importante de ingresos, fueron positivas con prevalencias de un 5.3% para la ovejería A y un 19.4% para la ovejería B. La seropositividad de los animales indica que ha existido un contacto previo con el virus, pero no nos indica si corresponde a una infección activa, excepto en el caso de las ovejas que tuvieron títulos de 3.000. Para conocer esto se deberían haber efectuado muestreos seriados.

En el caso de la ovejería B se puede asumir que existe una transmisión activa de la infección entre miembros del rebaño, ya que los animales más jóvenes borregas presentaron un 30.8% de positividad, a diferencia de las otras ovejerías en que el segmento de animales jóvenes tuvo prevalencias muy bajas o no tuvo seropositivos. En el caso de los animales persistentemente infectados, éstos no presentan títulos al virus, ya que al momento de la infección no son inmunocompetentes (Terpstra, 1985; Carlsson, 1991) y posterior al nacimiento el virus seroneutraliza los anticuerpos maternos (Sawyer y col., 1986).

La transmisión del virus en el rebaño se debe principalmente a contactos directos entre animales sanos y ovinos persistentemente infectados que eliminan el virus en forma permanente (Barlow y col., 1980); los corderos persistentemente infectados comienzan a eliminar el virus tan temprano, como al mes de edad (Sawyer y col., 1986). Los animales que se infectan en períodos diferentes a los 16 a 80 días de gestación no son una fuente importante de infección para el rebaño, ya que después de un período corto de viremia producen inmunidad al virus. Otras vías son las infecciones cruzadas entre ovinos y bovinos infectados con BVDV (Carlsson, 1991; Carlsson y Belak, 1994; Campbell y col., 1995); también existiría la posibilidad, bastante remota, de infecciones cruzadas con rumiantes de vida libre, como los ciervos, cuando existe copastoreo con estas especies (Nettleton y Entrican, 1995).

Llama la atención que aunque la seroprevalencia en algunos de los rebaños muestreados fue alta (rebaño B y C-6) no se hayan detectado hasta el momento casos clínicos de la enfermedad. Esto concuerda con lo encontrado por Tabbaa y col. (1995). Las razones para esto son diversas, una de ellas puede ser una cronicidad de la infección en el rebaño, por lo que la presencia de anticuerpos sólo indicaría un contacto previo con el virus, pero no una infección reciente. Cuando el virus ingresa por primera vez en un rebaño, es cuando produce la mayor cantidad de problemas clínicos (Carlsson, 1991; Campbell y col., 1995). Otra razón puede ser una baja patogenicidad de la cepa del virus presente en nuestros rebaños. Infecciones por cepas de BD de baja patogenicidad han sido descritas por Bonniwell y col. (1987); estas cepas sólo produjeron baja fertilidad, leve retraso en el crecimiento de corderos persistentemente infectados, sin signos clínicos y escasos cambios patológicos. También se debe considerar la posibilidad de que los abortos y partos prematuros producidos por la presencia del virus sean atribuidos a otros agentes. Considerando que los sistemas de producción ovina en el sur de Chile son básicamente extensivos, en el caso de los corderos nacidos con problemas neurológicos es difícil que éstos sobrevivan las primeras horas de vida; en aquellos casos leves los signos desaparecen con la edad y sólo se manifestarían como una falta de desarrollo.

La técnica de ELISA empleada en este estudio tiene una baja correlación cuantitativa, pero una buena correlación cualitativa con la técnica de seroneutralización (SN). La diferencia entre ambas radica en que la SN mide los anticuerpos que se adhieren a los epítopes en la superficie del virus, mientras que la prueba de ELISA utilizada en este estudio mide los anticuerpos (proteínas no estructurales p125/p80) contra el antígeno viral adherido a los anticuerpos monoclonales (Fenton y col., 1991).

Debido a que este estudio es una investigación preliminar, se consideró importante utilizar títulos de 1:100, para una determinación segura de la prevalencia de la enfermedad. Si bien esto disminuye la sensibilidad de la prueba, aumenta su especificidad. En estudios realizados en Inglaterra se ha determinado que muestras que han sido almacenadas deficientemente muestran falsos títulos de 50 unidades de ELISA, incluso, en ausencia de evidencia clínica y patológica de la presencia de BD en la granja (Nettleton, comunicación personal).
Del presente estudio se puede concluir que la enfermedad conocida como Border disease está presente en la población ovina del sur de Chile, y que otros estudios son necesarios para determinar la prevalencia real de la enfermedad en la masa ovina y las cepas del virus presentes en nuestro país.

RESUMEN

Con el objetivo de determinar la presencia de anticuerpos contra el virus causante de la enfermedad conocida como Border disease, se obtuvieron 147 muestras de sangre de dos ovejerías grandes (más de 2.000 ovejas cada una) y 125 muestras de 20 ovejerías pequeñas (menos de 30 ovejas cada una), en el sur de Chile.

Las muestras se obtuvieron en forma estéril, con tubos al vacío, sin anticoagulante por venopunción yugular, el suero fue separado por centrifugación y las muestras congeladas a -20°C. La determinación de anticuerpos se realizó utilizando la prueba ELISA de doble captura con anticuerpos monoclonales. Títulos recíprocos 3100 fueron considerados como positivos.

Un 23% (5/22) de las ovejerías tuvo animales positivos a BD. La seroprevalencia promedio de los rebaños individuales fue de un 8.5% con un rango de 0% a un 42.8%. A pesar del porcentaje de ovejerías positivas, hasta el momento ninguna de ellas ha reportado casos clínicos de la enfermedad.

Este es el primer reporte serológico acerca de la presencia de la enfermedad en Chile. Otros estudios son necesarios para determinar la prevalencia de la enfermedad en la población ovina y las cepas del virus presentes en Chile.
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Aceptado: 01.09.98.

* Este trabajo se llevó a cabo como parte del vínculo académico entre la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile y la Escuela de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Bristol, financiado por el Consejo Británico.

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