SUMMARY

The infectious pancreatic necrosis virus, IPNV, is the etiological agent of a highly contagious disease that affects young salmon. If they survive, they become carriers and can transmit the disease. To contribute to the fast and effective diagnosis in fish with the acute infection, as well as of carrier fish, the use of a monoclonal antibody in the detection of the virus in experimentally infected animals was studied. Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and coho salmon (Oncorhynchus kisutch) fry infected with a Chilean IPNV isolate were used for the experience. To detect the viral antigens the ELISA immunodot and immunofluorescence methods were used.

The monoclonal antibody used allows the diagnosis of the virus in carriers in less than three days irrespective of whether the sample was obtained from a fish with the acute disease or from carrier fish. In the first case the ELISA and immunodot methods can be applied directly on extracts of whole fish. In the second, the extracts of the carrier fish organs should be amplified during one and a half-day in cultured cells before performing the assays. It was determined also that the time required for IPNV diagnosis in carrier fish can be further shortened if the monolayers were examined for specific immunofluorescence in the infected cells. Additionally, it was proved that carrier fish can be easily detected by means of the direct staining of imprints of organs of suitably sized fish.

Palabras claves: Virus IPN, anticuerpo monoclonal, ELISA, inmunodot, inmunofluorescencia.

Key words: IPN virus, monoclonal antibody, ELISA, immunodot, immunofluorescence.

INTRODUCCION

En muy poco tiempo Chile se ha convertido en el segundo productor mundial de peces salmonídeos y las proyecciones futuras de esta actividad, como asimismo, su estabilidad, dependen en gran medida del control de las enfermedades infecciosas que afectan a los peces en cultivo.

El virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus IPN, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa que afecta a peces jóvenes produciendo una muy alta mortandad. Los que sobreviven a la infección pueden convertirse en portadores que, en cualquier momento, pueden infectar animales susceptibles (Wolf, 1988). Por lo tanto, es de importancia contar con métodos que permitan identificar al virus en animales infectados con el objeto de considerar las medidas adecuadas para evitar su propagación, reducir las pérdidas por mortalidad y la eliminación de peces positivos.

El virus IPN, el cual pertenece a la familia Birnaviridae, ya ha sido detectado en Chile e incluso caracterizado bioquímicamente (McAllister y Reyes, 1984; Espinoza y col., 1985). La partícula viral consta de dos segmentos bicatenarios de RNA, los que codifican una RNA polimerasa, una proteína no estructural y dos proteínas estructurales (Dobos y Roberts, 1983).

Recientemente hemos preparado y caracterizado dos anticuerpos monoclonales (Ams) que reaccionan con cada una de las proteínas estructurales, la Vp2 y la Vp3/3a. El Am 14 lo hace con la Vp2 y el Am 1 con la Vp3/3a (Espinoza y col., 1993).

Esta investigación está dirigida a evaluar la utilidad de tres inmunoensayos que hemos desarrollado con estos Ams para la detección de los antígenos virales durante la infección experimental de truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y salmón coho (Oncorhynchus kisutch) con el virus IPN. Los métodos son ELISA, inmunodot en papel de nitrocelulosa (Espinoza y col., 1996) e inmunofluorescencia. El hecho de que estos anticuerpos reaccionen con los tres principales serotipos del virus IPN, Sp, Ab y VR299, los hace especialmente apropiados para su aplicación en procedimientos que interese verificar en forma rápida y generalizada la presencia o no del virus en pisciculturas y/o en ambientes naturales (Espinoza y col., 1996).

El método más sensible para diagnosticar la presencia de un virus consiste en la amplificación del virus, proveniente de extractos de órganos de animales infectados, en cultivos de líneas celulares. Luego de la manifestación del efecto citopático, el agente se identifica específicamente mediante métodos inmunológicos (Sanz y Coll., 1992; OIE Fish Diseases Manual, 1994). La dificultad de este método radica principalmente en el elevado número de días que se requiere hasta la obtención de resultados positivos, a menudo más de una semana. Sin embargo, si este método se aplica en combinación con un ensayo que permita la identificación del virus antes de la aparición del efecto citopático, el tiempo requerido para el diagnóstico es significativamente menor. A través de este trabajo queremos determinar en qué circunstancias estos métodos pueden ser aplicados directamente sobre muestras sospechosas de provenir de animales con el virus o bien aplicarlos previo a una etapa de amplificación del virus en células CHSE - 214. Adicionalmente, es de nuestro interés, para este último caso, establecer el período mínimo requerido para una amplificación suficiente que permita detectar precozmente al virus IPN.

Desde el punto de vista de la cantidad de virus presente en un pez infectado, se pueden distinguir básicamente dos situaciones que son necesarias de considerar al momento de elegir un método de diagnóstico, que el pez esté en una fase aguda de la infección o bien que se trate de un animal aparentemente sano y portador del virus. En el primer caso, la cantidad de virus presente en extractos de órganos puede ser al menos mil veces superior que en el segundo caso (Johansen y Sommer, 1995 ). Por lo tanto, el requerimiento de sensibilidad de los métodos de diagnóstico es claramente diferente para cada caso. Para ensayar los métodos que hemos puesto a punto es que usamos animales infectados experimentalmente, en los cuales podemos distinguir operacionalmente una fase aguda de la enfermedad y otra en la cual los animales recuperados de la enfermedad son portadores del virus.

MATERIAL Y METODOS

Células y virus. Se emplearon células CHSE-214 (ATCC CRL 1681), mantenidas a 20°C en Medio Esencial Mínimo (MEM), suplementado con 10 % de suero de bovino fetal, 2.2 g/l de bicarbonato de sodio y 50 mg/l de gentamicina. El virus utilizado fue aislado y caracterizado en Chile y es indistinguible del serotipo VR-299 (Espinoza y col., 1985). Para realizar los analisis de inmunofluorescencia las células se multiplicaron en cubreobjetos de vidrio, los cuales se mantuvieron a 20°C en multiplacas de plástico con 24 pocillos.

Anticuerpo monoclonal (Am). Se utilizó el Am1, el cual reacciona con la proteína Vp 3 / 4 del virus IPN. Este anticuerpo se preparó en conjunto con los Drs. Mikael Varga y Einar Everitt en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Lund, Suecia. Reacciona con los tres principales serotipos del virus IPN, Ab, Sp y VR-299 (Espinoza y col., 1996 ) y ha sido caracterizado previamente (Espinoza y col., 1993).

Infección de los peces. Los alevines de truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss) de 0.6 g fueron infectados con virus IPN siguiendo básicamente la técnica de McAllister y Owens (1986). Se utilizó una densidad de 1g de pez por 50 ml de agua. Los peces se infectaron durante dos horas a 17ºC en un litro de agua conteniendo 5x105 ufp/ml de virus IPN. Tras lavar por 30 min con 5 l de agua, los peces se transfirieron a un acuario de 50 l de capacidad.

Las truchas se alimentaron tres veces al día con un producto comercial y se mantuvieron con aireación constante y a 17ºC. Para la infección y mantención de las truchas arcoiris de 10 g y los salmones coho (O. kisutch) juveniles se usó básicamente el mismo diseño experimental.

Aislamiento de virus IPN desde órganos de truchas juveniles infectadas. Se inoculó una monocapa de células CHSE-214 con una muestra proveniente de un pool de órganos (riñón y bazo) de 5 peces. El extracto fue diluído 1:10 y 1:100 antes de su aplicación a una monocapa de células RTG-2 y se observó el efecto citopático diariamente durante una semana.

Preparación de las improntas. Los órganos extraídos (bazo, hígado y riñón) de salmones (Coho) infectados o no con virus IPN fueron cuidadosamente lavados en PBS y luego cortados con bisturí en dos o cuatro trozos. Inmediatamente después, se procedió a realizar las impresiones de los órganos sobre un portaobjetos. Las fotografías mostradas en este trabajo corresponden a improntas de hígado de estos peces.

Preparación de los extractos de peces infectados. Se utilizó el protocolo internacional de la OIE (1994) que se emplea con una variante para peces menores de 4 cm y con otra para truchas mayores de 4 cm, a las cuales se les pueden efectuar análisis a partir de órganos por separado. Para cuantificar al virus en los extractos se utilizó el método de titulación basado en la formación de placas de lisis en monocapas de células infectadas cubiertas con agar. Los resultados se expresan en unidades formadoras de placas (ufp).

Amplificación en cultivo celular de virus proveniente de peces infectados. 10 ul de extracto de los alevines infectados se aplicaron a células CHSE-214, tras un día de amplificación del virus en las células en cultivo, se cogieron muestras del medio de cultivo para ensayar al virus producido mediante ELISA e inmunodot. Para analizar la presencia de los antígenos virales mediante inmunofluorescencia, las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio independientes. Tras infectar, éstos se incubaron 16, 24 o 36 horas a 20°C y se fijaron con metanol absoluto frío.

Inmunodot. Una tira de nitrocelulosa se preparó sumergiéndola por 5 minutos en un tampón Tris salino (TBS) pH 7.5 (30mM de Tris-Base, 150 mM NaCl). Tras secar la tira se aplicó un volumen de 5 o 10 ul de la muestra a examinar y los sitios de unión inespecífica se bloquearon por inmersión de la nitrocelulosa en leche desgrasada en polvo al 10% p/v. Después de tres lavados con TTBS (Tween 20 al 0.05% en TBS), de cinco minutos por vez, la tira se incubó con Am por 1 hora a temperatura ambiente y a una concentración de 2 ug/ml. Tras la incubación con el Am se repitió el lavado tal cual se realizó en la etapa anterior y se incubó con anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma), 1/1000, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, se reveló sumergiendo la nitrocelulosa en una solución que se obtuvo de la mezcla de los siguientes componentes: 33 ul de solución stock de azul nitrotetrazolium (NBT), 0.5 g de NBT en 10 ml de dimetilformamida al 70%, en 5 ml de tampón fosfatasa alcalina pH 9.5 (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 , 100 mM Tris), más 16 ul de solución 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP), 0.5 g de BCIP en 10 ml de dimetilformamida al 100%. La tira fue posteriormente lavada para detener la reacción, secada y fotografiada. En el caso del examen directo de muestras de animales infectados, se adicionó Levamisole 0.1 M conjuntamente con el revelador para reducir la actividad endógena.

ELISA. Las muestras se aplicaron a placas de plástico de 96 pocillos y se mantuvieron durante 1 hora a temperatura ambiente más 16 horas a 4ºC. Tras la unión del antígeno a la placa, ésta fue lavada con PBS conteniendo 0.005% de Tween 20 (PBST) tres veces y por 5 min cada vez. Luego de lavar, se bloquearon los sitios inespecíficos mediante leche desgrasada al 5% en PBST. Tras mantener por dos horas a temperatura ambiente, se lavó con PBST como se describió antes.

El anticuerpo monoclonal se aplicó a una concentración de 2 ug/ml y se mantuvo en la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar tres veces con PBST, se adicionó el anticuerpo secundario, antiratón conjugado con peroxidasa (Sigma), a una dilución de 1/1000.

Al final de un período de incubación de 1 hora a temperatura ambiente, se lavó la placa tres veces con PBST y se reveló la cantidad de enzima mediante el uso del sustrato orto fenilendiamina.

Para identificar claramente las muestras positivas, para cada determinación se calculó el valor de corte, esto es, el valor de absorbancia por defecto dado por el equipo de ELISA calculado en base a lecturas de controles negativos.

Inmunofluorescencia. Sobre la muestra fijada a examinar se incubó el Am 1 (3 ug/ml) durante 1 hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Tras cinco lavados sucesivos con PBS, de 5 min cada vez, se aplicó el anticuerpo secundario antiratón conjugado con FITC (Sigma)y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Nuevamente se lavó y la preparación se observó en el microscopio de epifluorescencia. Esta técnica se aplicó en tres tipos de muestras. En células infectadas con extractos provenientes de peces, en improntas y en células directamente infectadas con virus control. En este último caso las células crecidas en portaobjetos de vidrio se infectaron a dos multiplicidades de infección, 0.001 y 0.0001 ufp/cel, aproximadamente 60 y 6 ufp por vidrio respectivamente. A los tiempos indicados en la figura 4, los vidrios con las células se lavan, fijan y procesan para la inmunofluorescencia.

Tinción con yoduro de propidio. Se utilizó el colorante en una solución acuosa a una concentración de 5 ug/ml. Se aplicó a la muestra durante 10 min y tras lavar con PBS la preparación se observó al microscopio de epifluorescencia.

RESULTADOS Y DISCUSION

El análisis visual de los alevines infectados permitió constatar, como era de esperar para animales de este tamaño, que el virus IPN produjo la enfermedad aguda en las condiciones ensayadas. A partir de los tres días post infección sobre el 70% de los animales evidenciaron las manifestaciones clínicas propias de la enfermedad, esto es, distensión abdominal, exoftalmia y pequeñas hemorragias. La máxima expresión de los signos se obtuvo entre los días 6 y 8. El examen anatomopatológico mostró cambios de coloración de hígado y bazo, como también, desprendimiento del epitelio intestinal. Sin embargo, a partir del día 7 los peces comenzaron a recuperarse de la enfermedad. Estas condiciones las consideramos apropiadas para los objetivos de este trabajo, puesto que permitieron obtener muestras de animales ya sea en una fase aguda de la enfermedad, como asimismo, en un estado portador.

Como se aprecia en la figura 1 existe una buena correlación entre la aparición de los signos clínicos, con la recuperación de virus desde los peces infectados. Se observa, día 3, que desde el momento en que aparecen los signos clínicos hay un alza en la cantidad de virus proveniente de los extractos. Al día 7 se obtiene el nivel más alto de virus activo, de allí en adelante la cantidad de virus desciende hasta alcanzar un nivel levemente superior al del día 1 (día 17). Para el propósito de ensayar nuestros métodos de diagnóstico hemos elegido los días 1,3,7 y 17 como representativos de situaciones factibles de encontrar en terreno. Básicamente, animales conteniendo muy pocos virus y que por lo tanto requieren de métodos más sensibles (comienzo de la enfermedad y portadores) y animales con manifestaciones muy claras de la enfermedad y, por lo tanto, conteniendo altos niveles de virus (agudos).

Figura 2: Detección directa del virus IPN mediante ELISA e inmunodot en extractos de alevines infectados. Las manchas de inmunodot se disponen en el extremo superior del gráfico y en forma correlativa con los resultados del ensayo de ELISA. Direct detection of IPNV by means of ELISA and immunodot in extracts of infected fry. Immunodot (upper part of the figure) and ELISA results are shown in correlation.

En principio puede argumentarse que una parte significativa del virus o el antígeno viral que se cuantifica puede provenir del virus que se utilizó para infectar. Las variaciones temporales de la cantidad de virus y las respuestas positivas de ELISA e inmunodot al cabo del día 7 restan solidez al argumento. Es difícil discriminar en peces tan pequeños entre virus progenie y el utilizado para infectar, salvo si la cantidad de virus en la muestra es mayor que la utilizada para infectar. Para tener un mejor apoyo a la idea de que el virus que se detecta a los 17 días corresponde a virus progenie más que al infectante, es que realizamos experimentos con peces de mayor tamaño. Así podemos investigar específicamente si los animales portadores lo son porque algo de virus progenie se mantiene en los órganos en los cuales éste se multiplica.

Para esto se infectaron animales juveniles e inmediatamente después de lavar los peces e instalarlos en los acuarios, se cogieron grupos de 5 animales a los tiempos señalados en el cuadro 1. De cada uno de estos grupos se preparó un pool de extracto de riñón y bazo con el cual se infectaron células RTG-2 en cultivo. Como se observa en el cuadro 1, antes de las 30 horas de haber infectado los peces no es posible recuperar virus activo desde los extractos de órganos. Sin embargo, de allí en adelante, todas las muestras son positivas. Estos resultados están de acuerdo con la idea de que el virus y/o los antígenos identificados en los alevines recuperados de la enfermedad corresponden a virus replicado en el pez.

CUADRO 1. Recuperación de virus IPN activo desde los extractos de órganos de truchas arcoiris (O. mykiss) juvenil infectadas. Recovery of viable virus from organ extracts of juvenile rainbow trout (O. mykiss) infected with IPNV.
Tiempo Post	Diluciones
Infección
(hrs.)	1:10	1:100
1	-	-
6	-	-
12	-	-
24	-	-
30	+	-
54	+	+
102	+	+

Según la figura 1 es posible detectar directa y rápidamente al virus en animales con la infección aguda. En el caso de peces con sintomatología difusa o bien de supuestos portadores, se puede detectar la presencia del virus incorporando un paso de amplificación del virus en células en cultivo. Según se aprecia en la figura 3, es suficiente aumentar en un día y medio el tiempo total del análisis para detectar al virus IPN en todas las etapas de la evolución de la enfermedad. Esto es en su inicio, fase aguda y estado portador. En conclusión, proponemos el uso del ensayo directo por ELISA o inmunodot para aquellos casos en los cuales la sintomatología clínica sugiere una infección aguda por virus IPN. Un resultado positivo favorecerá la toma de decisiones conducentes a proteger a los peces sanos. Si se sospecha de la presencia de portadores o animales en vías de desarrollar la enfermedad sugerimos incorporar al ensayo un paso previo de amplificación en células CHSE-214. Aún así el tiempo requerido para el ensayo total no supera los tres días. La técnica de inmunofluorescencia permite la visualización de antígenos virales en un tiempo menor que el requerido cuando se emplea la técnica de ELISA o la de inmunodot. Esto porque en los dos últimos métodos se debe trabajar con extractos celulares, o sobrenadantes, que han acumulado suficiente antígeno para la detección, en cambio, en la técnica de inmunofluorescencia se requiere sólo de unas pocas células infectadas que se visualizan en un determinado campo óptico.

Figura 3: Detección indirecta del virus IPN mediante ELISA e inmunodot en extractos de alevines infectados. Las manchas de inmunodot se disponen en el extremo superior del gráfico y en forma correlativa con los resultados del ensayo de ELISA. Indirect detection of IPNV by means of ELISA and immunodot in extracts of infected fry. Immunodot (upper part of the figure) and ELISA results are shown in correlation.

Para simular condiciones de muestras conteniendo virus en muy baja cantidad infectamos células CHSE-214 a dos multiplicidades de infección, 0,0001 y 0,001 ufp/cel. En la práctica esto significa que en un caso las células contenidas en el vidrio a examinar reciben alrededor de 6 ufp y en el otro diez veces más, respectivamente.

Como era de esperar para esta técnica, ya al cabo de un día de amplificación se obtienen señales claramente positivas (fig 4). Dentro de 36 horas postinfección la muestra obtenida a la más baja multiplicidad de infección generó una apreciable cantidad de células ricas en antígeno viral.

Figura 4: Inmunofluorescencia específica en células CHSE-214 infectadas con virus IPN. Specific immunofluorescense in CHSE-214 cells infected with IPNV.

Para demostrar que estos resultados guardan relación con lo que ocurre en animales infectados es que preparamos extractos de truchas arcoiris con clara signología clínica de la enfermedad producida por virus IPN (Día 7 postinfección) e infectamos células CHSE-214 en cubreobjetos de vidrio. La figura 5 A muestra que a partir de 16 horas obtenemos células intensamente teñidas en el citoplasma y en apreciable número. Con el objeto de analizar lo que ocurre con animales portadores es que infectamos, además, células en cultivo con extractos obtenidos de peces que se recuperaron totalmente de la infección (17 días post infección), al igual que en el caso anterior se obtuvieron células positivas a las 16 horas, aunque en menor número (fig. 5 C). Tras 24 horas de amplificación en células en cultivo, ambos tipos de muestra originan células fluorecentes que se identifican con gran facilidad sin la necesidad de examinar muchos campos ópticos (fig. 5 B y D).

En peces de mayor tamaño es posible detectar la presencia de virus IPN desde diferentes órganos. Esto permite que se pueda realizar directamente el ensayo empleando improntas de órganos en los cuales se replica el virus. Para analizar la utilidad de nuestro anticuerpo en este tipo de análisis que infectamos salmones coho juveniles con el virus. En nuestras condiciones de ensayo los peces no desarrollaron la enfermedad, por lo cual la situación se asemeja a un estado portador.

La figura 6 muestra que en las condiciones de ensayo que se indican en Material y Métodos se obtienen células positivamente marcadas con el Am 1 más el respectivo anticuerpo secundario conjugado con FITC (A) y si el pez no ha sido infectado no se identifican células marcadas (B).

En conclusión, hemos establecido que el Am 1, preparado contra la proteína Vp3/4 del virus IPN, permite con nuestros protocolos identificar en un plazo aproximado de 24 horas la presencia de virus IPN en muestras provenientes de animales infectados. Esto es considerando las 16 horas de amplificación en células CHSE-214 más el tiempo requerido para la inmunofluorescencia, alrededor de 4 horas. Lo importante es que tanto para animales con infección aguda como para portadores, los tiempos totales del ensayo son muy similares. Para el caso de portadores es recomendable extender el período de amplificación hasta unas 24 a 36 horas, puesto que se debe tomar en cuenta que las muestras de portadores pueden implicar la aplicación mínima de hasta un ufp por cubreobjetos con las células.

También establecimos que es factible aplicar el método de inmunofluorescencia directamente sobre improntas de órganos de peces infectados y que el método origina claras señales citoplasmáticas en muestras de animales sin signología clínica aparente, por ende supuestos portadores sanos. Esto último es de utilidad para la certificación sanitaria de los peces que se muestrean en forma aleatoria.

RESUMEN

El virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus IPN, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa que afecta a peces salmonídeos jóvenes, éstos cuando sobreviven pueden convertirse en portadores que pueden transmitir la enfermedad. Para contribuir al diagnóstico rápido y efectivo del virus tanto en peces con la infección aguda, como en peces portadores, es que ensayamos la aplicación de un anticuerpo monoclonal en la detección del virus en animales infectados experimentalmente. Utilizamos alevines de truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y de salmones coho (Oncorhynchus kisutch) infectados con virus IPN aislado en Chile.

Para detectar a los antígenos virales empleamos ensayos de ELISA inmunodot e inmunofluorescencia. Los resultados muestran que en los peces con la enfermedad aguda el virus se detecta aplicando directamente los inmunoensayos en extractos de peces enteros. En cambio, para detectar al virus en los peces portadores fue necesario incorporar un paso adicional para amplificar al virus en cultivos celulares. A pesar de lo cual, sin embargo, los métodos se optimizaron de manera que el procedimiento completo se realizó en menos de tres días para ELISA e inmunodot y menos de un día y medio para la inmunofluorescencia.

Debido a que la técnica de inmunofluorescencia permite la identificación inequívoca de una o pocas células infectadas, es que ensayamos condiciones para diagnosticar al virus IPN desde improntas de peces portadores del virus. Demostramos que los antígenos virales pueden ser facilmente identificados por medio de la tinción directa de improntas de órganos de peces con el tamaño adecuado.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por los proyectos FONDECYT 1950395 y DIUV Nº12.

Aceptado: 12.08.99.

Financiamiento: FONDECYT, proyecto 1950395, DIUV Nº 12.

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