Comparación entre dos técnicas de diagnóstico para diarrea viral bovina (dvb) en 50 predios de la X región, Chile. Seroneutralización y enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-I)

ARTÍCULOS ORIGINALES

Comparación entre dos técnicas de diagnóstico para diarrea viral bovina (dvb) en 50 predios de la X región, Chile. Seroneutralización y enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-I)^*

Comparison of two diagnostic techniques to bovine viral diarrhea disease (BVD) in 50 dairy herds from the Xth Region, Chile. Seroneutralization test and indirect immunosorbent assay (I-ELISA)

G. REINHARDT¹, M.V., Dr. med.vet; L. CARRASCO¹, M.V.; N. TADICH², M.V., Ph.D.; S. RIEDEMANN¹, T.M., M.V.

¹ Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias. ² Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile. e-mail: greinhar@uach.cl

SUMMARY

Bovine viral diarrhea/Mucosal disease (BVD/MD) is a highly spread virosis worldwide and has a great impact in bovine reproduction and production. In Chile, the disease has been reported with over 60% of prevalence and it demands adecuate diagnostic methods.
Curently the official serologic diagnostic test in Chile is the serum neutralization test (SNT), this method detects the presence of antibodies against the BVD virus and it is considered to have good specificity and sensitivity, althought, it presents some disadvantages in its interpretation and in its execution.
The aim of this investigation was to compare de SNT as gold standard, with a commercial immunosorbent assay (ELISA), in terms of specificity and sensitivity in the detection of antibodies against BVD antigens. A set of 500 bovine sera drawn from 50 milk herds from the Xth Region of Chile were analized.
The results showed that the SNT detected 278 serum samples as positives and the ELISA detected 347 serum samples as positives, these represents for ELISA test a relative sensitivity and specificity of 91% and 57%, respectively. Statistically significant differences of the serodiagnosis obtained in both tests were established through the McNemar test (<0.05), and a median concordance between them through the Kappa test. When the SNT titers were related with the optical densities (OD) of ELISA, a positive association was detected between this values.
It was concluded that ELISA provides good results in comparison with SNT, having the former a higher number of detections because its dignostic higher sensitivity. Therefore, ELISA is an appropiate diagnostic method for large populations of cattle.

Palabras claves: Diarrea Viral Bovina, comparación métodos diagnóstico.

Key words: Bovine viral diarrhea, comparison of diagnostic methods.

INTRODUCCIÓN

El complejo Diarrea Viral Bovina/Enfermedad de las Mucosas (DVB/EM), es una enfermedad infecciosa de alta prevalencia en bovinos de cualquier edad y en diversos lugares del mundo, que provoca un importante impacto económico debido principalmente a pérdidas de tipo reproductivo que se manifiestan por abortos, defectos congénitos, mortalidad neonatal y problemas de fertilidad, entre otros (Blood y Radostitis, 1992).

DVB/EM de diagnosticó en nuestro país en 1986, por medio de hallazgos anatomopatológicos en terneros de la X Región (Fidler y col., 1986), lo que fue confirmado por técnicas de Inmunofluorescencia directa (IFD), seroneutralización (SN) y aislamiento viral en cultivo celular (Reinhardt y col., 1986). Posteriormente el agente se ha aislado repetidamente, como por ejemplo en fetos abortados en la Región Metropolitana (Celedón y col., 1997).

Lo que más llama la atención en el comportamiento biológico del virus DVB es la existencia de dos biotipos, el citopático (cp) y el no citopático (ncp) (Coria y col., 1984). Su diferencia radica en la particularidad del primero de producir efecto citopático (ecp) en un cultivo celular susceptible, el que se traduce en vacuolización citoplasmática y muerte celular (Gillespie y col., 1960). El otro biotipo (ncp), no causa ningún efecto manifiesto en la monocapa celular que infecta y donde se multiplica adecuadamente (Baker, 1987). Cabe señalar que este biotipo es el más común en la naturaleza (Brownlie y col., 1987), y que el biotipo cp deriva de cambios genéticos del anterior (Corapi y col., 1988).

Una posterior clasificación del virus DVB, basada en diferencias encontradas en la secuencia genética de una región del genoma, conocida como región 5'UTR, determina la existencia de los genogrupos I y II, existiendo diferncias a nivel molecular y en cuanto a severidad de los signos clínicos que se producen (Ridpath y col., 1992). Se pudo determinar que el genogrupo II reune las cepas más virulentas (Ellis y col., 1998; Fulton y col., 2000). En Chile, Pizarro y col., (1999), demostraron la presencia de ambos serogrupos en el ganado bovino nacional.

Existen variadas técnicas de diagnóstico útiles en la detección de la enfermedad y ellas pueden ser divididas en dos grandes grupos, el método directo y el método indirecto. El primero se basa en la detección del virus o antígeno viral, en contraste, el segundo determina la respuesta inmune de tipo humoral del huésped frente a la acción del agente.

En general, la totalidad de los métodos de diagnóstico utilizados en el laboratorio para el estudio de DVB requieren, para un resultado satisfactorio, de una recolección apropiada de muestras, buen material de trabajo, transporte y procesamiento adecuados (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, England, 1978).

La ténica de seroneutralización (SN), consiste en una prueba punto final seroneutralizante, que permite identificar y cuantificar la capacidad de los anticuerpos séricos para inhibir o neutralizar el efecto citopático de una cepa dada. Los anticuerpos neutralizantes son responsables del efecto protector del suero y están dirigidos contra determinates antigénicos específicos de la superficie del virus (FAO, 1985). Según Duffel y Harkness (1985), esta prueba diagnóstica presenta la limitante de no detectar bajas tasas de anticuerpos como en el caso de animales virémicos inmunocompetentes.

El método inmunoenzimático (ELISA) para la detección de anticuerpos, se utiliza para la cuantificación de muy pequeñas cantidades de éstos, que habitualmente no son detectables por los métodos convencionales; además esta técnica presenta la carcterística de una alta especificidad y sensibilidad, así como rapidez, lo que posibilita el estudio de grandes poblaciones en corto tiempo, en forma rutinaria y sencilla (Dinter, 1989). Por otra parte, su cuantificación se basa en la reacción enzima-sustrato que produce un cambio de coloración que se evalúa mediante un espectrofotómetro lo que evita resultados subjetivos, además resultan ser pocos los errores que esdta técnica presenta en caso del uso de "kits" comerciales, puesto que las variables han sido estandarizadas de modo que los parámetros medidos no sean alterados (Dubovi, 1990).

Este estudio pretende comparar el diagnóstico serológico de la infección por el virus DVB utilizando un método de ELISA indirecto y la prueba de SN en muestras de suero sanguíneo obtenidas de ganado bovino de predios lecheros de la X Región de Chile con el propósito de evaluar la técnica de ELISA en relación con la SN, según sensibilidad y especificidad, comparando los resultados obtenidos y estudiando la correlación existente entre ambos métodos utilizados.

MATERIAL Y MÉTODOS

Este estudio utilizó un total de 50 predios lecheros, ubicados en las provincias de Llanquihue, Osorno y Valdivia de la X Región de Chile, los que fueron seleccionados por conveniencia, de acuerdo a tamaño del rebaño, ausencia de vacunación contra la enfermedad e interés del propietario en participar. Se recolectaron 500 muestras de sangre, a partir de 10 animales de cada predio, de edades que fluctuaron entre los 6 y 18 meses. Todas las muestras se obtuvieron por extracción de 5-10 ml de sangre desde la vena yugular mediante la utilización de tubos Venojet que fueron transportados al Instituto de Microbiología donde se obtuvo el suero por centrifugación de cada muestra a 700 x g por 15 min. Los sueros así obtenidos se almacenaron en tubos Eppendorf, rotulados con números correlativos y congelados a -30° C. Previo a su análisis se inactivaron por 30 min. a 56° C, con la finalidad de destruir los inhibidores inespecíficos que pudieren alterar los resultados de la SN.

La prueba de SN, dilución punto final seroneutralizante, se realizó diluyendo los sueros problema, el suero control positivo y el suero control negativo en logaritmo de base 2, en medio mínimo esencial en sales de Earle (MEM-E), en volúmenes de 50m l y se enfrentaron a 100 dosis infectantes cultivo de tejido 50% (DICT₅₀) de la cepa viral München del virus DVB, también en volúmenes de 50 m l. Luego de una incubación por 60 min. a temperatura ambiente, se adicionó 100 m l de células embrionarias de pulmón bovino de segundo pasaje (1x10⁶ cél/ml),en MEM-E más 10 % de suero fetal bovino irradiado (SFB). Finalmente las microplacas se llevaron a incubación en estufa de cultivo con cámara húmeda a 37° C y adicionada de un 5% de CO₂ por 5 días, para luego proceder a su lectura mediante observación microscópica.

Para la interpretación de la prueba de SN se observó la presencia de cpe en los diferentes pocillos de cada microplaca. Se revisaron los sueros controles positivo y negativo, los pocillos de control de células y los de control de citotoxicidad de los sueros problema y luego se procedió a la lectura de los pocillos correspondientes a cada dilución sérica. Toda muestra que presentó a lo menos un pocillo sin cpe se consideró positiva y el título neutralizante de cada suero se calculó de acuerdo al método de Behrens y Kärber (Mayr y col, 1974).

El método de ELISA-I utilizado fue un "kit" comercial basado en la detección de IgG en los sueros analizados, denominado CHEKIT-BVD-SERO*, el que básicamente está compuesto de microplacas de 96 posillos sensibilizados con antígenos, de modo que los pacillos pares presentan un antígeno control (que corresponde a las células donde se cultiva el virus DVB), y los impares con antígeno viral DVB inactivado. Cada suero problema , un suero control negativo y otro positivo se diluyeron 1:10 y esa dilución se colocó en duplicado en pocillos pares e impares de la microplaca sensibilizada. Las microplacas se incubaron por 90 min. a temperatura ambiente y en cámara húmeda. Posteriormente se procedió a la eliminación del contenido de cada microplaca y se realizó un lavado en triplicado. A continuación se procedió a la colocación en cada pocillo de una dilución al 1:200 del conjugado (200 m l), incubándose nuevamente a temperatura ambiente por 60 min. y en cámara húmeda a fin de que se produjera su unión con los probables anticuerpos presentes en los pocillos. Transcurrido el tiempo de incubación se realizó nuevamente la eliminación del contenido de cada placa y su posterior lavado en triplicado. Con el fin de evidenciar la unión del conjugado al complejo antígeno-anticuerpo, se adicionó a cada pocillo, 200 m l de cromógeno que actúa como sustrato de la enzima presente en el conjugado y que en el caso de reacciones positivas genera una coloración que puede observarse a simple vista. Luego de 10 a 15 min. de incubación se agregó 50 m l de una solución de detención de la reacción para proceder a la lectura, la que se realizó con un fotómetro lector (MULTISKAN MK II), a una longitud de onda de 405 nm, lo que permite determinar la densidad óptica (DO) de la reacción colorimétrica. Para la interpretación de los resultados se siguieron las intrucciones del laboratorio productor del "kit". Para ello, de cada muestra hecha en duplicado se obtuvo el valor promedio de DO, como también de los controles positivo y negativo. Los valores de las DO de cada muestra y el valor de la DO del suero positivo fueron corregidos, sustrayéndoles el valor de DO del control negativo. Para la interpretación del rtesultado de cad muestra se utilizó la siguiente fórmula:

% muestra = DO muestra _- DO C negativo x 100
DO C positivo - DO C negativo

Valores menores de 30% se consideran negativos; valores entre 30 y 40% se consideran dudosos y valores mayores de 40% se consideran positivos. Todas las muestras que se consideran dudosas se vuelven a analizar con el fin de clasificarlas como positivas o negativas en forma definitiva.

Para el análisis de los resultados se utilizaron parámetros estadísticos de sensibilidad (Se) y especificidad (Es), mediante una tabla de 2x2, donde el sistema de referncia fue la prueba de SN.

Cuadro 1. Clasificación cruzada de las pruebas de SN y ELISA
Specificity and sensitivity of ELISA compared with SNT.

	Seroneutralización
ELISA	Positivo	Negativo	Total
Positivo	A	B	A+B
Negativo	C	D	C+D
Total	A+C	B+D	(N)

Descripción : A: Positivos verdaderos
B: Falsos positivos
C: Falsos negativos
D: Negativos verdaderos
(N): Número total de muestras comparadas

Además, se utilizaron gráficos tipo Box-Plot, que muestran medidas de resúmen para ambas técnicas, realizados mediante el programa computacional Statistica 4.0; se usó la prueba de McNemar para muestras relacionadas y detección de muestras positivas (Daniel, 1978), con el fin de comprobar la hipótesis nula planteada, esto es igual proporción de seroreaccionantes positivos a las dos técnicas. Se utilizó el método estadístico de Kappa (K), con un nivel de confianza de 95%, para determinar el grado de concordancia entre ambas pruebas, descartando el azar (Whimster, 1997), y se ocupó el coeficiente de Spearman para determinar la correlación existente entre títulos de anticuerpos medidos por la SN y los porcentales de DO obtenidos por ELISA (Nie y col., 1975).

RESULTADOS

Para el análisis de los resultados obtenidos con las dos pruebas diagnósticas utilizadas, se establecieron dos categorías de muestras, positivas o negativas respecto a la presencia o ausencia de anticuerpos frente al antígeno del virus DVB. Mediante la técnica de SN se titularon los sueros positivos y por la técnica de ELISA, tras la repetición de las muestras que resultaron dudosas, se categorizó la totalidad de ellas.

El resultado de las pruebas de informa en los cuadros 2 y 3 para cada prueba respectivamente, en los que se agruparon los diversos planteles analizados según el número de sueros positivos y el porcentaje respecto de las 10 muestras por plantel.

Cuadro 2. Distribución en número y porcentaje de los sueros positivos a SN para DVB en los 50 planteles lecheros de la X Región , Chile.
Distribution of positive dera for BVD tested by SNT in 50 dairy herds from the X Region, Chile.

SERONEUTRALIZACIÓN
N° Predios	N° Muestras	Porcentajes
3	0	0
3	3	10
4	8	20
2	6	30
6	24	40
6	30	50
6	36	60
5	35	70
4	32	80
6	54	90
5	50	100
50	278	TOTAL

El cuadro N° 2 indica que, de los 50 planteles analizados, el 94% (48) de ellos presentaron al menos un suero reaccionante al virus DVB y que la prueba de SN detectó 278 sueros positivos del total de 500, lo que representa un 55,6

Cuadro 3. Distribución y porcentaje de sueros reaccionantes a ELISA frente a DVB en 50 planteles analizados en la X Región, Chile.
Distribution of positive sera for BVD tested by ELISA in 50 dairy herds from the X Region, Chile.

ELISA
N° Predios	N° Muestras	Porcentaje
2	0	0
1	1	10
1	2	20
5	15	30
2	8	40
4	20	50
7	42	60
5	35	70
2	16	80
2	18	90
19	190	100
50	347	TOTAL

De los resultados presentados en el cuadro N° 3 se desprende que el 96% de los los 50 predios analizados tenían a lo menos un animal reaccionante y la prueba de ELISA detectó 347 muestras como positivas, lo que corresponde al 69,4% de las 500 muestras estudiadas.

Cuadro 4. Resultados comparados del total de sueros analizados tanto por ELISA como por SN frente al virus DVB.
Comparison of ELISA and SNT results for BVDV.

	Seroneutralización
ELISA	Positivo	Negativo	Total
Positivo	252 (A)	95 (B)	347 (A+B)
Negativo	26 (C)	127 (D)	153 (C+D)
Total	278 (A+C)	222 (B+D)	500 (N)

Cálculo de Sensibilidad y Especificidad relativas:
Sensibilidad relativa: (A/ (A+C) x 100 = 91%
Especificidad relativa: (D/ (B+D) x 100 = 57%

Los datos entregados en el cuadro N° 4 muestran que la sensibilidad relativa de ELISA detecta el 91% del total de positivos diagnosticados por SN y la especificidad relativa de ELISA detecta el 57% del total de negativos dignosticados por SN.

De los resultados obtenidos se desprende que existen diferencias en la detección de muestras reaccionantes entre ambas pruebas diagnósticas, dado por aquéllas seropositivas para una técnica pero negativas para la otra.

La prueba de McNemar para muestras relacionadas con c ² = 39,3 determinó una p<0,05, lo que rechazó la hipótesis nula planteada, lo que indica en la detección de anticuerpos por ELISA y por SN hubo diferencias significativas.

De acuerdo al método estadístico de Kappa, se determinó un valor moderado de concordancia (K = 0,49), entre las técnicas utilizadas, lo que resultó ser estadísticamente significativo (p<0,05).

Cuadro 5. Promedios y desviación estándar (DS) de los resultados de la totalidad de las muestras séricas analizadas tanto por ELISA como por SN.
Means and standard deviatin (SD) resuts of positive and negative serum samples tested by ELISA and SNT.

	Seroneutralización	ELISA
Promedio	33*	77**
Desviación Estandar	69,1	55,1

* Expresado en título de anticuerpos
** Expresado en porcentaje de DO.

En el gráfico N° 1 se observan los valores límites obtenidos por la técnica de ELISA, del total de muestras analizadas, cuyos valores fluctuaron entre 0 y 278. El vcalor mediano estableció que el 50% de las observaciones se encontraron sobre 62, así mismo el área achurada se delimitó por los valores de los percentiles (25 y 75) y concentró el 50% del total de las observaciones.

Distribución de frecuencias para ELISA y SN.

Gráfico 1: Medidas de resumen de sueros analizados por ELISA, según porcentajes de DO (n=500).
Sumary of values tested by ELISA according OD porcentages.

En el gráfico N° 2 se observan los valores límites obtenidos mediante la prueba de SN del total de las pruebas analizadas, cuyos valores fluctuaron entre 0 y 447. El valor mediano estableció que el 50% de las observaciones se encontró sobre 7 y al igual que en el gráfico N° 1, el área achurada se delimitó por los valores de los percentiles (25 y 75), concentrando el 50% del total de las observaciones.

Gráfico 2: Medidas de resumen de sueros analizados por SN, según título de anticuerpos (n=500).
Sumary of values analized by SNT according antibody titles.
Determinación del coeficiente de Correlación.

En el gráfico N° 3 se presenta la dispersión de los sueros analizados y revela la existencia de asociación entre ambas variables, en este caso, los valores obtenidos mediante las pruebas de ELISA y SN, respectivamente. Por medio de la orientación que muestra la nube de puntos de este diagrama, se establece una asociación de tipo positiva.

Sobre la base de lo anteriormente descrito, se calculó el coeficiente de correlación de Spearman que asocia los porcentajes de DO ontenidos por ELISA y los títulos alcanzados por SN. Para la totalidad de los sueros (n=500), resultó ser r=0,61 con p<0,05, lo que estableció una mediana asociación entre ambas técnicas, teniendo en cuenta que este coeficiente presenta un rango de -1 a +1.

Este mismo coeficiente, aplicado solo a los sueros diagnosticados positivos por ambas pruebas (n=252), resultó con un valor de r=0,69 con p<0,05.

Gráfico 3: Diagrama de dispersión (Scatter-Plot) para el total de muestras según ambas técnicas serológicas (n=500).
Scatter-Plot Diagram for all samples according both serologic tests.

DISCUSIÓN

La prueba de SN es la más comunmente utilizada en todo el mundo para la determinación de niveles de anticuerpos frente al virus de DVB y el Servicio Agrícola y Ganadero de Chile (SAG), la considera como prueba oficial en el país; sin embargo, no existe ninguna cepa de virus DVB universalmente aceptada como cepa de referencia para ser usada por esta técnica. Las más comunmente utilizadas son las cepas citopáticas NADL, Singer y Oregon C24V (Edwards, 1990). Esto último es relevante puesto que los títulos de anticuerpos obtenidos con una u otra cepa pueden diferir de un laboratorio a otro. En todo caso ella se considera como una prueba altamente específica, que se basa en la detección de anticuerpos neutralizantes que surgen como respuesta protectora del animal frente a una infección viral. Las limitantes que posee no son pocas, principalmente referente a la gran subjetividad en la lectura de la prueba, disponibilidad de tiempo, altos costos en la obtención y mantención de cultivos celulares y posibles contaminaciones no deseadas de ellos (Dinter, 1989). Muchas razones, además de las mencionadas anteriormente pueden provocar diferencias en los resultados, entre ellas la diversidad antigénica de los aislados del virus DVB (Bolin y col., 1992), que genera diferencias radicales en el título de anticuerpos obtenido de un mismo animal al utilizar 2 cepas diferentes, por lo que algunos laboratorios han instaurado el uso de un "pool" de antígenos virales, lo que obviaría esa situación. Existen otras diferencias producto de la variación en la realización de la técnica, como son el tipo de células utilizado y el nivel del pasaje celular empleado (Edwards, 1990).

La prueba de ELISA ha demostrado ser una herramienta efectiva en el diagnóstico de la enfermedad, dadas sus múltiples ventajas, entre las cuales cabe destacar su automatización, estabilidad de sus reactivos, medición de los resultados en forma objetiva mediante instrumentos, utilización de pequeñas cantidades de reactivos y bajo nivel de peligro biológico (Meléndez y col., 1987). Además resulta ser una prueba de diagnóstico rápida sobre un gran número de muestras y muy versátil pues puede utilizarse indistintamente en suero sanguíneo, plasma o leche (Dinter, 1989).

Las desventajas que se le atribuyen a la prueba de ELISA se refieren principalmente a la posibilidad de reacciones inespecíficas, reactividad cruzada y sensibilidad a inhibidores de la actividad enzimática, todo lo cual se reduce notoriamente al utilizar una prueba de ELISA comercial (Meléndez y col., 1987), como lo fue en este estudio.

Se demostraron diferencias en cuanto a los resultados serológicos obtenidos en cada una de las dos pruebas utilizadas, de modo que se obtuvo sueros positivos o negativos en ambas muestras, sueros positivos para ELISA y negativos para SN y sueros negativos para ELISA y positivos para SN (Cuadro N° 4). En relación a los sueros que resultaron positivos a ELISA y negativos a SN, se podría explicar porque el método puede detectar antígenos heterólogos del virus que infectó a los animales y que producen una respuesta inmune baja, traducida en pequeñas concentraciones de anticuerpos sólo detectadas por la gran sensibilidad que posee la prueba de ELISA (Donis y Dubovi, 1987b).

Los resultados negativos a la detección de anticuerpos frente a DVB, por la prueba de SN, se pueden apoyar también en los estudios de Xue y col., (1990) que establecen que la glicoproteína viral gp53 es la principal responsable de la neutralización viral y sólo unos pocos epítopes de ella contribuyen a la neutralización. Además, las variaciones genéticas que sufre el virus y que se ponen en evidencia mediante estudios con anticuerpos monoclonales, determinan variantes antigénicas incapaces de ser neutralizadas (Bolin y col., 1988). Por ello, el uso de ensayos inmunoenzimáticos de la proteina no estructural p80 del virus DVB, polipéptido presente en todas las cepas del virus y producido en gran cantidad durante la replicación viral, asegura en la prueba de ELISA la detección de un gran número de seroreaccionantes al agente (Donis y Dubovi, 1987a). La prueba de ELISA utilizada en este estudio usa como antígeno viral las proteínas no estructurales 125/80.

La detección de anticuerpos frente al virus DVB por SN y no por ELISA se podría explicar por la carencia de ciertos epítopes antigénicos en el "kit" comercial utilizado que pudieran estar presentes en la cepa München usada en la SN. Es necesario recordar también que en casos de contaminación accidental de cultivos celulares utilizados para la SN con cepas ncp de DVB a trvés del suero fetal utilizado podría generar resultados erróneos en el serodiagnóstico (Abraham, 1993).

Estudios efectuados por Chu y col., (1985), Durham y Hassard (1990) y Horner y Orr (1993), revelan que existe una alta correlación en la detección de anticuerpos anti-DVB entre ambas técnicas, sin embargo la técnica de ELISA resulta ser más sensible al detectar bajas concentraciones de anticuerpos. En este estudio se encontró relación entre los títulos seroneutralizantes y los porcentajes de DO determinados por ELISA, alcanzando valores de correlación positivos y de magnitud mediana (gráfico N° 3), lo que permite inferir que se comparten ciertas proteínas virales del virus DVB y son reconocidas por los anticuerpos detectados tanto por ELISA como por SN. Por otra parte, esta asociación resultó ser estadísticamente significativa, lo que es corroborado por el trabajo de Graham y col. (1997), quienes estandarizaron un ELISA para las enfermedades virales Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (RIB), Parainfluenza 3 (PI-3), Virus Respiratorio Sincicial Bovino (VRSB) y DVB en forma exitosa en la determinación cuantitativa de anticuerpos que demostró correlacionarse significativamente con los títulos obtenidos por SN.

Por el contrario, estudios realizados por Campodónico (1998), que relacionaron DO determinadas por ELISA con log10 de los títulos neutralizantes, no lograron demostrar esa correlación. Si bien es cierto se determinó una asociación positiva entre ambas variables, ella fue baja y no significativa.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican que, ELISA como prueba serológica utilizada en la detección de anticuerpos anti-DVB, posee alta sensibilidad y una especificidad relativa respecto a la prueba de SN. Siendo la sensibilidad la capacidad de una técnica de dar un resultado positivo, cuando el individuo está realmente positivo (Smith, 1995), los sueros diagnosticados negativos a SN evidencian la mayor capacidad que tiene ELISA en detectar los verdaderos positivos. Algunos estudios apoyan lo anterior al referirse a que la prueba de ELISA utiliza antígenos conservados, por lo que desarrolla una mayor reactividad, Bock y col. (1986), demostraron el eficiente uso de la técnica de ELISA en el diagnóstico de DVB en forma rápida y sobre un gran número de muestras.

El análisis estadístico de las pruebas serológicas utilizadas en el estudio, muestra diferencias significativas entre ambas, por medio de la prueba de McNemar, con p<0,05 se descartó el azar y se demostró que si hay diferencias en la detección entre ambas pruebas. Según la estadística Kappa, que mide el grado de concordancia existente entre las dos técnicas, se obtuvo un valor moderado (cuadro N° 5), que segín Martin y col. (1987), determina incertidumbre al precisar cuál de las pruebas provee respuestas más valederas al ser comparadas entre allas y en ausencia de datos de sensibilidad y especificidad.

En conclusión, los resultados obtenidos permiten manifestar que la prueba de ELISA comercial utilizada presenta una mayor sensibilidad que la prueba de SN para el diagnóstico de anticuerpos anti-DVB, que resulta eficiente en la identificación de animales reaccionantes, pudiendo contribuir a evaluar la tasa de infección en estudios epidemiológicos, de manera rápida y sobre grandes poblaciones.

Además, la determinación de animales seronegativos a la prueba, contribuye en forma indirecta a la identificación rápida de animales potencialmente virémicos persistentes, principales responsables de la mantención de la infección en los rebaños.

RESUMEN

El complejo diarrea viral bovina/enfermedad mucosa (DVB/EM), es una enfermedad viral ampliamente diseminada en el mundo y muy importante por su acción a nivel de los parámetros productivos y reproductivos del rebaño. En Chile, se ha informado de prevalencias prediales superiores al 60%, lo que hace necesario disponer de técnicas de diagnóstico lo suficientemente adecuadas y confiables que permitan un diagnóstico rápido y de un gran número de muestras.
El método oficialmente aceptado en el país para el diagnóstico de DVB es la prueba de seroneutralización (SN), la que detecta la presencia de anticuerpos contra el agente causal a nivel del suero sanguíneo y que se considera de buena sensibilidad y especificidad, sin embargo presenta algunas desventajas por la subjetividad de su lectura y lo engorroso de su técnica.
El propósito de esta investigación fue la comparación de la SN (como prueba de referencia), con un "kit" inmunoenzimático (ELISA) comercial, en cuanto a sensibilidad y especificidad en la detección de anticcuerpos anti-DVB. Para ello, sae analizaron 500 muestras de sueros bovinos provenientes de 50 planteles lecheros de la X Región de Chile.
Los resultados obtenidos indican que, SN detectó 278 sueros como positivos mientras que ELISA detecto 347, lo que representa para ELISA una sensibilidad y especificidad relativas de 91% y 57%, respectivamente. Mediante la prueba de McNemar, se establecieron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05), en cuanto al serodiagnóstico obtenido por ambas pruebas y, por medio del método estadístico Kappa, una mediana concordancia entre ellas. Al asociar los títulos de SN con las densidades ópticas resultantes de la prueba de ELISA, se obtuvo una asociación positiva entre esos valores.
Se postula que ELISA detecta mayor número de reaccionantes en virtud a su mayor sensibilidad diagnóstica en relación a SN, por ello resulta ser un método apto para el diagnóstico serológico de grandes poblaciones animales y de manera absolutamente objetiva.

* Financiado por Proyecto FONDECYT 1990717

* Dr.BOMMELI AG, Liebefeld-Berna, SUIZA

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Aceptado: 17.07.2001