DETERMINACION DE LA AUTENTICIDAD DE GRASAS LACTEAS. ANALISIS DISCRIMINANTE LINEAL DE TRIACILGLICERIDOS.

Manuel Pinto C.¹, Marta Contreras O.¹, Erwin Carrasco R.¹, Carmen Brito C.¹, Luz H. Molina C.¹, Kong Shun Ah-Hen ¹ y Salvador Vega y León.^2
1 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567 Valdivia, Chile. ² Departamento de Producción Agrícola y Animal, Universidad Autónoma Metropolitana – Xochimilco, Código Postal 04960, México D.F.
E-mail: mpinto@uach.cl

Recepción originales 27 de noviembre de 2001

ABSTRACT

Determination of authenticity of pure milk fat. linear discriminant analysis of triacylglycerides.

Key word: Milk fat, bovine, adulteration, triacyl glycerides, lineal discriminant analysis.

The addition of non-milk fat of animal or plant origin to dairy products such as fluid milk, milk powder, cheese or butter is considered to be an adulteration.
The purpose of this research was is to propose a methodology using linear discriminating analyses for the detection of adulteration of milk fat with non-milk fat (animal origin) at levels below 10%, with at least 95% of the analysis correctly classified. The derived functions are applicable to pure milk fat samples of the VIII^th, IX^th and X^th regions. Similarly partial discriminating functions applicable to pure milk fat of the said regions were also proposed. The percentage composition of triacylglycerides (C₂₆ to C₅₄) in 72 samples of pure milk fat of milk stored in tanks of six dairy plants was determined. The pure milk fat samples were adulterated with non-milk fat according to a theoretical model at 0 %, 5 %, 10% and 15% within 4 groups (n groups = 72).
The best discriminant function F1 found for the southern zone was:
F1 = 2.4633C₃₄ – 2.69418C₃₆ + 0.895685C₃₈ – 2.09497C₄₀+1.773789C₄₂-1.57736C₄₄
where C₃₄, C₃₆, C₃₈, C₄₀, C₄₂ and C₄₄ are the weight percentages of the weight of triacylglycerides with carbon numbers 34, 36, 38, 40, 42 and 44. This equation allowed the correct classification of 97.2 or 79.1% of the samples adulterated with 10 or 5% of non-milk fat of animal origin, respectively.

RESUMEN

Palabras claves: Grasa láctea, bovino, triacilglicéridos, adulteración, análisis discriminante lineal.

La incorporación de grasas no lácteas de origen vegetal o animal a productos lácteos tales como leche fluida, leche en polvo, queso o mantequilla es considerada una adulteración.
El objetivo de esta investigación es proponer una metodología de análisis discriminante lineal para detectar adulteraciones de grasa láctea con grasa no láctea (origen animal), en niveles inferiores al 10% con al menos el 95% de los casos correctamente clasificados. Las funciones obtenidas son aplicables a muestras de grasa láctea pura de la zona sur (VIII, IX y X regiones). Del mismo modo se proponen funciones discriminantes parciales aplicables a muestras de grasa láctea pura de cada una de las regiones mencionadas.
Se determinó la composición porcentual de triacilglicéridos (C₂₆ al C₅₄), provenientes de 72 muestras de grasa láctea pura de leche de silos de almacenamiento, de seis plantas lecheras. Se procedió a adulterar las muestras de grasa láctea pura, con grasa no láctea, en un modelo teórico al 0%, 5%, 10% y 15%, conformando 4 grupos.
La mejor función discriminante (F1) encontrada para la zona sur fue la siguiente:
F1 =2,4633*C₃₄-2,69418*C₃₆+0,895685*C₃₈– 2,09497*C₄₀ + 1,73789*C₄₂ – 1,57736*C₄₄
en donde C₃₄, C₃₆, C₃₈, C₄₀, C₄₂ y C₄₄ son los porcentajes en peso de los triacilglicéridos con números de carbono 34, 36, 38, 40, 42 y 44. Esta ecuación permitió una correcta clasificación de 97,2 o 79,1 % de muestras adulteradas con un 10 o 5 % de grasa no láctea de origen animal, respectivamente.

INTRODUCCION

En diversos estudios se ha informado que el contenido de la grasa en la leche y su composición en ácidos grasos (AG) y triacilglicéridos (TAG) pueden verse influenciados por diversos factores, como es el efecto de raza (Gibson, 1991, Precht, 1992), estación del año (Piva et al, 1993), los sistemas de alimentación (Precht, 1990, Kennelly, 1996), las condiciones de estabulación y el clima (Bornaz et al, 1993, Bear, 1991, Grummer, 1991, Hinrichs et al, 1992, Palmquist et al, 1993) y la aplicación de la hormona somatotropina bovina (BST) (Bear, 1991) muchos de los cuales interactúan (Bear, 1991, Allore et al, 1997). Los factores que principalmente inducen variabilidad en AG y TAG, son la alimentación y el período del año, y ellos pueden contribuir a enmascarar la adición de grasa extraña a la leche procesada.

La incorporación de grasas no lácteas de origen vegetal o animal a productos tales como mantequilla, quesos, leche en polvo, leche fluida, entre otros, es considerada una adulteración, según la reglamentación nacional vigente (Chile, Ministerio de Salud Pública, 2000, Vega et al, 1998). El análisis del perfil de triacilglicéridos por cromatografía de gases es el método más confiable, hasta el presente, utilizado para la detección de dichas adulteraciones ya sea con grasas de origen vegetal o animal (Timmen, 1991, Collomb y Spahni, 1991, y IUPAC, 1991). Cuando la adulteración es de origen vegetal, su presencia se detecta fácilmente a través del análisis de fitosteroles (b -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol), en niveles de hasta el 1% de adulteración con un 95% de confianza. Sin embargo, la incorporación de grasas no lácteas de origen animal (hidrogenados de pescado, vacuno, manteca de cerdo, entre otros), en niveles de hasta un 10% de adulteración no pueden detectarse con un porcentaje de confianza aceptable, usando métodos convencionales: densidad, índices de refracción, yodo, saponificación, Reichert – Meissl y Polenske, estos últimos referidos a la cuantificación de ácidos grasos volátiles solubles e insolubles en agua, según British Standards Institution 684 (1958), Villanueva, 1987, Vega et al, 1996).

En la literatura existen variados estudios, sobre métodos para la detección de adulteraciones de la grasa láctea, pero muchos de ellos, no han obtenido resultados muy alentadores. Sólo un bajo porcentaje de muestras adulteradas han sido reconocidas como tales. El método convencional más conocido es la determinación de cuocientes entre los valores porcentuales (%m/m) de TAG propuestos entre otros por Parodi (1973) y Guyot (1978).

Timms (1980), mediante una regresión lineal múltiple, logra por primera vez, seleccionar un grupo de tres variables, C₄₀, C₄₂ y C₄₄ (número de carbonos acilados) y define una ecuación que le permite clasificar correctamente con un 99% de confianza las mezclas que incorporaron incluso un 5% de grasa no láctea.
Por otra parte, se ha propuesto la alternativa de un modelo de análisis discriminante lineal (ADL), basado en el análisis cromatográfico de TAG de grasas lácteas adulteradas con grasas de origen animal, logrando dilucidar una función discriminante que caracteriza a la grasa láctea pura, cuya sensibilidad ha demostrado ser una mejor alternativa que cuocientes entre ácidos grasos o número de carbono de los TAG (Precht, 1991, Villanueva, 1987, Ulberth, 1994).

En la presente investigación se propone presentar un modelo de ADL, para la determinación de adulteraciones de grasa láctea con grasa de origen animal, en niveles inferiores al 10%, con al menos un 95% de casos correctamente clasificados, para muestras de grasa recolectadas durante un año, en las regiones VIII, IX y X . En una investigación anterior se demostró que existen diferencias significativas (P<0,05) en la composición de triglicéridos en la grasa láctea de muestras de leche tomadas mensualmente y durante un año, a nivel de silos de plantas de las regiones mencionadas (Shamshiri-Amirkolai, 2001), debido, al parecer, a diferencias en los sistemas de alimentación predominantes en cada región (Balocchi, 1999). Además se presenta una función global que involucra el conjunto de muestras de las tres regiones anteriormente nombradas (Sur de Chile).

MATERIAL Y MÉTODO

Muestras. Las muestras de grasa láctea pura (GLP), fueron tomadas mensualmente y durante un año (junio de 1998 a mayo de 1999), de silos de plantas lecheras. La grasa no láctea (GNL) de origen animal, (margarinas no vegetales) se obtuvieron en el mercado, de tres industrias de la zona, según los esquemas indicados en el Cuadro 1. Ambos tipos de grasas, fueron analizados en forma similar, por cromatografía gas-líquido de TAG, según lo indicado en un trabajo anterior (Pinto et al., 1987) para la obtención de su perfil de TAG.

Cuadro 1:	Procedencia de las muestras de grasa láctea pura (GLP) tomadas en estanques de leche de plantas de la VIII, IX y X regiones, y grasa no láctea, margarinas de origen animal (GNL).
Table 1:	Origin of the samples of pure milk fat (PMF) taken from tanks of dairy plants of the VIIIth, IXth and Xth regions, and of non- milk fat, margarines of animal origin (NMF).

Conformación de grupos adulterados. Para la realización del ADL, se procedió a la formación de los grupos según un modelo de simulación presentado por Villanueva et al (1988), en donde la fórmula empleada fue:

C_i ^MEZ = x C_i ^GNL + (1-x) C_i ^GLP (1)
donde:
C_i: Porcentaje de triacilglicérido con un número de carbono i.
MEZ: Mezcla.
x: Fracción de grasa no láctea.
GNL: Grasa no láctea.
GLP : Grasa láctea pura.
El procedimiento de aplicación de la fórmula (1) puede explicarse más fácilmente a través de un ejemplo: la mezcla Nº1, se obtuvo considerando la muestra de grasa láctea pura Nº6, con un valor de C₃₆ = 0,16 % para GNL, con la muestra de grasa no láctea Nº38, con un valor de C₃₆ = 8,21 % para GLP, ambas obtenidas por elección aleatoria computacional, por lo tanto, el porcentaje del triacilglicérido con número de carbono C₃₆ en la mezcla con un 5% del adulterante (GNL) resultó según la ecuación (1):

C₃₆ ^MEZ = 0,05 * 0,16 ^GNL + (1- 0,05) * 8,21 ^GLP = 7,81 %
De ésta forma, se conformaron cuatro grupos:
Grupo 1: Muestra de grasa láctea pura (0% Adulteración).
Grupo 2: Muestras adulteradas en un 5%.
Grupo 3: Muestras adulteradas en un 10%.
Grupo 4: Muestras adulteradas en un 15%.

Análisis discriminante lineal. En las ciencias aplicadas, frecuentemente ocurren problemas multivariados. Uno de ellos es clasificar una observación en una o varias poblaciones o grupos. El método más utilizado para dicho procedimiento es el ADL, que proporciona una regla basada en un índice llamado función discriminante lineal (F). En el presente estudio se aplicó la técnica discriminante máximo verosímil basada en la distancia de Mahalanobis, en la cual fue necesario comprobar el cumplimiento de ciertos requisitos:

* Los datos de los grupos provienen de una población normal multivariada.
* No existen diferencias entre las matrices de covarianzas de cada grupo.
* Existe diferencia entre los vectores de medias de los grupos, tal que justifica el análisis discriminante.

Para comprobar la normalidad entre las variables de grupo se utilizó la prueba de KOLMOGOROV Y SMIRNOV del programa computacional SPSS.

Para verificar el segundo supuesto, se utilizó la prueba de M de BOX para homogeneidad de covarianzas del programa computacional SPSS.

Finalmente, para verificar el tercer supuesto, se realizó un análisis multivariado de varianza MANOVA, del programa computacional SPSS.

En general la función discriminante es de la forma:
          F = S_iZiCi + A

donde: F = puntaje discriminatorio; Zi = coeficientes ponderados; Ci = variables discriminatorias y A = constante. Los valores A y Zi son determinados por el programa computacional.

Este análisis se desarrolló con todas aquellas variables cuyos Ci fueron menores o iguales a 1 en el adulterante y que correspondieron a los triacilglicéridos C₃₄, C₃₆, C₃₈, C₄₀, C₄₂ y C₄₄, (Figura 1).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los valores promedio y desviaciones estándar de las variables C₃₄, C₃₆, C₃₈, C₄₀, C₄₂ y C₄₄, encontrados para los cuatro grupos formados, se presentan en el Cuadro 2. En dicho cuadro se puede observar, que existe una disminución en los valores promedio de cada una de las variables consideradas, al incrementarse el % del adulterante, lo que se explica debido a la baja incidencia de estos triacilglicéridos en el adulterante (grasa no láctea de origen animal). En forma gráfica (Figura 1), se puede apreciar que los TAG seleccionados, se presentan en cantidades considerables en la grasa láctea pura y que aún estando presentes también en la grasa no láctea (origen animal), con porcentajes inferiores al 1% (C_i < 1), no tienen la misma incidencia y en algunos casos incluso están ausentes.

Figura 1:	Composición de triacilglicéridos de muestras de grasa láctea pura (GLP) y grasa no láctea (GNL).
Figure 1:	Composition of triacylglycerides of samples of pure milk fat (PMF) and non- milk fat (NMF).

La grasa no láctea de origen animal en las margarinas presentó triacilglicéridos con números de carbonos superiores a C₅₄, con porcentajes importantes: C₅₆ (9,5 %); C₅₈ (5,7 %); C₆₀ (2,4 %), los cuales al no estar presentes en la grasa láctea, es una indicación cualitativa de la adulteración de la misma.

Dado que para el ADL se conformaron 4 grupos, matemáticamente fueron posibles 3 funciones discriminantes, pero no todas presentaron la misma capacidad para clasificar las muestras. En el Cuadro 3, se presenta la información necesaria para juzgar dichas funciones. Se puede observar que para la Función 1, el valor de la correlación canónica explica en un 86% la clasificación. Además, se presentan los valores de Lambda de Wilks y sus valores de Ji-cuadrado con su significancia. Claramente se puede aseverar que la primera función (F1) es estadísticamente significativa al 5%. Por lo tanto, todos los resultados clasificatorios se basaron en la Función F1, que para el Sur de Chile (VIII, IX y X regiones) fue la siguiente:

F1 = 2,4633*C₃₄-2,69418*C₃₆+0,895685*C₃₈ – 2,09497*C₄₀ + 1,73789*C₄₂ – 1,57736*C₄₄

la función F₁ clasificó correctamente el 100% de las muestras adulteradas al 15%, el 97,2% y 79,1%, de las muestras adulteradas al 10% y 5%, respectivamente. En promedio, se logró un porcentaje de clasificación correcta de 92,1% (n=288).

La media de los porcentajes de los puntajes discriminantes (centroides) para cada grupo, evaluados por la función F₁ fueron: grupo 1 (-2,309); grupo 2 (-0,765); grupo 3 (0,780) y grupo 4 (2,326). De la misma forma se obtuvieron, funciones discriminantes parciales para cada una de las regiones involucradas.
La función obtenida para la VIII región de Chile se definió como:

F1= 4,62083*C₃₄ - 6,23028*C₃₆ + 2,72306*C₃₈ + 1,78691*C₄₀ - 5,3398*C₄₂ + 4,02125*C₄₄

que obtuvo un porcentaje de clasificación correcta de 91,6% en muestras adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un 10 % o superior (n=48).

La función obtenida para la IX región de Chile se definió como:

F1 = -2,40779*C₃₄ + 3,44448*C₃₆ – 3,29087*C₃₈ + 3,1342*C₄₀ – 1,47466*C₄₂+ 1,69328*C₄₄

que obtuvo un porcentaje promedio de clasificación correcta de 95,8% en muestras adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un 10 % o superior (n=96).

La función obtenida para la X región de Chile se definió como:

F1 = -3,889*C₃₄ + 3,78828*C₃₆ – 0,723933*C₃₈ + 2,15942*C₄₀ – 1,46558*C₄₂ + 1,15839*C₄₄

que obtuvo un porcentaje promedio de clasificación correcta de 77,7% en muestras adulteradas al 5%, y un 100 % en las muestras adulteradas en un 10 % o superior (n = 144).

En la Figura 2, se presentan los porcentajes de clasificación correcta (muestras adulteradas al 5%) de las funciones obtenidas para Sur de Chile, ( regiones VIII, IX y X). Claramente se visualiza que la función resultante para la IX región, cumple con las expectativas planteadas en la hipótesis, puesto que clasifica correctamente más del 95% de los casos adulterados al 5%. Cabe destacar, además que los porcentajes de clasificación correcta con niveles de adulteración del 5%, en la VIII región (91,6%) y X región (77,7%) superan a lo indicado por Guyot (1978), usando el método de estimación de cuocientes, en éste caso C₅₂/C₃₈, para manteca (72,0%) y para grasa de vacuno (C₅₂/C₅₀) (37,0%).

Figura 2:	Clasificación correcta al 5% de adulteración, de las funciones obtenidas para el Sur de Chile, regiones VIII, IX y X.
Figure 2:	Correct classification at 5% adulteration of the functions obtained for the South of Chile (VIII th, IX th and X th regions).

La alternativa del análisis discriminante lineal ha demostrado ser un camino muy aceptable para niveles de adulteración de alrededor del 5 %.

Villanueva (1987), estudió la aplicación del ADL, determinada a partir del análisis de triglicéridos por GLC, de grasas lácteas, de leche de tres rebaños de la Universidad Austral de Chile. Las variables independientes fueron determinadas por el sistema de componentes principales, resultando los números de carbono C₃₄, C₃₆…C₄₄ como mejores variables discriminantes. Con la función ADL resultante, se pudo clasificar correctamente con el 95% de confianza el 97% de mezclas adulteradas en un 5% con grasa no láctea de origen animal. Esto motivó la búsqueda de una función para cada una de las regiones de mayor producción lechera del país (VIII, IX y X regiones).

Precht (1991), propuso una metodología basada en el análisis de triglicéridos, de hidrogenados de aceites vegetales y grasas animales tales como manteca de cerdo y grasa de vacuno. La ecuación de regresión lineal múltiple para detectar manteca de cerdo, propuesta en este caso, incorpora como variables independientes los triglicéridos con números de carbono C₂₆, C₃₂, C₃₄, C₃₆, C₄₂, C₄₆, C₅₂ y C₅₄, determinando un valor de R, para la grasa láctea pura, que fluctúa entre 97,9 y 102,6. Valores de R fuera de este rango indican adulteración de la grasa láctea con un 5% de manteca de cerdo, con un 99% de nivel de confianza; el autor determinó ecuaciones similares para cada tipo de adulterante.

Ulberth (1994), aplicó el método ADL para la detección de adulteraciones de la grasa láctea, considerando la composición de ácidos grasos. Encontró que los ácidos grasos saturados e insaturados de la serie C₁₈, fueron las variables más discriminatorias, identificadas por un procedimiento de selección de variables paso a paso. Sobre el 95 % de las muestras adulteradas en un 3 % con grasa de vacuno, manteca de cerdo, aceite de oliva y aceite de palma, fueron correctamente clasificadas. Las mezclas preparadas con un porcentaje superior fueron detectadas en el 100 % de los casos. Por otra parte Povolo et al (1999), utilizando el método de perfil de TAG, para la detección de grasas extrañas en mantequilla, lograron límites de detección de grasas vegetales y animales entre un 4 y 6 %.

Las funciones discriminantes obtenidas para las regiones VIII, IX y X, pueden clasificar correctamente muestras adulteradas hasta en un 5% con grasa no láctea, en el 91,6%, 95,8% y 77,7% de los casos respectivamente y con un 95% de nivel de confianza, lo cual representa un avance importante para la certificación de la autenticidad de los productos que incorporan grasas lácteas.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue patrocinada y financiada en parte por la Dirección de Investigación y Desarrollo DID-UACH proyecto S-1999040 y por el proyecto FONDECYT Nº 1961046.

Especiales agradecimientos al Sr. Carlos Quintana, estadístico, por su valioso aporte en los análisis estadísticos de los resultados en la presente investigación y a la Srta. Shaparak Shamshiri-Amirkolai B., por su colaboración en el manejo computacional.

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