PREDICCION DE LA CONTRIBUCION ESPECIFICA EN MEZCLAS ELABORADAS CON MUESTRAS PURAS DE TREBOL BLANCO (Trifolium repens) y BALLICA INGLESA (Lolium perenne), MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA CERCANA AL INFRARROJO (NIRS) ¹

Daniel Alomar, Antonio Blanco y Rita Fuchslocher
Instituto de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile. , E-mail: dalomar@uach.cl

Recepción originales 29 de abril de 2002.
¹ Trabajo presentado en la 10^th International Conference on Near Infrared Spectroscopy, junio 2001, Kyongju, Corea del Sur.

ABSTRACT

Prediction of species contribution in mixtures made up with pure samples of white clover (Trifolium repens) and perennial ryegrass (Lolium perenne), by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS).

A study was conducted in order to evaluate the potential of near infrared reflectance spectroscopy (NIRS) for predicting the percentage of white clover and perennial ryegrass in mixtures made up from pure samples of each species. Samples were obtained in five consecutive weekly cuts and 55 mixtures with 0 to 100% of each species (fresh basis) were prepared. NIR spectra were taken in the fresh and dry ground mixtures and calibration models were developed for predicting percentage of each species, as contribution in dry weight (reference data), applying different treatments to the spectral data. Equations were tested by cross-validation. Spectra from pure clover and ryegrass samples showed differences in specific absorption bands. Calibrations with good predictive potential could be developed, according to the cross-validation process, with coefficients of determination (1-VR) above 0.9 and standard errors of ca.6 percentage units for fresh and 4 percentage units for dry samples of either species. It is concluded that NIR can be used as a fast methodology to predict clover and ryegrass composition in mixtures made up from pure samples, without the drawbacks of the tedious and time-consuming traditional hand separation method.

Key words: NIRS, near infrared reflectance spectroscopy, botanical composition, Trifolium repens, Lolium perenne.

RESUMEN

Se desarrolló un estudio para evaluar la capacidad de la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) de predecir el porcentaje de trébol blanco y ballica inglesa, en mezclas elaboradas a partir de muestras puras de cada especie, colectadas en 5 cortes semanales. Se prepararon 55 mezclas incluyendo 0 a 100% (base peso fresco) de cada especie (11 por corte semanal). Los espectros NIRS se colectaron en las mezclas frescas y posteriormente en las mismas secas y molidas, para evaluar ambas modalidades. Se desarrollaron calibraciones para predecir el aporte en porcentaje de peso seco de cada especie a las mezclas, evaluándose mediante validación cruzada. Los espectros de las muestras puras de cada especie mostraron diferencias en bandas de absorción específicas. Mediante regresión de cuadrados mínimos parciales modificados, se obtuvieron calibraciones promisorias para muestras al estado fresco y seco, con coeficientes de determinación de validación cruzada mayores a 0,9 y errores estándar (validación cruzada) de ca. 6 y 4 unidades de porcentaje para muestras frescas y secas, respectivamente. Se concluye que la técnica NIRS se puede utilizar para predecir rápidamente el contenido de trébol y ballica en mezclas de estas especies, sin las limitaciones de la separación manual que es una técnica lenta, tediosa y no exenta de errores.

Palabras clave: NIRS, espectroscopía de reflectancia cercana al infrarrojo, composición botánica, Trifolium repens, Lolium perenne.

INTRODUCCION

La composición botánica es un atributo relevante en la determinación de la condición de una pradera (Coleman et al., 1985). Se han encontrado diferencias en calidad entre especies y cultivares dentro de una misma especie, incluso a un estado de madurez comparable, que en general se relacionan con diferencias en la cantidad y constitución de los carbohidratos estructurales, porcentaje de hojas o presencia de metabolitos secundarios, que afectan la aceptabilidad o digestibilidad por parte de los animales (Lechtenberg y Hemken, 1985). Es reconocido el hecho de que las especies difieren en su valor nutricional, siendo las leguminosas en general superiores a las gramíneas. Este es particularmente el caso del trébol blanco, lo que se explica por su mayor consumo voluntario, degradación ruminal más rápida, mayor eficiencia en la utilización de su energía metabolizable y mayor flujo de proteína no degradable hacia el intestino (Thomson, 1981; Hodgson y Brookes, 1999).

La evaluación de la composición botánica se realiza usualmente mediante separación manual, método tedioso y que demanda importante cantidad de tiempo y trabajo (Shaffer et al., 1990).

La espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) ha demostrado un potencial para predecir la composición botánica de praderas, pero la mayor parte de los trabajos se ha realizado en muestras de forraje secado al horno y molido (Petersen et al., 1987; Wachendorf et al., 1998), lo que representa un avance respecto del método manual, aunque requiere secar las muestras, lo que involucra tiempo y mano de obra en el laboratorio. El objetivo de este trabajo fue evaluar la factibilidad de desarrollar modelos de regresión NIRS para predecir el contenido de trébol blanco y ballica inglesa en mezclas frescas y secas, preparadas a partir de muestras puras de ambas especies.

MATERIAL Y METODOS

El material vegetal se obtuvo de un pradera permanente mixta ubicada en el predio Vista Alegre (39º48’ S; 73º14’ W), de la Universidad Austral de Chile, en la Décima Región del país; en un suelo de la serie Valdivia (Typic Hapludand), sin problemas de drenaje y con un clima templado húmedo, de temperatura promedio anual de 12,1ºC y precipitación promedio anual de 2.500 mm. El forraje obtenido correspondió a trébol blanco (Trifolium repens) cv. Huia y ballica inglesa (Lolium perenne) cv. Nui. Entre noviembre y diciembre del año 2000, se realizaron 5 cortes de las especies puras, en semanas consecutivas (cada 7 días), dejando un residuo de ca. 5 cm. El forraje fresco fue picado con tijeras a un tamaño de alrededor de 1 cm y homogeneizado manualmente.

Se tomaron muestras de cada especie y corte, a las que se determinó el contenido de materia seca en estufa (105ºC, por 24 h). Se prepararon mezclas incluyendo desde 0 hasta 100% de cada especie, con incrementos de 10%, sobre la base del peso fresco. Esto dio como resultado un total de 11 mezclas por corte, con un total de 55 muestras. Con los datos de contenido de materia seca por especie y corte, se calculó la contribución específica en peso seco, para cada mezcla (datos de referencia).

Los espectros NIR se colectaron en las muestras frescas mediante reflectancia entre 400 y 2500 nm, ubicando las muestras en bolsas de polietileno insertadas en una cubeta para forrajes, la que se acomodó en el módulo de transporte conectado a un monocromador de barrido Foss NIRSystems, modelo 6500, manejado por un computador personal mediante el software NIRS II de ISI (Infrasoft International). Luego de colectados los espectros en las muestras frescas, éstas fueron secadas en un horno de aire forzado (65º C, 48 h) y molidas en molino de laboratorio (Thomas Wiley model 4, Arthur Thomas and Co. Philadelphia, PA, USA) con un tamiz de 1 mm. A las muestras molidas se les tomó también el espectro, en celdas circulares con ventana de cuarzo de 35 mm de diámetro y 1 cm de profundidad, puestas en un módulo de rotación conectado al mismo equipo descrito antes.

Los valores espectrales y de referencia se manejaron mediante el software WinsISI II (ISI, 1999), distribuido por Foss NIRSystems. Este programa se usó también para desarrollar las calibraciones.
Los datos espectrales se sometieron al análisis de componentes principales (PC) para reducir la información a unas pocas variables sintéticas, que recogen toda la variabilidad espectral. Mediante el uso de puntajes para cada PC, es posible calcular la distancia (distancia de Mahalanobis) de cada muestra respecto del espectro promedio, definiendo una estructura para la población de muestras (Shenk y Westerhaus, 1994). Mediante esta técnica es posible apreciar visualmente diferencias espectrales entre muestras, ya que una elevada distancia entre muestras estará representando diferencias en la estructura química o en otras variables que afecten al espectro, como por ejemplo el tamaño de partícula. Esta técnica se utilizó para apreciar gráficamente la posible segregación de muestras en función de la contribución de una especie en particular.

Se desarrollaron modelos de calibración, probando diferentes tratamientos matemáticos de los espectros. Se probaron diferentes órdenes de diferenciación, intervalo de sustracción y segmento de suavización. Además se aplicaron tratamientos de corrección de dispersión de luz, combinando la varianza normal estándar (SNV) que ajusta cada espectro a una desviación estándar igual a 1, con el tratamiento “Detrend”, que remueve una distorsión lineal y curvilínea en cada espectro (ISI, 1999). Las calibraciones se desarrollaron mediante el método de regresión de cuadrados mínimos parciales modificados y las mejores ecuaciones se eligieron de acuerdo al error estándar de la validación cruzada (SECV) y al coeficiente de determinación de la validación cruzada (1-VR).

RESULTADOS Y DISCUSION

El conjunto de mezclas frescas y secas mostraron diferencias en las bandas de absorción a lo largo de las regiones visible y NIR. Como una forma de explorar diferencias espectrales atribuibles a las dos especies involucradas, se graficaron los espectros de las muestras puras de trébol y ballica, correspondientes a los 5 cortes, tanto en el estado fresco (Figura 1 a) como seco (Figura 1 b). Se pueden apreciar diferencias aparentes en las bandas de absorción de cada especie. Como ejemplo, en la región de los 1450 nm (Figura 1 a) se observan fuertes bandas de absorción en las que se puede apreciar que todas las muestras de trébol se ubican por sobre las de ballica, las que a la vez se encuentran menos separadas (ver detalle inserto). Esto podría indicar que esta banda de absorción sería útil para discriminar entre especies. Las bandas de absorción en esta zona del espectro corresponden probablemente al elevado contenido de agua de las muestras frescas, aunque en este sector también hay absorción del almidón (Osborne et al., 1993). Es sabido a este respecto, que los tréboles difieren de las gramíneas en cuanto al tipo de carbohidrato de reserva almacenado. En las leguminosas el principal carbohidrato no estructural de reserva es el almidón, en tanto las gramíneas de origen templado, como la ballica, acumulan más bien fructosanos (polímeros de fructosa) como carbohidrato de reserva (Smith y Nelson, 1985). Con respecto a las muestras secas (Figura 1 b), se aprecia (detalle inserto) que existen bandas de absorción que discriminan a ambas especies en el sector de 2180 nm. Los espectros del trébol puro presentan mayor absorción que los de ballica pura en este sector. Esta banda corresponde a absorción de proteínas y estaría reflejando la mayor concentración de proteína de la leguminosa, en relación a la gramínea. El mayor contenido de proteína en tréboles ha sido invocado como causa de diferencias en bandas de absorción (Petersen et al., 1987), lo que confirmaría lo antes indicado. Aunque se espera que existan variaciones debidas a diferencias en los estados de madurez de las muestras colectadas, se acepta que en general la composición nutricional de las leguminosas, particularmente su contenido proteico, es mejor que la de las gramíneas y que además reducen su calidad más lentamente con la madurez (Conrad y Martz, 1985).

Figura 1: Espectros de muestras frescas (a) y secas (b) de trébol blanco puro (TB) y ballica inglesa pura (BI). En el detalle inserto, se destacan bandas de absorción a los 1450nm (muestras frescas) y a los 2180nm (muestras secas), para los diferentes cortes (C1 a C5). Figure 1: Spectra of fresh (a) and dry (b) samples of pure white clover (TB) and perennial ryegrass (BI). In the insert, absorption bands at 1450 nm (fresh samples) and at 2180 nm (dry samples) are enhanced for different cuts (C1 to C5).

Al examinar los puntajes de los vectores obtenidos mediante el análisis de PC, se pudo detectar que los primeros 9 PC explicaron el 99,38% de la variación espectral para las muestras frescas. En este caso el análisis se hizo aplicando a los datos espectrales un tratamiento matemático de segunda diferenciación, con un intervalo de substracción de 10 puntos y un segmento de suavización también de 10 puntos (2,10,10). No se aplicó un tratamiento de corrección por dispersión de luz. Los PC 1, 2 y 3, explicaron (en forma acumulativa) el 58,10; 80,92 y 94,15% de la variabilidad espectral, respectivamente. En el caso de las muestras secas, se aplicó un tratamiento 1,5,5, sin corrección de dispersión y los primeros 3 PC explicaron, en forma acumulativa, un 68,82; 83,96 y 93,09% de la variabilidad espectral. En este caso el cálculo de la distancia espectral también se realizó con los primeros 9 PC, que en conjunto explicaron un 99,06% de la variabilidad espectral. Al graficar la posición de los espectros de las muestras frescas (Figura 2 a) y secas (Figura 2 b) de acuerdo a la distancia H global, considerando los puntajes de dos PC relevantes, se aprecia una clara segregación del material vegetal. En el gráfico se ha identificado a las quince muestras con mayor contenido de cada especie y se puede ver que las muestras frescas (PC 2 y 4) con mayor contribución de trébol se ubican al lado izquierdo, en tanto que aquellas con mayor porcentaje de ballica se encuentran al lado derecho. Esto indicaría que el puntaje para el PC2 permitiría discriminar estas muestras según su porcentaje de trébol y ballica. Lo mismo se puede ver en el caso de las muestras secas (PC 1 y 2), en que la mayor parte de las muestras con elevado porcentaje de ballica se concentran en el cuadrante superior izquierdo, en tanto que la mayoría de las muestras con elevado aporte de trébol, lo hacen en el sector inferior y a la derecha. En este caso, el PC1 tiende a discriminar en mayor medida, ya que las muestras tienden a separarse a lo largo de este eje. Aquellas con mayor contenido de la gramínea presentan por tanto un valor de diferente magnitud para ese vector, en relación a las muestras ricas en la leguminosa. Es interesante destacar que este efecto se puede ver afectado por la madurez del forraje. Así, las muestras correspondientes al quinto corte, que representan forraje en estado de madurez más avanzada en relación al resto, se agrupan en el sector superior derecho (línea punteada), quedando varias muestras ricas en trébol con un valor similar a la gramínea, en términos del PC1. Sin embargo, en este caso el PC2 tiende a separarlas.

Figura 2: Ubicación de espectros según distancia H global de muestras frescas (a) de acuerdo a los puntajes de componentes principales 2 y 4 y lo mismo para muestras secas (b), de acuerdo a los componentes principales 1 y 2. Se destacan aquellas quince muestras con mayor porcentaje (subíndice) de ballica (B) y trébol (T). La línea punteada (.........) encierra muestras secas del 5º corte. Figure 2: Spectra of fresh samples (a) plotted by their global H distance according to the scores of principal components 1 and 2. Those 15 samples with higher percentage (subindex) of ryegrass (B) and clover (T) are identified. Dotted line (.........) encircles dry samples of the 5th cut.

Las mejores ecuaciones obtenidas para muestras frescas y secas, para predecir la contribución de cada especie al peso seco de la mezcla (Cuadro 1) mostraron elevados valores para 1-VR (mayores a 0,95) y, si bien los términos de incertidumbre (SECV) representan errores de predicción del orden de 4 (muestras secas) a 6 (muestras frescas) unidades de porcentaje, presentan una relación favorable respecto de la desviación estándar de los datos de referencia. Se acepta que una ecuación posee buenas perspectivas para la predicción basada en el espectro cuando el error estándar de predicción no supera el equivalente a un tercio de la desviación estándar de los datos de referencia (Kennedy et al., 1996). Si se asume como válido este criterio también para el SECV, puede considerarse que las ecuaciones que se han desarrollado serían útiles para predecir el porcentaje de cada especie en mezclas de ambas. Esto se ve confirmado al graficar los valores de referencia con los valores predichos por las ecuaciones NIRS (Figura 3), donde se aprecia que los puntos se encuentran muy cercanos a la línea de igual respuesta, particularmente en el caso de las muestras secas. El mejor valor predictivo de estas últimas no estaría dado por un mejor ajuste en términos del coeficiente de determinación, ya que los valores (1-VR) fueron similares a los de las muestras frescas, sino más bien porque el error que se cometería en la predicción (SECV), sería menor.

Figura 3: Contribución porcentual real (valores de referencia) y predicción mediante NIRS de a: trébol blanco (o ballica inglesa) en muestras frescas (tratamiento matemático: 1-15-15-1, SNV+Detrend), b: trébol blanco en muestras secas (tratamiento matemático: 1-5-5-1, sin corrección de dispersión de luz) y c: ballica inglesa en muestras secas (tratamiento matemático 1-5-5-1, sin corrección de dispersión de luz). Para más detalles, ver texto. Figure 3: Actual (reference values) and NIRS predicted percent contribution of a: white clover or perennial ryegrass in fresh samples (math treatment: 1-15-15-1, SNV+Detrend), b: white clover in dry samples (math treatment: 1-5-5-1, no scatter correction treatment) and c: perennial ryegrass in dry samples (math treatment: 1-5-5-1, no scatter correction treatment). For more details, see text.

Es interesante destacar que las ecuaciones seleccionadas para predecir contenido de trébol blanco y ballica en las mezclas al estado fresco, fueron similares en cuanto al tratamiento matemático para obtenerlas. Esto probablemente resulta de combinar porcentajes complementarios de sólo dos componentes en incrementos fijos. De esta manera, los datos de referencia presentan incrementos de diez unidades porcentuales en una especie, a medida que la otra decrece en la misma magnitud, lo que determina promedios y desviaciones estándar idénticos para ambas especies, en los datos de referencia. Esta situación representa un caso de intercorrelación, ya que, por ejemplo, una mezcla con un 10% de ballica inglesa tendría la misma “señal” espectral que aquella con un 90% de trébol y así sucesivamente. Esto constituye un inconveniente, ya que probablemente limitaría el uso de estas ecuaciones a mezclas que contengan únicamente a ambas especies. Lo anterior no invalida sin embargo, el hecho de que cada especie pura es capaz de generar señales espectrales características, como se mencionó antes.
El ajuste entre valores de referencia y predichos por NIRS de las ecuaciones desarrolladas con muestras secas y molidas, tiende a ser mejor (1-VR de 0,98 a 0,99) que el ajuste de las ecuaciones desarrolladas para muestras frescas y picadas (1-VR de 0,96). Al mismo tiempo el error estándar en el caso de las muestras frescas es mayor que aquel para las muestras secas. Esto se explicaría porque en muestras frescas hay más factores que estarían afectando las señales espectrales. Entre ellos, el contenido de agua, un mayor tamaño de partícula, que determina a la vez una mayor heterogeneidad del tejido vegetal y mayor probabilidad de presencia de espacios de aire en la cubeta utilizada para forrajes frescos.

Con respecto a los tratamientos matemáticos examinados, las mejores ecuaciones obtenidas se desarrollaron con tratamientos que incluyeron entre una primera a tercera substracción de segmentos suavizados del espectro. Este tratamiento de “pseudoderivación” del espectro, ha demostrado ser valioso para obtener ecuaciones de predicción de diferentes fracciones para forrajes (Norris et al., 1976; Barton, 1989). Lo mismo es válido para los tratamientos de corrección de dispersión de luz, aunque en el presente estudio estos tratamientos no siempre fueron útiles. Entre los tratamientos con menor grado de diferenciación, destacó para muestras secas, el tratamiento 1-5-5 (primera derivada, con un intervalo de diferenciación de 5 puntos de datos y un segmento de suavización de 5 puntos de datos), similar al mejor tratamiento aplicado por Wachendorf et al., (1999), quienes trabajaron con mezclas de gramíneas y trébol.

Podría especularse sobre la utilidad que tendría el aplicar las ecuaciones obtenidas en este trabajo, generadas a partir de mezclas “fabricadas” mediante la combinación de diferentes proporciones de dos especies puras, en la predicción del contenido de estas especies en muestras obtenidas de praderas reales, que son generalmente polifíticas. Esto no formó parte de los objetivos de este trabajo. Sin embargo, una aproximación comparable ha sido validada por otros autores (Petersen et al., 1987; Coleman et al., 1990), trabajando con especies diferentes a las evaluadas aquí.

Como proyección de este trabajo, se encuentra en marcha una investigación en que se está evaluando muestras de praderas polifíticas, obtenidas en distintas épocas y lugares, a fin de estimar la posibilidad de predecir el porcentaje de diferentes especies en condiciones “reales”.

CONCLUSIONES

Cada especie demostró poseer rasgos espectrales característicos, al exhibir bandas de absorción a longitudes de onda específicas y al posicionarse en diferentes sectores del espacio definido por los valores propios de los componentes principales que explican la mayor variabilidad espectral.

Es posible obtener ecuaciones de predicción NIRS para predecir el contenido de trébol blanco y ballica perenne en mezclas de ambas especies, en forma rápida y con suficiente precisión.

Las mejores ecuaciones se lograron en este estudio, con una primera o tercera derivación del espectro para las muestras al estado fresco y con una segunda o tercera derivación para las muestras secas y molidas.

La predicción de la contribución en peso seco de cada especie, puede lograrse en menor tiempo y con una buena, aunque menor exactitud, cuando se utilizan las muestras frescas y picadas, en lugar de secas y molidas. Cualquiera de las dos formas de colectar el espectro permitiría hacer estimaciones más rápidas y menos laboriosas que la metodología tradicional de separar las especies manualmente, particularmente cuando se requiere analizar un importante número de muestras.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT). Proyecto 1000432.

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