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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NATIVAS DEL GÉNERO Bacillus Cohn ANTAGONISTAS DE CEPAS PATÓGENAS DE Fusarium Link. en cala

Isolation and identification of native bacteria of the genus Bacillus Cohn antagonistic to pathogenic strains of Fusarium Link. in calla

Elizabeth Venegas G. ¹, Luigi Ciampi P. ¹, Luis Collado G. ¹, Marcia Costa L. ², Ricardo Fuentes P. ¹, Juan Nissen M. ³, Renate Schobitz T. ², y Mauricio Schoebitz C. ¹

¹Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. ² Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. ³ Instituto de Ingeniería Agraria y Suelos. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile. E-mail:eliza.venegas@gmail.com

The production of colored calla (Zantedeschia spp. Spreng) in Chile involves an intensive system, usually under greenhouse conditions. This type of production can lead to the presence of diseases, such as those caused by fungi included in the genus Fusarium Link. The objective of this study was to isolate bacteria of the genus Bacillus Cohn that are able to inhibit the growth of 60 strains of fungi Fusarium oxysporum Schlecht and F. solani (Mart.) Sacc., under in vitro conditions. Both of these fungi cause wilt in calla plants growing under greenhouse conditions. Bacteria of the genus Bacillus were isolated from calla stems, tubers, flowers and root samples. All isolates were challenged to 60 strains of both species of Fusarium. Tests were performed on Petri dishes containing potato dextrose agar. Of the 138 Bacillus spp. isolated and tested, only 6 inhibited all Fusarium species evaluated. Five of these were obtained from a stem sample and one from a root sample. Scanning electron microscopy showed that these Bacillus isolates caused morphological changes to the Fusarium species. The isolates of Bacillus were then tested to detect pathogenicity on calla tuber tissue. Results showed that strains grew on the surface due to starch availability without causing damage to calla tubers. The isolates studied were found to belong to the group Bacillus subtilis Ehrengberg.

La producción de las calas de colores (Zantedeschia spp. Spreng) en Chile es de carácter intensivo, siendo la mayoría cultivada en invernadero. Este tipo de producción provoca la presencia de diversas enfermedades, entre ellas las causadas por hongos del género Fusarium Link. El objetivo general de esta investigación fue aislar bacterias del género Bacillus Cohn que logren inhibir bajo condiciones in vitro, el crecimiento de 60 cepas de hongos pertenecientes a las especies Fusarium. solani (Mart.) Sacc. y Fusarium oxysporum Schlecht, ambos agentes causantes de marchitez en calas. Para este propósito se aislaron bacterias del genero Bacillus desde muestras de tallos, tuberos, flores y raíces de calas de colores, que fueron enfrentadas a 60 cepas de Fusarium correspondientes a cada una de las especies. Las pruebas de inhibición se realizaron en placas Petri con agar papa dextrosa. El resultado de estos experimentos, fue que de un total de 138 bacterias sólo seis tuvieron la característica de inhibir en distintos grados el crecimiento todas las cepas de Fusarium examinadas. Cinco de estas provenían de una muestra de tallos y uno de raíces. Mediante microscopía electrónica de barrido se pudo apreciar un efecto de las cepas de Bacillus estudiadas sobre ambas especies de Fusarium. Luego de realizada esta etapa se hizo una prueba de patogenicidad de los aislamientos de Bacillus sobre los tuberos de calas; el resultado mostró que las cepas se desarrollan sobre la superficie de las rodajas asociadas a la hidrólisis del almidón de los tuberos de calas, sin causar daños intensivos a los tejidos. Finalmente, mediante pruebas específicas se determinó que las cepas seleccionadas, pertenecen al grupo de Bacillus subtilis Ehrenberg.

Las calas de colores (Zantedeschia Spreng), son valoradas por sus hermosos colores y larga duración (Hertogh y Le Nard, 1993). En Chile, comenzaron a ser comercializadas y exportadas a partir de los años 90 a diversos países (Fundación Chile, 2003).

Debido a su producción intensiva bajo invernadero, pueden presentar importantes problemas fitosanitarios. El micro ambiente generado es propicio para el desarrollo de diversos agentes fitopatógenos, destacando los hongos (Ciampi, 2005). En el año 2005 se detectó en un vivero de cala, en la Décima Región, Chile, la presencia de Fusarium solani (Mart.) Sacc, y Fusarium oxysporum Schlecht, causantes de marchitez vascular en calas y otros cultivos (Alvarado, 2005). Los integrantes de este género se caracterizan por ser cosmopolitas y polífagos, y su desarrollo e incidencia se favorece en invernaderos. Frente a esta problemática, se plantea el control de agentes fitopatógenos mediante sistemas preventivos. En la actualidad existe una tendencia mundial a aplicar medidas culturales o control biológico (Paulitz y Belanger, 2001).

El género bacteriano Bacillus Cohn incluye especies antagonistas de numerosos patógenos vegetales. Las características propias de este grupo las hace resistentes a diversas condiciones del medio ambiente, lo que sugiere que puedan ser comercializadas como ingredientes de biopesticidas, ya que son formadoras de endosporas, las cuales pueden permanecer en dormancia por largos períodos y resistir condiciones desfavorables (Claus y Berkeley, 1984; Madigan et al., 1998; Baker y Cook, 1989; Bernal et al, 2002). Varias especies de Bacillus producen metabolitos antimicrobianos, algunos de los cuales son termoestables (Bernal et al., 2002).

La presente investigación tuvo como objetivo central la selección e identificación de aislamientos bacterianos del género Bacillus, antagonistas in vitro de cepas de F. solani y F. oxysporum, identificados como patógenos vasculares de calas de colores.

Este trabajo se realizó entre los años 2004 y 2005 en el Laboratorio Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrarias, del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile, Valdivia. El material biológico utilizado se obtuvo de dos invernaderos comerciales ubicados en la localidad de Cayumapu, a 30 km al norte de la ciudad de Valdivia. El material utilizado para los aislamientos y búsqueda de antagonistas consistió en muestras de tallos y tuberos de cala como suelo de la rizosfera.

Para efectuar las pruebas de antagonismo, se utilizaron 12 cepas patógenas de F. solani y 48 de F. oxysporum (Alvarado, 2005). Para la selección de los antagonistas se utilizaron 20 muestras de calas adultas, propagadas desde calas sanas de diferentes variedades. Además, se utilizaron 27 tuberos sanos y de calibre similar para ser empleados en las pruebas de inocuidad de los antagonistas seleccionados.

Para la selección de Bacillus spp. a partir de las 20 plantas sanas de calas se tomaron por separado los tuberos, raíces, hojas, tallos y flores los que fueron procesados de acuerdo con lo descrito por Claus y Berkeley (1984). Los aislamientos obtenidos fueron almacenados en tubos con agar peptona inclinado para ulteriores estudios.

Una fase inicial consistió en tomar todos los aislamientos bacterianos y enfrentarlos a dos cepas tipo de F. solani y F. Oxysporum siguiendo el procedimiento de Ciampi y Tewari (1990). De este primer proceso solo se seleccionaron los aislamientos bacterianos que inhibieron el crecimiento de las dos especies de Fusarium. Los aislamientos seleccionados correspondieron al género Bacillus según lo descrito por Baker y Cook (1974).

En la segunda etapa, las bacterias aisladas, que resultaron ser positivas en la inhibición de las dos cepas, fueron enfrentadas a las 60 cepas de Fusarium, repitiéndose lo anteriormente efectuado, para comprobar la inhibición de las demás cepas. Para observar el efecto antagonista de los aislamientos de Bacillus spp. sobre cepas de F. solani y F. oxysporum, se sometieron a observación mediante microscopía electrónica de barrido (MEB), de acuerdo a métodos convencionales según el protocolo utilizado en el Laboratorio de Microscopía del Instituto de Embriología, en la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile¹.

Los resultados de antagonismo biológico se sometieron a análisis de conjunto y tablas de Contingencia, mediante el programa computacional SPSS. Con este proceso se seleccionaron las cepas con mejor aptitud antagonista.

Los aislamientos de Bacillus spp. antagonistas que demostraron una marcada antibiosis se evaluaron para establecer su inocuidad en tejidos sanos de tuberos de cala. Para ello se utilizó el método de Lapwood y Read (1985) inoculando 27 tuberos sanos del mismo calibre y de la variedad de cala Florex Gold. Como testigo positivo se usó una cepa de Erwinia carotovora causante de pudrición húmeda, y dos testigos negativos, uno seco sin inocular y otro húmedo donde sólo se aplicó agua estéril.

Para el análisis taxonómico de los aislamientos se utilizaron dos análisis fenotípicos: el sistema API BioMérieux (API 50CH complementado con API 20E), descrito por Logan y Berkeley (1984) y el sistema clásico presentado por Gordon et al. (1973) y Claus y Berkeley (1974). Para corroborar la identificación también se sometió a algunas cepas a MEB de acuerdo al procedimiento ya descrito.

Los aislamientos seleccionados fueron liofilizados de acuerdo a este protocolo: cada cultivo se cultivó en caldo peptona durante 24-48 h. Luego se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante; esto originó un precipitado, el cual fue resuspendido en leche descremada estéril al 20%., posteriormente se congeló en nitrógeno liquido a -196° C durante 5 minutos. Finalmente los frascos se introdujeron al equipo y se liofilizaron a -5 Torr durante 24 h.

De acuerdo a los procedimientos utilizados en esta investigación se obtuvo en forma pura 138 aislamientos bacterianos, todos del género Bacillus, provenientes de muestras de tallos, base de tallos, tuberos, flores y raíces de calas de colores. Estos resultados confirman lo descrito por otros investigadores respecto de la abundancia de especies de Bacillus en este tipo de material vegetal (Madigan et al., 1998). Por otra parte, Claus y Berkeley (1984) afirman que la principal fuente de búsqueda de aislamiento de Bacillus es el suelo. Las endosporas al ser transportadas por el viento y otros mecanismos de diseminación, logran colonizar diversos lugares, incluso la superficie de las plantas. Es así como se explica la presencia de Bacillus spp en diversos órganos aéreos de las calas. Por lo tanto, el procedimiento utilizado fue útil para la selección de bacterias Gram positivas formadoras de endosporas, catalasa positiva.

En una primera prueba de antagonismo, solo 15 de 138 aislamientos, clasificados como Bacillus spp., inhibieron el crecimiento de los cultivos F. solani y F. oxysporum in vitro. Estos resultados concuerdan con Fravel (1988) y Weller (1988), en el sentido que existen cepas de Bacillus con actividad antagónica a hongos fitopatógenos en la naturaleza.

En una segunda prueba de antagonismo, los 15 aislamientos antagónicos previamente obtenidos, presentaron actividad antagónica contra las 60 cepas de Fusarium spp, luego de siete días en condiciones in vitro (Figura 1). Este efecto antagónico se mantuvo al menos 14 días. Sin embargo, las colonias fúngicas, al comienzo de la segunda semana, cambiaron su morfología y continuaron creciendo en el interior de la placa.

En alguna medida esto sugiere la gran capacidad de estos hongos para modificarse de acuerdo a las condiciones ambientales (Booth, 1975). A pesar de esto, los cultivos de Fusarium spp. no lograron crecer sobre algunos de los aislamientos de Bacillus spp ( N° 44, 10, 9, 8, 7 y 6). Inclusive, en su mayoría no pudieron crecer alrededor de las bacterias, dejando un marcado halo de inhibición.

Aunque no se investigó la acción especifica inhibitoria de los aislamientos seleccionados responsables de alterar el crecimiento in vitro de las cepas de Fusarium, según la literatura consultada, generalmente estas bacterias actúan por el mecanismo de antibiosis (Baker y Cook, 1974; Fravel, 1988 y Bernal et al., 2002).¹

La microscopía electrónica de barrido realizada demostró que los aislamientos antagonistas de Bacillus spp produjeron alteraciones morfológicas en las hifas de Fusarium spp. Este efecto se puede apreciar en la Figura 2, en la cual se evidencian los cambios que se ocasionan en las hifas de F. solani localizadas frente a un medio saturado de acción antagonista (C y D), y otro libre de esta (A y B). En este último caso, se advierte una mayor cantidad de macroconidias, micelio y fiálides bien constituidas. Los mismos efectos son apreciados para el caso de F. oxysporum (Figura 3). En la figura 2 A y B se percibió el crecimiento normal del hongo, mientras que en C se apreciaron macroconidias con pequeñas invaginaciones producto de la acción inhibitoria bacteriana (flechas), y en D se observa un micelio ligeramente mas delgado y menos denso. Estos resultados explican en parte, el efecto antagónico evaluado de los aislamientos de Bacillus. Es probable, que la detención del crecimiento por parte de los cultivos de Fusarium sometidos a esta presión biológica se deba a una alteración de las hifas o bien a perforaciones de las paredes de estructuras como las observadas en las macroconidias.

En la Figura 4 se muestra el desarrollo de un análisis con tres conglomerados, en donde las bacterias seleccionadas como antagonistas pertenecen al tercer conglomerado (flecha), caracterizadas como las de mayor éxito en su acción inhibitoria sobre Fusarium, estas son el 4,3% del total de cepas aisladas desde las muestras de plantas. Este resultado es menor al compararlo con lo descrito por Fravel (1988) quien demostró que se debería obtener un 40% de cepas antagonistas del total de cepas aisladas. Además este autor señala que existen posibilidades de que las cepas seleccionadas como antagonistas in vitro (sobre agar), también lo sean en el suelo, mientras que las que son inefectivas en el agar, también lo serán en el suelo.

Cabe destacar que cinco de las seis cepas antagonistas seleccionadas, provinieron de tallos aéreos (filoplano) y sólo una cepa procedió de muestras de raíz (rizósfera). Blakeman y Fokkema (1982), explican que la rizósfera se caracteriza por ser un micro ambiente mucho más estable que el filoplano. Esto permite un mejor desarrollo de los microorganismos, siendo, por esto más exitoso el control biológico en el control de enfermedades radicales.

Tablas de contingencia. Se realizó este análisis para observar la relación entre la virulencia e inhibición de las cepas de Fusarium. En el Cuadro 1, se visualiza que la mayor cantidad de cepas fúngicas presentan virulencia intermedia (45 cepas), es decir, producen marchitez vascular leve e intensa en las plantas; entre los síntomas más graves (enanismo y caída de plántula) existen 13 cepas; en tanto que solo se lograron identificar dos cepas inocuas para las plantas.

Con relación a la interacción entre virulencia de los aislamientos de Fusarium e inhibición de estas por parte de Bacillus, las cepas fúngicas más virulentas, son inhibidas en su mayoría en un grado intermedio (67%) y el 33% restante tiene un mayor nivel de inhibición. El 64% de las cepas de Fusarium causantes de marchitez vascular leve, presenta una inhibición alta por parte de las cepas antagonistas; mientras que los agentes que provocan marchitez vascular intensa, muestran un menor porcentaje (55%).

Las cepas fúngicas que provocan enanismo en plantas de calas, son inhibidas en nivel medio y alto con un 50 % cada una. Este efecto también es observado en aquellas cepas del hongo que no producen síntomas, lo que indicaría que el efecto inhibitorio de las cepas es, probablemente, dependiente de factores de virulencia de Fusarium spp.

Todo lo descrito anteriormente, demuestra que la mayoría de las cepas de Fusarium, presenta una inhibición de crecimiento con halo y que las cepas con virulencia de carácter intermedio son las mayormente inhibidas.

Por último, para relacionar a las especies de Fusarium y su grado de inhibición, se llevó a cabo un análisis de Tabla de Contingencia. Esto se observa en el Cuadro 2; aquí destaca la presencia de una mayor cantidad de cepas de la especie F. oxysporum. Cabe señalar que éstas muestran un mayor grado de virulencia, con respecto a la otra especie (Alvarado 2005).

En el Cuadro 2 se advierte además que el 50% de las cepas de F. solani, presentan una inhibición intermedia causada por las seis cepas de Bacillus, con un porcentaje menor (42%) de cepas que presentan un nivel alto de inhibición; y por un 8%, que en promedio, no pudo ser inhibido. F. oxysporum, es inhibida en mejor forma, ya que el 58 % de esta especie muestra el puntaje mayor de inhibición, y el 42% muestra una inhibición intermedia causada por las seis cepas.

Según lo discutido anteriormente, se puede señalar que las cepas de Bacillus seleccionadas, son antagonistas in vitro de la especie de Fusarium más virulenta que ataca a las plantas de calas de colores, sin embargo, este efecto sería menor frente a las cepas de la especie de Fusarium menos virulentas.

Todas las cepas de Bacillus evaluadas, al compararlos con las testigos, presentaron un crecimiento superficial en las rodajas de tuberos de cala. Este desarrollo es escaso y no implica un avance al interior de las rodajas. De hecho, el género Bacillus no es considerado un patógeno vegetal, su relación con las plantas es esporádico y accidental (Buddenhagen, 1970).

Posteriormente, se realizó una tinción de Gram para observar las bacterias en los tuberos y comprobar la pureza de los cultivos. El resultado de esta mostró la presencia de endosporas dentro de todos los órganos; esto quiere decir que las bacterias entraron en la fase estacionaria, lo que implica una falta de condiciones adecuadas para su desarrollo (Claus y Berkeley, 1984; Madigan et al., 1998).

El crecimiento superficial de las cepas seleccionadas se explica, como el resultado de la hidrólisis del almidón, presente en la superficie de cortes de los órganos, lo que deja expuestos los amiloplastos en la superficie del tejido, es decir, estas bacterias licuan el almidón accesible por las condiciones del ensayo. Las bacterias del género Erwinia, presentes dentro del grupo de testigos positivos, actúan de una forma diferente, ya que degradan la pectina presente en la lámela media por acción de sus pectinasas. De esta forma, se logra una perdida de estructura del tejido vegetal y el licuado del sustrato, por esta razón esta bacteria logra avanzar a través del tejido de los tuberos (Ciampi, 2005).

Sistema API. Esta técnica no fue concluyente, ya que según el fabricante, el porcentaje de identificación en el primer caso es de «débil discriminación», en donde se relaciona las cepas N° 6, 7, 8, 9 y 44 con la especie Bacillus megaterium Bary en un 53,5%, con un índice de tipicidad de 0,6 (carácter típico del perfil estudiado). Además, se observó que la cepa N°10 pertenece a la misma especie con una caracterización más certera, mostrando un 78,6%, con índice de tipicidad de 0,6; pero este análisis se señala como «identificación no fiable», por lo cual es necesario comprobar este proceso de identificación con un sistema complementario.

Sistema tradicional. Con este sistema se concluyó que se trata de Bacillus subtilis Ehrenberg. Macroscópicamente las colonias se caracterizaron por poseer un tamaño y forma irregular; también .tienen margen ondulado, color blanco y textura seca. En forma microscópica, se observan como bacterias que no forman cadenas, cuyas endosporas son centrales y ovaladas; el resumen de las pruebas se muestra en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Características de los aislamientos de Bacillus spp. para determinar la especie.
Table 3. Characteristics of isolates of Bacillus spp. to characterize their species.

Logan y Berkeley (1984) señalan que existe una cierta similitud entre las especies B. subtilis y B. megaterium, por lo que se tiende a confundirlas en el sistema API, además, señalan que la especie B. subtilis, presenta una gran semejanza con otras especies de carácter intermedio, por esto se les denomina el «grupo Bacillus subtilis». Cabe destacar la publicación de Reva et al. (2001), que subdivide las especies del género Bacillus, posicionando en el mismo grupo (grupo IV) las especies del grupo B. subtilis y B. megaterium (entre otras especies).

Claus y Berkeley (1984), señalan que una forma de diferenciar las dos especies de Bacillus es observar si producen acetoína, según esto frente a la prueba de Voges Proskauer (V.P.), la especie B. subtilis es positiva, lo que significa que puede degradar glucosa por vía fermentativa, mientras que B. megaterium es negativo, lo que se visualiza en el Cuadro 3, columna 9.

Además, B. megaterium se destaca por tener un ancho de 1,2 -1,5 mm y un largo de 2-5 mm; mientras que el ancho de B. subtilis varía entre 0,7 -0,8 mm y un largo de 2-3 mm (Claus y Berkeley, 1984). Según esto, se midieron las cepas bacterianas, mostrándose que el ancho promedio de cada una no supera 0,67 mm y el largo promedio no fue mayor a 1,67 mm (Figura 5). Con esta información complementaria, se logra establecer que se trata de bacterias que pertenecen al grupo de Bacillus subtilis, como se muestra en la Figura 5.

Por último, Logan y Berkeley (1984), señalan que dentro del grupo de B. subtilis, existen cuatro especies, estas son: B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis y B. amyloliquefaciens; las que se logran diferenciar a través del sistema API, morfología de las cepas, estudios de reasociación de ADN y por cromatografía de gases por pirólisis. Por esto, es necesaria la realización de otras pruebas, sobre todo de carácter genotípico, para identificar la especie en forma detallada; lo que en este estudio no se hizo por falta de tiempo. Finalmente todas las cepas de B. subtilis fueron liofilizadas con tres muestras de cada espécimen, para un posterior estudio.

-En el filoplano y rizósfera de plantas de calas de colores, existen cepas bacterianas silvestres del género Bacillus que son capaces de inhibir el crecimiento in vitro de cepas patógenas de Fusarium solani y F. oxysporum. Sin embargo, la mayoría de los aislamientos obtenidos en este trabajo fueron antagónicos contra una de las dos especies de Fusarium. Existen evidencias que demuestran los daños morfológicos en las hifas de Fusarium spp expuestas a la acción de aislamientos antagónicos de Bacillus spp.

-Existió una escasa presencia de cepas de Bacillus antagonistas in vitro de las dos especies de Fusarium, ya que solo 4,3 % de los aislamientos bacterianos totales, presentan esta característica.

-El método tradicional del manual de Bergey's, fue más adecuado para la identificación de las bacterias que el sistema API de galerías dado el bajo porcentaje de similitud entregado.

-Seis cepas mostraron antagonismo a ambas especies de Fusarium, todas ellas pertenecientes al grupo de Bacillus subtilis.

-La inhibición de crecimiento fue mayor en cepas de la especie F. oxysporum, caracterizándose estas por presentar mayor virulencia hacia las plantas de calas de colores que F. solani.

-Mediante microscopía electrónica de barrido se percibe que hay un daño morfológico de las especies de Fusarium al ser expuestas a los aislamientos de Bacillus spp.

-Las pruebas de patogenicidad no mostraron un posible daño que ocasionarían las cepas de B. subtilis sobre tuberos de calas de colores.

-Mediante liofilizado, se preservaron las seis cepas seleccionadas, para continuar con estudios posteriores.

Este trabajo de investigación fue realizado gracias a los aportes del Proyecto Fondef DO3I 1140: «Formulaciones y estrategias para mejorar el biocontrol de enfermedades en cultivos de elevada importancia socioeconómica en Chile. Modelos Rhizoctonia solani en papas y Erwinia carotovora en calas».

¹ Profesor Orlando Garrido. Med. Vet., Dr. en Ciencias. Instituto de Embriología. Facultad de Ciencias. Universidad Austral de Chile.

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