Giovambattista G., M.V. Ripoli, P. Peral-García,
J.C. De Lúea, F.N. Dulout
Centro de Investigaciones en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA),
60 y 118, CC 296,1900
La Plata, Argentina, ggiovam@fcv.medvet.unlp.edu.ar.
Fecha recepción originales 28 de mayo de 1998
Mapping of QTLS associated with milk production: Present status.
Key words: Genetic markers, QTLs, milk production, experimental designs,
domestic animals.
In 1923 Karl Sax, identified for the fírst time, loci affecting quantitative traits through linkage to Mendelian marker loci in Phaseolus vulgaris. Several decades later, the first studies about molecular markers and their possible association with milk production in domestic animals began. These studies were focused to the analysis of blood groups and biochemical polymorphisms. These results were contradictories because the different associations reported by the distinc groups were not coincident. For this reason it was necessary to develop simultaneously statistical methodology and tipification technology. In the last years the analysis was focused to the candidates genes and to sean the genome through microsatellites. The results evidenced that these markers are usefull for QTLs mapping. On the other hand, the improvement of experimental designs was an important fact to identify genes or chromosomal regions associated with milk production. The main objetive of this paper was describe the present status of dairy QTLs mapping.
En 1923 Karl Sax, mediante el empleo de genes mendelianos identificó por primera vez loci cuantitativos ó QTLs en Phaseolus vulgaris. Varias décadas después se iniciaron los primeros estudios sobre marcadores moleculares y su posible asociación con producción lechera en animales domésticos. Estos trabajos se enfocaron hacia el análisis de los grupos sanguíneos y polimorfismos bioquímicos. Los resultados obtenidos fueron contradictorios ya que las asociaciones reportadas por los diferen tes grupos no eran coincidentes. Es por esta razón que fue necesario desarrollar simultáneamente tanto la metodología estadística, como la tecnología de tipificación. En los últimos años el análisis se enfocó a los llamados genes candidatos y/o hacia el rastreo del genorna mediante el uso de microsatélites. Los resultados obtenidos demostraron la utilidad de los mismos en el mapeo de QTLs. Por otra parte, los nuevos diseños experimentales aportaron una mayor precisión en la identificación de estos genes. En la presente revisión se describe el estado actual del mapeo de los QTLs asociados a caracteres de producción lechera.
La mayoría de los caracteres de interés económico en el ganado lechero son cuantitativos. Es decir que el fenotipo observado es el resultado de la interacción entre numerosos loci, que pueden ser denominados QTLs (Quantitative Traits Loci), y la alta influencia de los factores ambientales. En consecuencia, cada uno de estos QTLs sólo pueden explicar una pequeña fracción de la varianza total.
Estas características dificultan la identificación de los animales genéticamente superiores para la producción. Es por esta razón que el análisis de los loci de caracteres cuantitativos puede mejorar la precisión, y por lo tanto la intensidad de la selección.
En general, la mayoría de los genes que rigen los caracteres métricos no son conocidos. Es por ello que los estudios de este tipo de herencia no han podido realizarse mediante el análisis individual de cada uno de los loci involucrados, siendo preciso recurrir a técnicas basadas en principios estadísticos.
Los primeros procesos de selección ejercidos por el hombre durante el siglo XIX se realizaron en base a apreciaciones empíricas. Posteriormente, en el siglo XX, comenzó a desarrollarse la genética cuantitativa con una sólida base matemática y estadística. El período biométrico de la genética animal ha permitido aumentos espectaculares en la productividad de las principales especies domésticas durante la segunda mitad del siglo XX (Georges y Andersson, 1996).
Actualmente, el desarrollo de los marcadores moleculares está permitiendo la identificación de los primeros QTLs. Esto sólo sería el comienzo de una larga lista de QTLs para producción de leche y carne, caracteres reproductivos y de resistencia a enfermedades, con la que seguramente se contará en los próximos años.
Los QTLs que codifican para un carácter pueden ser localizados mediante la utilización de marcadores genéticos. El mapeo de los QTLs mediante marcadores genéticos, se basa en el análisis del ligamiento existente entre ambos. Este es el primer paso necesario para la selección asistida por marcadores (Marker assisted selection, MAS) (Weller y Fernando, 1991; Dentine, 1992; Massey y Georges, 1992).
La identificación de loci cuantitativos de importancia económica
a través del ligamiento a loci marcadores fue enunciada por Karl Sax
en 1923, al estudiar la asociación entre el tamaño y los patrones
de distribución de pigmentación de la semillla de Phaseolus vulgaris.
Sax (1923) enunció que "si ciertos factores de
tamaño pueden encontrarse ligados con factores de caracteres cualitativos,
esto posibilitaría estudiar independientemente a los factores de tamaño
dentro de cada grupo de ligamiento".
El concepto de Sax se vio limitado debido a que en ese entonces sólo
se contaba con unos pocos marcadores, principalmente caracteres cualitativos
moforlógicos. En poblaciones de animales domésticos han sido pocas
las asociaciones halladas entre caracteres cualitativos y cuantitativos que
han podido ser explotadas para la selección de estos últimos.
Un ejemplo es la asociación entre la enfermedad weaver y la producción
lechera en el ganado Pardo Suizo.
Sólo varias décadas después, de iniciados los primeros estudios, el desarrollo de los polimorfismos bioquímicos, serológicos y moleculares está posibilitando el mapeo de QTEs en los cromosomas.
Cabe destacar, que los métodos estadísticos utilizados tuvieron gran influencia sobre los resultados obtenidos. Es por esta razón que fue necesario desarrollar simultáneamente la metodología estadística y la tecnología de tipificación (Falconer, 1981; McLaren et al. 1990).
El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión acerca de los resultados obtenidos en el mapeo de QTLs, como así también sobre los diseños experimentales más comúnmente utilizados en la búsqueda de QTLs.
QTLs EN EL GANADO LECHERO
Numerosos estudios realizados durante las últimas cuatro décadas han puesto de manifiesto correlaciones estadísticamente significativas entre marcadores genéticos y caracteres de producción lechera (Zwiauer, 1980; Soller, 1990a; Beattie, 1994; Haley, 1995; Georges & Andersson, 1996).
Los primeros estudios sobre marcadores moleculares en animales domésticos fueron enfocados principalmente hacia el análisis de los grupos sanguíneos y polimorfismos bioquímicos (Neimann-SÆrensen y Robertson, 1961; Brum et al., 1967; Arave et al., 1971; Mather, 1977; Hargrove et al., 1980). El más importante e influyente de estos estudios fue el llevado a cabo por Neimann-SÆrensen y Robertson (1961) en el ganado lechero danés. De los 10 grupos sanguíneos analizados por estos autores sólo el grupo B evidenció un efecto significativo sobre el porcentaje de grasa en leche, concluyendo que dicho marcador explicaría entre el 1,5 y 3,9% de la varianza total. Resultados similares fueron encontrados, en el ganado sueco, por Andersson-Eklund et al. (1990); mientras que Brum et al. (1967) observaron, en la raza Holstein, asociaciones entre el grupo sanguíneo E con produción de grasa y leche, entre el grupo sanguíneo B con porcentaje de grasa en leche, y asociaciones entre el grupo sanguíneo S con diferencias en la producción de grasa. Geldermann et al. (1985) encontraron asociación entre el grupo sanguíneo C con rendimiento en litros de leche y cantidad de grasa; y entre el grupo sanguineo Z con porcentaje de grasa. Por otra paite, Gonyon et al (1987) observaron también, en la raza Holstein, asociaciones entre al grupo sanguíneo F y porcentaje de grasa.
En cuanto a los polimorfismos bioquímicos, Brum et al. (1967) hallaron en la raza Holstein, asociaciones entre las variantes alélicas de las transferrinas (Tf) con diferencias en el rendimiento de leche y grasa. Gelderman et al. (1985), al estudiar tres familias de medias hermanas de la raza Friesian, observaron asociaciones entre las variantes de postalbúmina (Pa) con rendimiento en litros de leche, y entre amilasa-1 (Am-1) con porcentaje de grasa. Resultados similares fueron reportados para el ganado sueco por Andersson-Eklund y Rendel (1993), quienes estudiaron la asociación entre las variantes del locus Am-1 con el valor reproductivo del contenido de grasa en leche.
A pesar del esfuezo realizado, los estudios de correlación entre los grupos sanguíneos y los polimorfismos bioquímicos con los caracteres de producción lechera no lograron grandes avances, más allá de los resultados mencionados anteriormente. Por otra parte, diferentes autores llegaron a resultados contradictorios. Mientras que algunos reportaban una alta asociación para un locus determinado, otros grupos no hallaban asociación alguna. Estas contradicciones podrían haber sido consecuencia de los diferentes métodos estadísticos y diseños experimentales utilizados en cada caso.
En lo últimos años, el enfoque fue trasladado hacia la búsqueda de loci candidatos y/o hacia el rastreo del genoma mediante el uso simultáneo de un gran número de marcadores moleculares altamente polimórficos, del tipo microsatélite (Haley, 1995). Se ha definido a los loci candidatos como aquellos genes que por su función biológica participarían en la expresión de un carácter cuantitativo y por lo tanto podrían explicar un porcentaje de su varianza fenotípica. Pueden mencionarse a modo de ejemplo las proteínas de la leche, la prolactina (PRL), la hormona de crecimiento (GH), el Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), etc.
I. Loci relacionados con caracteres de producción lechera.
I.a. Proteínas de la leche
Existen evidencias bien documentadas que permiten correlacionar algunas de
las variantes de las proteínas de la leche con el rendimiento y la composición
del producto obtenido (McLean et al., 1984; Cowan
et al., 1990; Ng-Kwai-Hang et al., 1990;
Boland et al, 1992). Sin embargo, diferentes investigadores
han llegado resultados contradictorios. Así por ejemplo, para cierto
locus, algunos autores han reportado una alta correlación entre un alelo
o genotipo particular de la proteína de la leche y los caracteres de
producción lechera; mientras que otros han hallado un pequeño
o ningún grado de asociación. Las diferencias observadas pueden
deberse al método estadístico empleado, al reducido número
de marcadores y animales analizados, y al efecto de la recombinación
(Geldermann, 1985).
Entre las proteínas detectadas en la leche se encuentran las caseínas
(k-caseína,
-b caseína,
aS1-caseína
y aS2-caseína),
-lactoglobulina y -lactoglobulina y a-lactoalbúmina.
kcaseína (CASk): Esta proteína constituye aproximadamente el 13 % de las caseínas totales. Mediante corridas electroforéticas, así como también a nivel de ADN, se han descripto dos variantes alélicas mayoritarias: A y B (Aschaffenburg, 1965; Eigel et al., 1984; Levéziel et al., 1988; Denicourt et al., 1990; Medrano y Aguilar-Cordoba, 1990a; Pinder et al., 1991).
La leche producida por animales de genotipo BB contiene mayores niveles de proteínas, grasa y sólidos totales (Ng-Kwai-Hang et al., 1984; McLean et al., 1984, 1992; Geldermann et al., 1985; Gonyon et al., 1987; Aleandri et al., 1990; Gibson et al, 1990; Hines et al., 1990; Rahali y Menard, 1991; Van Eenennaam y Medrano, 1991; Boland et al., 1992; Bovenhuis et al., 1992; Cowan et al., 1992; Lin et al., 1992; van den Berg et al., 1992; Famula y Medrano, 1994; Velmala et al., 1995). Además este genotipo se ha correlacionado con un mayor rendimiento en litros de leche (Lin et al., 1986). Se calcula que esta variante puede ofrecer un promedio de 2.000 Kg más de leche durante toda la vida productiva del animal (Fuente: Genmark, USA). Estas observaciones fueron confirmadas en diferentes razas como Holstein, Friesian, Jersey, Ayrshire, Guemeys y otras.
Sin embargo, en las diferentes razas, no siempre se presentan las mismas asociaciones marcador - QTL. Si tenemos en cuenta que el ligamiento entre el QTL y el marcador genético es incompleto, podrían existir en la población diferentes haplotipos marcador-QTL. De este modo, el alelo B de CASk podría estar ligado al alelo de alta producción del QTL en algunos animales, mientras que en otros estaría ligado a la variante de baja productividad. Por lo tanto, los efectos estimados del QTL sobre el rasgo cuantitativo se verán sesgados por efecto de la recombinación. Así por ejemplo, Cowan et al. (1992) observaron que el alelo B de CASk estaba asociada a una disminución en el porcentaje de grasa. Mientras que, Haenlein et al., (1987), Sabour et al. (1993), y Ron et al. (1994) no encontraron asociación entre los alelos de CASk y los caracteres de producción lechera.
La leche producida por animales con genotipo CASk BB posee propiedades superiores para la manufacturación de queso (Feagan et al., 1972; Schaar et al., 1984, 1985; Marziali et al, 1986a-b; Aleandri et al., 1990; Rahali y Menard, 1991; Lin et al, 1992; van den Berg et al, 1992). La leche de tipo BB tienen menor tiempo de renina, cuajo más firme, y un mayor contenido en proteínas y sólidos totales (McLean y Schaar, 1989).
La leche derivada de animales CASk AA tiene menor porcentaje de k-caseina (k-CN), y como consecuencia de esto una mayor proporción de núcelas grandes (Morini et al, 1975; Schmidt, 1980; McLean et al, 1982; Ng-Kwai-Hang et al, 1987). Por el contrario, la leche de animales CASk BB presenta mayor proporción de k-caseína y micelas más pequeñas. Esta característica explica la formación de un cuajo más firme y una mayor retención de sólidos, lo que resulta en un rendimiento superior durante la producción de queso, comparada con la leche producida por animales con genotipo CASk AA (Schaar, 1981).
Van Eenennaam y Medrano (1991) demostraron que la leche de los animales con genotipo CASk AB contiene una mayor proporción de k-CN B. Esto sugeriría que dicho alelo tiene un mayor nivel de expresión con respecto a la variante A en la glándula mamaria de los bovinos. La diferencia en la expresión de los alelos, explicaría las observaciones hechas previamente, que evidenciaban que la proporción de k-CN en la leche depende del genotipo del animal (BB > AB > AA) (Mc Lean et al., 1984; Ng-Kwai-Hang et al, 1987).
Las diferencias en el contenido proteico de la leche, entre los animales CASk AA y CASk BB, se estimó en aproximadamente un 3%. Este locus puede explicar alrededor del 4% de la variación total en el contenido proteico (Haley, 1995).
aS1-caseína (CASaS1): Esta proteína constituye el 38 % de las caseínas totales presentes en la leche. Se han identificado en base a la migración electroforética, así como por técnicas moleculares, dos variantes principales denominadas B y C (Aschaffenburg, 1965; Eigel et al, 1984; David y Deutch, 1992). Estudios de comportamiento realizados en animales caracterizados genéticamente para esta proteína, evidenciaron que los individuos CASaS1 BB tenían un rendimiento en litros de leche significativamente mayor que los animales CASaS1 j BC (Ng-Kwai-Hang et al, 1984; Lin et al, 1986). Estas observaciones indicarían la existencia de una fuerte correlación entre el alelo B y una mayor producción lechera. Sin embargo otros autores como Arave et al. (1971), y Gonyon et al. (1987) no hallaron asociaciones significativas entre los genotipos de CASaS1 con producción lechera en vacas de la raza Holstein.
En las razas lecheras más difundidas, como las Holstein-Friesian, el
alelo B se encuentra próximo a la fijación; este hecho podría
haber sido consecuencia de la fuerte presión de selección ejercida
sobre dichas razas durante el último siglo. Por esta razón se
ha hecho difícil llevar a cabo los estudios de asociación entre
los genotipos de CASaS1
y los caracteres de producción lechera.
(b-lactoglobulina
(LGb):
La b-LG
es la principal proteína del suero en la leche de los rumiantes, constituyendo
el 50% de las proteínas presente en el suero. Aunque todavía no
está clara su función fisiológica, se supone que prodría
participar en el transporte y metabolismo del retinol y los ácidos grasos
(Frapin et al., 1993).
Al igual que en el caso de k-caseína, se han descripto dos variantes alélicas mayoritarias: A y B (Aschaffenburg, 1965; Eigel et al, 1984; Medrano y Aguilar-Cordoba, 1990b; Jadot et al., 1992; Wilkins y Kuys, 1992). La expresión diferencial de los alelos A y B de bLG ha sido observada en diferentes poblaciones de ganado bovino lechero (Aschaffenburg y Drewry, 1955; Cerbulis y Farrel, 1975; McLean et al, 1984; Kroeker et al., 1985; Ng-Kwai-Hang et al., 1987; Hill, 1993; Lum et al, 1997).
Numerosos autores han reportado el efecto cuantitativo de las variantes alélicas en la composición de la leche (Bech et al., 1990; Hill, 1993; Ng-Kwai-Hang et al, 1986), así como en la producción de queso (Sherbon et al., 1967; Feagan, 1979; Schaar, 1985; Marziali y Ng-Kwai-Hang, 1986a-b; Aleandri et al., 1990). Por ejemplo, Ng-Kwai-Hang et al. (1984) observaron un efecto significativo de LGb sobre la cantidad de proteínas; Haenlin et al. (1987) hallaron una asociación entre LGb y el porcentaje de grasa en la leche; Cowan et al. (1992), al estudiar dos familias de medias hermanas paternas de raza Holstein, reportaron un efecto de sustitución cromosómica significativos para el alelo A en una de ellas; van der Berg et al. (1992) encontraron que la variante B estaba asociada con una mayor cantidad de caseínas, lo cual causaba un incremento en la conversión de leche en queso. Finalmente, cabe mencionar que no todos los autores han hallado correlaciones estadísticamente significativas entre los genotipos de LGb y los caracteres de producción lechera (Brum et al., 1967; Mc Lean et al, 1984; Lin et al, 1986).
Podría resumirse que la variante A está asociada con un mayor nivel de b-LG y proteínas totales del suero de la leche, y con un menor contenido de caseínas y grasa (Boland et al., 1992). Por otra parte, los animales con genotipo b-LG BB tienen un menor contenido de b-LG y un mayor contenido de caseínas, proteínas totales y grasa en la leche, lo que resulta en mejores propiedades para la producción de queso (Tong et al., 1993). Además, este genotipo ha sido correlacionado con un mayor rendimiento en litros de leche con respecto al genotipo AA, habiéndose observado para el genotipo AB un rendimiento intermedio (Jadot et al, 1992).
El estudio de la región promotora de este loci evidenció la presencia de 13 sustituciones nucleotídicas entre ambas variantes alélicas. Estas sustituciones que ocurren en los sitios específicos de unión de los factores de transcripción, serían las causantes de las diferencias observadas en la expresión de las variantes alélicas de LGb. En los animales heterocigotos aproximadamente el 60% de la b-LG corresponde a la variante A, mientras que el 40% restante está contituída por la variante B (Graml et al, 1989; Wilkins et al, 1995; Lum et al, 1997). Se han reportado polimorfismos en la región promotora de la LGb en cinco razas bovinas (Wagner et al, 1994; Wilkins et al, 1995). Dentro de la región promotora han sido reportados diez sitios polimórficos, lo que fueron asociados a las variantes alélicas (Lum et al., 1997).
Las distintas regiones promotoras evidenciaron diferente grado de afinidad al factor de transcripción AP-2, lo que podría llevar a formar un complejo de transcripción más o menos eficiente, que causaría diferencias cuantitativas en la expresión de bLG (Lum et al, 1997). Por lo tanto, el factor de transcripción AP-2 podría actuar como un modulador de la expresión de la LGb.
a-lactoalbúmina (a-AL): La a-lactoalbúmina (a-LA) contituye el 20% de las proteínas presentes en el suero de la leche. Hasta el momento han sido detectadas tres variantes: A, B y C (Aschaffenburg, 1965; Eigel et al., 1984). Bleck y Bremel (1993) correlacionaron, en la raza Holstein, la variante A con una mayor cantidad de leche, proteínas y grasa. La vanante B fue asociada con mayores porcentajes de proteína y grasa, observándose valores intermedios en los animales heterocigotas.
Asociaciones entre los haplotipos de las proteínas de la leche y caracteres de producción: Muchos de los estudios realizados incluyeron, no sólo el análisis del efecto individual de las proteínas de la leche sobre la producción, sino también su efecto en forma conjunta. Así por ejemplo, Geldermann et al. (1985) observaron, en una familia de medias hermanas paternas de la raza Friesian, que los haplotipos CASaS1-CASb evidenciaban un efecto de sustitución significativo sobre la producción lechera. Haenlein et al. (1987) reportaron que la interacción entre los genotipos de CASaS1 y LGb era significativa para el porcentaje de grasa y sólidos no grasos. Ron et al. (1994) observaron que la interacción entre los genotipos de LGb y CASk tenía un efecto significativo sobre el porcentaje de grasa. Velmala et al. (1995) reportaron diferencias significativas entre los haplotipos de las caseínas con rendimiento lechero y cantidad de grasa en la leche, en vacas de la raza Finnish Ayrshire. Lin et al. (1986), estimaron que el efecto de la interacción entre las proteínas de la leche era de 8,9% sobre la vaiianza fenotípica en la producción lechera, 8,6% y 5% en la cantidad de proteínas y grasa respectivamente.
I. b. Hormonas y enzimas
Prolactina (PRL): La prolactina es una hormona de base proteica sintetizada por la región anterior de la hipófisis, siendo su función principal la de estimular la lactancia.
Los primeros estudios tendientes a determinar los polimorfismos de ADN para esta hormona se realizaron mediante la técnica de Southern Blot (Theilmann et al., 1989 ; Cowan et al., 1989). Lewin et al (1992) utilizaron la técnica de PCR-RFLP para evidenciar el sitio de restricción polimórfico Rsal localizado en el exón 3 de PRL.
A pesar de la importancia fisiológica de esta hormona para la lactancia, son escasos los trabajos sobre asociación entre PRL y producción lechera. Cowan et al. (1990) establecieron, mediante la técnica de Southern Blot, la correlación entre las variantes de PRL y caracteres de produción lechera en una familia élite de la raza Holstein. Es por esta razón, que hoy en día podría considerarse como un QTL.
Hormona de Crecimiento (GH): La hormona de crecimiento es un péptido secretado por la adenohipófisis cuya función más importante es la de favorecer la síntesis proteica, estimulando de esta manera el crecimiento. Así mismo, es importante el estímulo de la GH tanto en el desarrollo de la glándula mamaria, como en la lactancia. Por lo tanto, el análisis de los polimorfismos presentes en la GH y sus asociaciones con los caracteres de producción lechera es de fundamental importancia.
Hoj et al. (1993) definieron las variantes alélicas de GH en base a la presencia/ausencia de una inserción de aproximadamente 0,9 kb en la región 3´ (polimorfismo I/D) y al sitio de restricción polimórfico MspI ubicado en el exón 3 de este gen. Estos autores agruparon bovinos pertenecientes a las razas Red Danish y Norwegian Red en dos grupos, según fuera alta o baja la producción de grasa en leche. A partir de la tipificación de estos animales se evidenciaron diferencias significativas en las frecuencias del haplotipo D/MspI(-) entre ambos grupos. Este resultado estaría indicando que la selección sobre el carácter grasa en leche habría incrementado las frecuencias de los alelos D y MspI(-).
Lee et al. (1996), estudiaron el sitio de restricción polimórfico AluI (exón 5) mediante la técnica de PCR-RFLP. Dicha metodología se utilizó para analizar dos rebaños de la raza Holstein, uno seleccionado y otro control. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias entre las frecuencias génicas de ambos grupos. Por otra parte, la asociación entre los diferentes genotipos de AluI y producción lechera, evidenció que el genotipo AluI-/- estaba asociado con una disminución en el valor de cría para la producción lechera en el rebaño seleccionado, mientras que no se encontró correlación en el grupo control.
Yao et al. (1996a) detectaron en toros Holstein, a través de la técnica de SSCP, dos polimorfismos en el gen GH dados por una transición T®C en el tercer intrón (GH4.1) y una transversión A®C en el tercer exón (GH6.2). Estas variantes se asociaron con caracteres de producción, ya que los toros GH4.1c/GH4.1c evidenciaron una mayor producción de leche, grasa y proteínas, con respecto a los toros con genotipos GH4.1c/ GH4.lt y GH4.1t/ GH4.1t. Efectos similares sobre los caracteres de producción lechera se observaron para el polimorfismo GH6.2, siendo el alelo GH6.2a el más favorable.
Ornitina Descarboxilasa (ODC): La ornitina descarboxilasa es una enzima que participa en la ruta metabólica de las poliaminas, siendo por lo tanto escencial para la síntesis de las proteínas, replicación del ADN y para la diferenciación celular. Yao et al. (1996b), estudiaron el sitio de restricción polimórfico MspI (exón 9) mediante la técnica de PCR-RFLP. Dicha metodología se utilizó para analizar dos grupos de machos de la raza Holstein, uno de los cuales correspondía a los reproductores utilizados durante las décadas del 50 y 60, mientras que el otro grupo estaba constituido por los machos utilizados durante los años 80. Los resultados obtenidos mostraron diferencias significativas entre las frecuencias génicas de los grupos analizados. Aunque el efecto de la deriva génica no puede ser descartado, las diferencias observadas podrían deberse al efecto de la selección sobre la producción lechera.
I.c. Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC).
En bovinos el Complejo Principal de Histocompatibilidad (denominado Bovine Lymphocyte
Antigen, BoLA), corresponde a un grupo de loci ubicados en el cromosoma 23 (BTA23).
El BoLA ocupa un rol central en la respuesta inmune. Este complejo es de gran
importancia para la adaptación del individuo al medio (fitness),
por lo que influye directa o indirectamente sobre los caracteres de producción.
Numerosos estudios han demostrado la asociación entre el BoLA y caracteres
de importancia fisiológica como fertilidad (Ostergard et
al., 1989; Mejdell et al., 1993, 1994),
susceptibilidad o resistencia a enfermedades (Lewin y Bernoco,
1986; Bernoco y Lewin, 1989; Lewin, 1989;
Lundén et al., 1990; Schook et al.,
1991; Zanotti et al., 1995; 1996),
caracteres de producción, parámetros de crecimiento (Batra
et al., 1989; Beever et al., 1990; Stear
et al, 1988; Weigel et al., 1990), etc. Estos estudios
revelaron la importancia del análisis de estos marcadores, tanto para
el estudio de la resistencia a enfermedades, como para los caracteres de produción
(Lewin et al, 1991).
Entre los genes más estudiados se pueden mencionar el locus de Clase II BoLA-DRB3. Se ha podido comprobar la correlación entre la presencia de algunas de las variantes alélicas encontradas para este locus, con resistencia o susceptibilidad a enfermedades como la leucosis bovina, mastitis, parásitos intestinales, etc. (Lundén et al., 1990). Además se han encontrado correlaciones entre loci de clase I, como el BoLA-A y resistencia o susceptibilidad a mastitis (Oddgeirsson et al., 1988; Simpson et al. 1990; Vage et al., 1992; Simon et al., 1993; Mejdell et al, 1994a-b; Aarestrup et al, 1995; Mallard et al., 1995; Simon et al., 1995).
Estas asociaciones resultan de interés, ya que numerosas evidencias han demostrado que los animales portadores de estas enfermedades presentan una importante disminución en la producción (Yang et al., 1993). Sin embargo, no todos los autores han encontrado correlaciones entre loci de Clase I y II del BoLA, con fertilidad y caracteres de producción (Lundén et al., 1993; Arriëns et al., 1996).
I.d. ADN mitocondrial (mtADN)
Estudios recientes han demostrado que entre el 2 y el 10% de la variación en la producción de leche y grasa en las vacas lecheras puede explicarse a través del efecto materno (Bell et al., 1985; Freeman, 1990; Huizinga et al., 1986; Ron et al., 1990). La influencia materna podría deberse al efecto de los genes nucleares de origen materno, al ambiente intrauterino o a genes mitocondriales.
Brown et al. (1989) analizaron mediante enzimas de restricción un fragmento de 4,3 kb del mtADN en 35 linajes matemos de la raza Holstein. La presencia del sitio de restricción Hpa II en la posición 360 del fragmento estudiado, se asoció con un bajo porcentaje de grasa en leche. Por otra parte, los marcadores moleculares utilizados en este estudio evidenciaron que los pedigrees no son suficientes para separar los verdaderos linajes citoplasmáticos en análisis genéticos cuantitativos. Ron et al. (1992), estudiaron los polimorfismos de 31 enzimas de restricción presentes en el mtDNA de 67 lineas maternas, estratificadas en cuatro grupos según su producción lechera. La distribución de los alelos raros indicaría una posible relación entre estos polimorfismos y la producción lechera. Por el contrario, Ron et al. (1993) analizaron linajes matemos de alta y baja producción lechera en la raza Holstein, a través del estudio de los polimorfismos presentes en la región del D-loop del mtDNA. Ninguno de los sitios polimórficos evidenció efectos significativos sobre la producción lechera.
I.d. Microsatélites
En el genoma eucariota, las secuencias codificantes sólo constituyen un pequeño porcentaje del mismo. El resto del ADN está formado por secuencias repetidas. Los microsatélites (Short Tandem Repeat, STR) son una de las clases de secuencias repetidas presentes en el genoma, y están constituidos por repeticiones de di, tri y tetranucleótidos, dispersos en todo el genoma (Ellegren, 1993). Hasta el momento, en las diferentes razas de bovinos, han sido reportados más de 1231 microsatélites polimórficos (Fries, 1993; Barense et al., 1994; Bishop et al., 1994; Georges et al., 1995; Ma et al., 1996; Kappes et al, 1997). Esto ha permitido aumentar la resolución del mapa genético bovino a un intervalo promedio de 2,5 cM. Esta distancia es sensiblemente inferior al valor sugerido por Ott y Donis-Keller (1994) para estudios de asociación marcador-QTL. Según estos autores 10 cM sería el intervalo máximo entre dos marcadores. Es por esta razón, que los STRs han podido ser utilizados con gran éxito en el mapeo de loci de caracteres tanto cualitativos como cuantitativos.
La utilización de los STRs para el mapeo de QTLs ha permitido localizar regiones cromosómicas, que podrían ser portadoras de genes implicados en la producción lechera. Así por ejemplo, Georges et al. (1993) mapearon en la raza Parda Suiza un microsatélite (TGLA116) estrechamente ligado al gen de la enfermedad del temblor (weaver disease). Como se mencionó anteriormente, dicha patología se asocia con el aumento de la producción lechera. Por ende, el análisis del STR., no sólo permite la identificación de los animales portadores de dicha enfermedad, sino que también posibilitará estudiar el efecto de la región cromosómica correspondiente, sobre la producción lechera en esta raza y en otras razas lecheras.
Además el empleo de esta metodología ha permitido la localización de otras regiones potencialmente portadoras de QTLs relacionados con producción lechera. De este modo, Ron et al. (1994), utilizaron 10 microsatélites para investigar QTLs asociados a caracteres de producción lechera, en siete familias de Holstein Israelita. En este estudio se identificó un efecto significativo del marcador genético D21S4 sobre litros de leche y cantidad de proteínas en una de las familias analizadas. Georges et al. (1995), al estudiar 14 familias de medias hermanas paternas de la raza Holstein, a través del uso de 159 microsatélites, detectaron QTLs para producción lechera en cinco cromosomas (BTA1, 6, 9, 10, 20). La presencia de un QTL para la producción lechera en el cromosoma BTA6 fue confirmado independientemente por Spelman et al. (1996) mediante la metodología de Idénticos por Descendencia (IBD). Recientemente, Ashwell et al. (1996), utilizaron 16 microsatélites para identificar potenciales QTLs en 7 familias de Holstein. Todos los marcadores, excepto 3 de ellos, fueron asociados con efectos significativos para al menos un carácter de producción lechera en una de las familias estudiadas (BTA8, 14,18, 21, 23, 26 y 27). Vilkki et al. (1997), estudiaron 453 toros de la raza Finnish Ayrshires, los que fueron tipificados para seis microsatélites ubicados en el cromosoma 9. Los resultados obtenidos indicarían la posible existencia de un locus, en el BTA9, que afectaría la producción de proteínas y leche.
I. Diseño de Medias Hermanas Paternas (Dauther Designs, Paternal half sibs)
Esta metodología se basa en el estudio de la descendencia de machos heterocigotas para un locus determinado. Teniendo en cuenta el alelo que reciben del padre, las hijas pueden ser clasificadas en dos grupos de medias hermanas paternas (Geldermann, 1975,1976; Geldermann et al. 1985). Debido a que los alelos correspondientes a un locus marcan las regiones cromosómicas homologas a las que se encuentran ligados, pueden ser usados en este sentido como marcadores genéticos. Si el marcador se encuentra estrechamente ligado a un QTL, las crías al recibir un alelo determinado del padre heredan simultáneamente una de las dos posibles regiones cromosómicas homologas que incluyen el QTL. De esta manera, los dos grupos de medias hermanas paternas deberían diferenciarse para el carácter cuantitativo. Por lo dicho anteriormente, sólo serán informativos aquellos machos que sean heterocigotos para ambos loci.
Si el ligamiento entre el marcador y el QTL no es completo, los dos grupos de medias hermanas no serán homogéneos para el QTL, debido a que por efecto de la recombinación un porcentaje de las hijas recibirán la región cromosómica recombinada. Este efecto reduce la diferencia entre ambos grupos para el carácter estudiado.
Para contrarrestar la influencia de la recombinación, Thoday (1961) propuso la utilización simultánea de dos marcadores genéticos para determinar la localización del QTL (Marker Brackets). La ventaja de este método fue señalada por Lander y Botstein (1989), quienes sostuvieron que a través de esta metodología los tipos recombinantes pueden ser identificados y eliminados del análisis. De esta manera, la diferencia observada entre los dos grupos se debe únicamente al efecto de los tipos parentales, brindando así una estimación del efecto principal del QTL independiente de la recombinación. La utilización de Marker Brackets incrementa el poder de resolución, en comparación a los análisis basados sólo en un marcador.
II. Diseño de Nietas (Granddaugther Designs)
El método denominado "Diseño de Nietas" se basa en la caracterización de los hijos de machos de elite que son heterocigotos para un determinado marcador. Las crías se dividen en dos grupos de acuerdo al alelo que hayan recibido del macho de élite. Posteriormente, las crías son evaluadas para el carácter cuantitativo a través del test de progenie, comparando los valores medios obtenidos para cada grupo (Weller et al, 1990). Puede utilizarse como alternativa, el valor de cría en lugar del test de progenie.
Este método permite reducir el número de animales tipificados para cada marcador, a expensas del aumento en el número de crías evaluadas para el carácter cuantitativo.Por otra parte, sólo se requiere la recolección de muestras de semen en los centros de inseminación, evitando de esta manera el muestreo de animales diseminados en numerosas lecherías. Otra ventaja de este método es que al trabajar con test de progenie en lugar de datos individuales de producción, se reduce el error de la varianza del carácter cuantitativo evaluado.
En este diseño, la diferencia esperada entre las medias de producción de ambos grupos, estimada a través de los test de progenie de los hijos del macho de elite, sería la mitad de la diferencia esperada entre los datos individuales de dos grupos de crías. Esto disminuye el poder de resolución del diseño de nietas en comparación con el de medias hermanas. Sin embargo, esta desventaja es compensada ampliamente, dado que la varianza entre los test de progenie es menor que la varianza entre los valores individuales de producción utilizados en el diseño de medias hermanas.
III. Mapeo de QTLs en Cruzamientos de Poblaciones Segregantes.
La gran mayoría de los trabajos realizados para mapear marcadores-QTL en bovinos, así como en otras especies domésticas, han sido realizados dentro de poblaciones de una misma raza. Sin embargo, cuando poblaciones pertenecientes a diferentes razas difieren radicalmente para cierto carácter, y por lo tanto para los QTLs que lo afectan, la cruza entre ambos grupos puede resultar de gran utilidad en el mapeo de dichos QTLs. Beckmann y Soller (1988) demostraron que es posible estudiar el ligamiento marcador-QTL siguiendo la cosegregación del marcador y del carácter dentro de cada familia. Para marcadores multialélicos, esta clase de análisis tiene el mismo poder de resolución que la cruza entre líneas puras, mientras que para loci bialélicos es de aproximadamente un cuarto. A modo de ejemplo pueden citarse el cruzamiento de N´Dama y Zebu para mapear QTLs asociados con resistencia/susceptibilidad a la tripanosomiasis, y la cruza de cerdo salvaje (Susscrofa scrofa) con cerdo doméstico europeo (Susscrofa domesticus) para mapear QTLs asociados a crecimiento y producción de grasa (Soller y Beckmann, 1987; Andersson et al., 1994).
IV. Tipificación Selectiva (Selective Genotyping)
El método de tipificación selectiva se basa en la elección de aquellos animales que se encuentran en los extremos de la distribución para el carácter de interés, y su posterior tipificación para los marcadores genéticos. Esta metodología se fundamenta en el hecho que la selección sobre un carácter cuantitativo podría cambiar las frecuencias génicas en la población segregante. Una diferencia significativa entre las frecuencias génicas de las colas de la distribución (alta y baja producción) en la F2 o en la población base puede servir como test para el ligamiento marcador-QTL (Stuber et al., Soller, 1990b).
Las ventaja de este método consiste en que permite reducir el número de animales tipificados a expensas de un aumento en el número de animales registrados para el carácter en estudio. Cuando la proporción seleccionada en las colas es pequeña (10% o menos), se puede obtener una reducción importante en el número de animales tipificados, a expensas de un aumento en la cantidad de crías evaluadas para el carácter en estudio (Lebowitz et al., 1987).
Este método es fácilmente aplicable para el estudio del ligamiento marcador-QTL en rebaños de producción lechera, dado que en estos casos se dispone de un gran número de datos. Puede aplicarse seleccionando uno o dos de los caracteres más importantes, por ejemplo, producción de leche y contenido proteico. Sin embargo, la principal desventaja de la tipificación selectiva es que no puede ser aplicada simultáneamente a más de dos caracteres independientes, porque a pesar de la pequeña proporción de animales seleccionados para cada carácter, se tendría que tipificar prácticamente a todas las crías.
Lander y Botstein (1989) han aplicado su método "interval mapping" para seleccionar las colas poblacionales, obteniendo un aumento en el poder de resolución, sobre el obtenido al considerar las frecuencias génicas de los marcadores en las colas seleccionadas. El aumento obtenido por Lander y Botstein resulta de considerar el valor cuantitativo del genotipo del marcador en la cola seleccionada y puede ser obtenido por ANOVA sin la necesidad de aplicar el método de máxima verosimilitud "rnaximun likelihood" (Soller, 1990b).
V. El efecto fundador y la reducción del tamaño poblacional efectivo permiten el mapeo por el método "Idéntico por Descendencia (IBD Identical-by-Descent)" dentro de una raza.
Los registros históricos ponen en evidencia que las razas domésticas se han originado a partir de un número reducido de individuos fundadores. Por otra parte, el uso extensivo de las modernas técnicas de reprodución asistida, como la inseminación artificial, también han contribuido a la reducción del tamaño efectivo de las poblaciones.
Teniendo en cuenta la historia y la estructura poblacional de las razas domésticas, es razonable predecir que la mayoría de los individuos afectados por una determinada enfermedad genética compartirían la misma mutación (que debería ser idéntica por ascendencia en todos los casos), y los mismos segmentos que flanquean a dicha mutación (que también tendrían que ser idénticos por ascendencia). Situaciones similares pueden darse en poblaciones humanas aisladas, las que han demostrado ser de gran utilidad para el mapeo del gen causante de una determinada patología.
La importancia de esta estrategia radica en que permite mapear tanto en animales domésticos, como en el hombre los genes causantes de enfermedades genéticas, utilizando un número limitado de descendientes afectados que comparten un antecesor común. De esta manera, detectando el segmento cromosómico que comparten los individuos afectados, no es necesario realizar los clásicos pedigrís utilizados en los análisis de ligamientos, reduciendo el tiempo y costo que requieren aquellos cruzamientos.
Un ejemplo de la utilidad de esta metodología para el mapeo de enfermedades genéticas es la investigación realizada por Charlier et al. (1996). Con el fin de localizar el gen causante del pie de mula en la raza bovina Holstein Friesian examinaron el pedigrí de 12 individuos afectados. Utilizando 213 microsatélites, los autores observaron que todos los individios analizados compartían un mismo segmento del cromosoma 15, el cual provenía de un ancestro común.
Cabe resaltar que esta metodología no sólo es de utilidad en la detección de caracteres cualitativos, sino que también ha sido utilizada satifactoriamente en el mapeo fino de QTLs. Así por ejemplo, Spelman et al., (1996) han confirmado la presencia de QTLs para la producción lechera en el cromosoma ó, los cuales habían sido detectados previamente a través de otras técnicas por Georges et al. (1995).
Desde el experimento de Sax en 1923, hasta la actualidad, es mucho lo que se ha avanzado en el mapeo de los genomas de especies domésticas. A partir de los primeros trabajos realizados en bovinos durante la década del sesenta, en los cuales se analizaban unos pocos marcadores genéticos (grupos sanguíneos y polimorfismos bioquímicos) para el mapeo de caracteres cuantitativos, se ha llegado en la actualidad, a contar con un mapa genético cuya distancia promedio entre marcadores es de 2,5 cM. Esto ha sido posible gracias al desarrollo de la tecnología del ADN.
La densidad actual de marcadores representa una considerable mejora en el poder de resolución del mapa, aumentando de esta manera la probabildad de detectar QTLs y su subsecuente aplicación en programas de MAS.
Caracterizar la variabilidad presente en las poblaciones de ganado lechero e identificar los QTLs para dichos caracteres, permitirá utilizar los marcadores genéticos como complemento de los métodos tradicionales de mejoramiento. La selección asistida por marcadores genéticos podría ser aplicada tanto en poblaciones exocriadas, como para realizar la introgresión asistida de genes de interés poblaciones comerciales de élite.
La MAS ofrece una serie de ventajas, entre las que pueden mencionarse la determinación del genotipo directamente sobre el ADN, sin que dicha información se vea afectada por la influencia del ambiente, esto permite mejorar la exactitud de la evaluación genética.
Por otra parte, muchos fenotipos se expresan sólo en un sexo y en un momento deter.minado del desarrollo. La diagnosis basada en el DNA puede realizarse independientemente del sexo y del estadio del desarrollo. Esta característica permite obtener la información antes que se exprese el fenotipo, o que los reproductores tengan descendencia. Dado que no es necesario esperar los datos de comportamiento para la elección de los reproductores, esta metodología permite disminuir el intervalo generacional y reducir el costo de cría., haciendo mejor uso de la variación genética no aditiva. Finalmente, cabe mencionar que los marcadores genéticos son de gran utilidad para el estudio y selección de caracteres no convencionales como resistencia/susceptibilidad a enfermedades. Por las características mencionadas anteriormente, la implementación de la MAS redundará en un aumento de la respuesta a la selección, y de esta manera incrementará la intensidad de la misma.
A pesar de los grandes avances obtenidos hasta el momento, aún restan solucionar una serie de inconvenientes para implementar, en forma extensiva, la MAS en el mejoramiento animal. La mayoría de los trabajos realizados hasta el momento, se basan en el mapeo de los QTLs a través del análisis del ligamiento entre éstos y los marcadores, y no sobre el gen cuantitativo en si mismo. Por lo tanto, los resultados obtenidos se ven afectados por el efecto de la recombinación, disminuyendo de esta manera la efectividad de la predicción.
Para minimizar el efecto de la recombinación sería necesario incrementar la densidad de marcadores en las regiones específicas del genoma donde ya han sido localizados QTLs, fundamentalmente en aquellas zonas que flanquean al gen cuantitativo.
En bovinos, los mapas actuales, están basados fundamentalmente en STR, siendo reducido el número de genes estructurales mapeados hasta el momento. Sería necesario obtener un mapa genético basado en este tipo de genes. Hoy en día, se dispone de un gran número de estrategias que están permitiendo la localización de los genes estructurales. Tanto los estudios sobre la expresión de los genes que participan en los caracteres de producción lechera, así como su clonado y secuenciación, permitirán comprender el efecto de las diferentes mutaciones sobre los caracteres cuantitativos, y de esta manera desarrollar marcadores basados en dicha variabilidad. De esta manera, la identificación y mapeo de los genes que afectan a los caracteres de inportancia económica transformaría, en un futuro cercano, la cría y mejoramiento de bovinos lecheros
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