Marcela Yáñez V.*, Laura Böhm S.* y Susana González M.*
Universidad Austral de Chile*
Facultad de Ciencias Agrarias
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
Casilla 567, Valdivia, Chile

ABSTRACT

Evaluation of four populations of Heterodera trifolii Goffart in forage legumes.

Four Heterodera trifolii populations isolated from white clover of pastures from different places of the south of Chile were inoculaled in one month oldplants of the following species: Trifolium repens L. cv Huia and cv Kopu, Trifolium pratense L. cv Quiñequeli, Trifolium subterraneum L. cv Clare and cv Mount Baker, Medicago sativa L. cv Pionner 555 and cv WL 320 Lotus uliginosus Schkuhr, Lotus corniculatus L. and Trifolium incarnatum L. Atfer four months of the inoculation, the plants were evaluated for dry shoot weight, dry root weight, number of cyst formed per pots and eggs and juvenils contained in cysts. In overall, the results of this research showed no significant effects of the nematode in the vegetative and root development of the plants and no significant differences were presented between the different populations of H. trifolii for trie parameters evaluated. The total number of cysts, eggs and juvenile did not show significant differences between the different populations inoculated on the same species and cultivar. However when the data were analysed for the same nematode population on the different species and cultivars, significant differences were recorded being the best hosts for H. trifolii, T. repens cv Huia and cv Kopu followed by T. subterraneum cv Clare.

RESUMEN

Cuatro poblaciones de Heterodera trifolii procedentes de raíces de trébol blanco obtenidas en praderas de diferentes localidades de la zona sur de Chile, se inocularon , por separado, en plantas de un mes de edad de trébol blanco (Trifolium repens L.) cultivares Huia y Kopu, trébol rosado (Trifolium pratense L.) cultivar Quiñequeli, trébol subterráneo (Trifolium subterraneum L.) cultivares Clare y Mount Barker, alfalfa (Medicago sativa L.) cultivares Pionner 555 y WL 320, alfalfa chilota (Lotus uliginosus Schkuhr), lotera (Lotus corniculatus L.) y trébol encarnado (Trifolium incarnatum L.). Las evaluaciones realizadas transcurridos cuatro meses desde la inoculación de las plantas no muestran un efecto significativo de nemátodo en el desarrollo aéreo y radical de estas, no detectándose tampoco diferencias claras entre las poblaciones de H. trifolii en estos parámetros. En cuanto al número total de quistes así como huevos y juveniles desarrollados en estos, no se obtuvieron diferencias significativas entre las distintas poblaciones inoculadas sobre una misma especies y cultivar vegetal; sin embargo, al analizar estadísticamente estos parámetros, para una misma población del nemátodo, sobre el conjunto de especies vegetales se presentaron diferencias significativas entre ellas, comportándose el trébol blanco cultivares Huia y Kopu como los mejores hospederos para el nemátodo seguido del trébol subterráneo cultivar Clare.

INTRODUCCION

El nemátodo quiste del trébol, Heterodera trifolii, se encuentra ampliamente distribuido en las praderas de la zona sur de Chile, con niveles de infestación muchas veces superiores a los que señala la literatura como causantes de problemas en el establecimiento y producción de las plantas de trébol (Guiñez, 1982; Böhm y González 1996).

El trébol blanco (Trifolium repens L.) y específicamente el cultivar "Huia" es considerado el principal hospedante de este nemátodo a nivel mundial (Norton, 1967; Webster, 1972), mientras que su capacidad de infectar y multiplicarse en otras leguminosas forrajeras como trébol rosado (T. pratense L.) y alfalfa (Medicago sativa L.) es frecuentemente discutida (Singh y Norton, 1970; Townshend y Potter, 1976; Daguer, 1996). Esto último, sumado al hecho que muchas veces la respuesta del trébol blanco ante la infestación de H. trifolii en el suelo es errática (Dijkstra, 1971), se atribuye al origen de las poblaciones del nemátodo utilizadas en los ensayos (Plowright, 1985), situación que ha llevado a plantear la posible existencia de razas o patotipos en esta especie (Daguer, 1996) las que presentarían variaciones en su rango de hospedantes.

Eos objetivos de la presente investigación fueron evaluar como posibles hospedantes para cuatro poblaciones de H. trifolii a siete especies y algunos cultivares de leguminosas forrajeras asociadas a praderas de la zona sur de Chile y determinar el efecto de la infestación del nemátodo en el desarrollo aéreo y radical de las plantas.

MATERIALES Y METODOS

En el presente ensayo, que se desarrolló bajo invernadero, se utilizó semilla de trébol blanco (T. repens L.) cultivares Huia y Kopu, trébol rosado (T. pratense L.) cultivar Quiñequeli, trébol subterráneo (T. subterraneum L.) cultivares Clare y Mount Barker, alfalfa (M. sativa L. ) cultivares WL 320 y Pionner 555, trébol encarnado (T. incarnatum L.), alfalfa cbilota (Lotus uliginosus Scbkubr) y lotera (Lotus corniculatus L.), estas tres últimas especies semilla corriente.

Las semillas fueron desinfectadas con bipoclorito de sodio al 5%, para posteriormente ser sembradas en macetas plásticas de 500 ce de capacidad que contenían suelo y arena (1:1) esterilizado en autoclave. Este sustrato se complementó con una fertilización equivalente a 200 unidades de P₂O₅/ha, 100 unidades de K₂O/ha, 1.000 unidades de CaO/ba y 90 unidades de N/ ha.

Cuando las plantas tenían un mes de desarrollo, se procedió a ralear dejando tres plantas de tamaño uniforme por maceta, inoculándolas de inmediato con una suspensión de 5.000 huevos y juveniles de H. trifolii.

Los tratamientos ensayados fueron 50, correspondiendo estos a las diez especies y/o cultivares vegetales, inoculadas( en base a cinco macetas o repeticiones) con cuatro poblaciones de H. trifolii, además de los respectivos tratamientos testigos sin inocular. La temperatura ambiente del invernadero durante todo el ensayo fue de 20,6 ± 2,1 ºC y se aplicó riego, con agua hervida y fría según las necesidades de las plantas.

Las cuatro poblaciones del nemátodo se originaron a partir de quistes, obtenidos directamente de plantas de trébol blanco, colectadas en igual número de praderas ubicadas en distintas localidades de la zona sur de Chile (Cuadro 1). Cada población se multiplicó, por aproximadamente un año y a través de sucesivos repicajes sobre plantas de trébol blanco "Huia".

El inóculo de cada población del nemátodo se obtuvo lavando las raíces de las plantas de trébol blanco sobre un set de tamices de 30,60 y 120 mallas/pulgada. Los quistes, retenidos en los dos últimos tamices, se maceraron presionándolos con una base de goma y lavando en forma paralela con agua a presión, recibiendo el residuo sobre un tamiz de 270 mallas/pulgada dispuesto sobre otro de 500 mallas/ pulgada, receptor final de huevos y juveniles. Estos se recuperaron con agua en un vaso de precipitado, contabilizándose bajo microscopio el número de huevos y juveniles presentes en la suspensión.

Transcurridos cuatro meses desde la inoculación se midió el peso seco aéreo y radical de las plantas así como el desarrollo del nemátodo; para este último se contabilizaron tanto los quistes adheridos a las raíces, como aquellos presentes en el suelo, los cuales se extrajeron por medio del sistema Fenwick modificado (Krausz, 1995); además se evaluó el contenido de huevos y juveniles en los quistes.

Todos los parámetros indicados fueron sometidos a análisis de varianza y posteriores test de significancia de Tukey (en el caso de poseer los tratamientos varianzas iguales) o por pruebas para datos no paramétricos de Kruskal Wallis (para el caso en que las varianzas de los distintos tratamientos analizados no fueran iguales) (Yáñez, 1998).

RESULTADOS Y DISCUSION

Peso seco radical.- Como se indica en el Cuadro 2, las distintas especies y cultivares vegetales inoculados con H trifolii no vieron alterado su peso seco radical en forma significativa en relación a sus respectivos testigos. Tampoco se observó un efecto claro entre las distintas poblaciones del nemátodo en este parámetro, con excepción a lo ocurrido en trébol rosado "Quiñequeli", donde el peso seco radical de las plantas inoculadas con la población IV fue significativamente mayor al testigo.

Estos resultados discrepan a lo señalado normalmente en la literatura, que presenta al nemátodo quiste del trébol como el principal responsable de la disminución del rendimiento en trébol blanco y ocasionalmente otras especies leguminosas (Chapman, 1964; Yeates et al, 1973), efecto que se atribuye básicamente al daño en el sector radical de las plantas (Jones, 1974).

Los resultados obtenidos en el presente ensayo, pueden atribuirse, entre otras causas, a las condiciones de suelo, humedad y temperatura en que se desarrollaron las plantas, las cuales no permitieron que se exprese el daño del nemátodo en las raíces, similar a lo observado por Krausz (1995). Por otro lado Fraga (1988) y Böhm et al. (1997), reportan para trébol blanco, que este nemátodo provoca un incremento en el peso seco radical de las plantas de trébol blanco inoculadas con poblaciones similares a las utilizadas en el ensayo aquí presentado, situación que Krausz (1995) determino era causada por un aumento significativo en el número de raicillas laterales desarrolladas en las plantas infectadas. Además Yeates (1987) indica que al fertilizar plantas de trébol, el nemátodo quiste no afecta significativamente el desarrollo de ellas, en un período de tiempo breve, porque se estimula el crecimiento radical.

Cuadro 2.     Efecto de H. trifolii en el peso seco radical (g por maceta) de leguminosas
                     forrajeras.
                     Effect of H. trifolii on the dry root weight (g) of fbrage legumes.


Especie	Cultivar	Pob. I	Pob. II	Pob. III	Pob. IV	Testigo

T. repens T. pratense T. Subterraneum M. sativa L. uliginosus L. corniculatus T. incarnatum	Huia Kopu Quiñequeli Clare M. Barker WL 320 Pionner 555	1,66 a 1,60 a 2,19 ab 0,54 a 0,98 a 1,29 a 1,09 a 0,98 a 1,63 a 0,81 a	1,58 a 1,81 a 2,30 ab 0,71 a 0,73 a 1,41 a 1,15 a 1,22 a 1,05 a 0,68 a	1,47 a 1,61 a 2,64 ab 0,78 a 1,02 a 0,86 a 1,28 a 1,14 a 1,16 a 0,90 a	1,70 a 1,70 a 3,10 a 0,43 a 0,70 a 1,37 a 1,63 a 1,01 a 1,48 a 0,76 a	1,46 a 1,43 a 1,64 b 0,61 a 0,79 a 1,27 a 1,71 a 0,84 a 1,59 a 0,56 a

Letras distintas en una misma nía representan diferencias estadísticamente significativas al 5% según test de Tukey.

Peso seco aéreo.- Al igual que lo ocurrido con el peso seco radical, las distintas poblaciones de H trifolii tampoco afectaron en forma significativa el desarrollo aéreo de las plantas, evaluado como peso seco (Cuadro 3). La única especie que vio alterado su peso seco aéreo fue el trébol rosado "Quiñequeli" inoculado con población III, que fue significativamente superior al testigo. Este hecho, puede ser atribuible en gran medida al efecto del nemátodo al incrementar el desarrollo de las raíces y por lo tanto, de acuerdo a los resultados obtenidos anteriormente, eran esperadas estas respuestas.

Diversos autores señalan a H trifolii como uno de los responsables de la disminución del rendimiento en las praderas; sin embargo, de acuerdo al grado de tolerancia de la planta esta puede crecer satisfactoriamente y dar un buen rendimiento, aunque sean susceptibles al nemátodo (Mercer et al), es decir, bajo condiciones particulares no se manifestaría una pérdida significativa en la producción neta de las plantas (Yeates, 1987).

Desarrollo de H trifolii.- Al analizar el comportamiento reproductivo de una misma población del nemátodo sobre las distintas especies vegetales, en el Cuadro 4, se aprecia que H trifolii formó quistes en todas ellas, siendo el número de éstos significativamente más altos en ambos cultivares de trébol blanco con respecto a los restantes hospedantes.

Siguiendo el planteamiento de Grant et al (1996), quienes señalan que el carácter distintivo definitivo en la eficiencia de un hospedero su efecto en la reproducción del nemátodo, lo que comúnmente se basa en el número de quistes producidos, es evidente que, para las cuatro poblaciones de H trifolii ambos cultivares de trébol blanco se comportan como los mejores hospederos, concordando con lo señalado en la literatura (Singh y Norton, 1970). En el caso de la población IV, sin embargo, el trébol subterráneo "Clare" y el trébol rosado "Quiñequeli resultaron ser estadísticamente iguales al trébol blanco Huia".

En general, el número de quistes desarrollados por cada una de las poblaciones del nemátodo en los hospederos mas favorables puede considerarse normal según lo obtenido en otros ensayos (Krausz, 1995, Daguer, 1996),no obstante al igual que en los trabajos antes señalados se registró una amplia variación entre los resultados de las macetas de un mismo tratamiento.

Cuadro 3.   Efecto de H trifolii sobre el peso seco aéreo (g por maceta) de leguminosas
                    forrajeras.
                   Effect of H trifolii on dry shoot weight (g) of forage legumes.


Especie	Cultivar	Pob. I	Pob. II	Pob. III	Pob. IV	Testigo

T. repens T. pratense T. Subterraneum M. sativa L. uliginosus L. corniculatus T. incarnatum	Huia Kopu Quiñequeli Clare M. Barker WL 320 Pionner 555	5,28 a 5,19 a 7,44 ab 3,27 a 6,61 a 2,04 a 2,88 a 5,17 a 2,98 a 4,32 a	4,15 a 4,79 a 7,52 ab 3,46 a 4,45 a 2,46 a 2,02 a 6,11 a 2.43 a 2,80 a	5.18 a 5,24 a 8.92 a 4.13 a 5,06 a 1,48 a 1,78 a 5.42 a 2.54 a 4,08 a	4.86 a 5.42 a 8,19 ab 3,75 a 5.51 a 2,15 a 2.53 a 5,97 a 2.41 a 4,54 a	5.15 a 4.87 a 5.70 b 3.50 a 5.47 a 2.10 a 2.07 a 4.86 a 4.25 a 2,80 a

Letras distintas en una misma fila representan diferencias estadísticamente significativas al 5% según test de Tukey.

Cabe señalar, que el análisis estadístico realizado para determinar eventuales diferencias en el comportamiento reproductiva entre las poblaciones del nemátodo sobre una misma especie vegetal no arrojó diferencias significativas, aún cuando en el Cuadro 4 se aprecian resultados variables en este parámetro. Ello puede ser atribuible, entre otros factores, a que no fue posible garantizar la sanidad y viabilidad de los huevos y juveniles inoculados, por lo que puede que muchos de ellos hayan estado contaminados con hongos y bacterias actuando estos últimos como un control biológico. Por su parte Fresard (1996) determinó, en condiciones in vitro, que el porcentaje de eclosión de los juveniles infectivos en esta especie alcanza un 72 % en 10 días, transcurridos los cuales no se forman más juveniles II en los huevos; esto supone que sólo parte de las poblaciones inoculadas llegan a penetrar la raíz, a lo que se suma el hecho que en el presente ensayo el inoculo se incorporó sectorizado alrededor del sistema radical de las plantas lo que ciertamente puede haber afectado la homogeneidad entre las repeticiones.

Al comparar el número total de huevos y juveniles formados en cada tratamiento (Cuadro 5), tampoco no se obtuvieron diferencias significativas entre cada una de las poblaciones del nemátodo sobre un mismo hospedero, las que, sin embargo, se hicieron evidentes al ser comparado este parámetro entre los diferentes hospederos, para una misma población de H trifolii. En este caso nuevamente se aprecia que los mejores hospederos son el trébol blanco "Huia" y "Kopu" para la poblaciones I y III y además de estos el trébol subterráneo "Clare", para las poblaciones II y IV.

Destaca en el Cuadro 5, la diferencia en el contenido de huevos y juveniles en los quistes formados sobre ambos cultivares de trébol subterráneo, lo que puede atribuirse a una mayor resistencia del cultivar "Mount Barker" a este nemátodo según lo planteado por Grant et al (1996).

En general, se aprecia que para las cuatro poblaciones de H trifolii evaluadas, los quistes desarrollados en trébol blanco "Huia" contenían una mayor cantidad de huevos y juveniles, lo que confirma su calidad de mejor hospedante para este nemátodo.

Cuadro 4.   Número total de quistes desarrollados por cuatro poblaciones de H. trifolii en
                   diferentes leguminosas forrajeras.
                   Total number of cysts developed for each H. trifolii population «n different
                   forage legume.


Especie	Cultivar	Pob. I	Pob. II	Pob. III	Pob. IV

T. repens T. pratense T. Subterraneum M. sativa L. uliginosus L. corniculatus T. incarnatum	Huia Kopu Quiñequeli Clare M. Barker WL 320 P. 555	368,7 c 279,0 c 27,9 ab 29,0 ab 10,0 b 5,0 b 3,5 ab 1,0 a 5,0 b 3,0 ab	97,7 b 84,5 b 16,0 a 78,7 b 8,5 a 4,5 a 4,0 a 3,5 a 2,5 a 2,5 a	91,9 e 163,2 e 8,3 bcd 20,7 d 4,5 bc 4,5 bc 5,0 bc 0,5 a 4,5 bc 2,0 c	147,7 ef 521,0 f 39,9 cde 74,9 de 5,5 abc 3,0 c 8,0 bc 5,5 abc 3,0 abc 2,0 a

Letras minúsculas indican diferencias estadísticamente significativas entre las leguminosas forrajeras evaluadas para una misma población según prueba de Kruskal Wallis.

Cuadro 5. Población de huevos y juveniles de H. trifolii obtenidos por maceta.
Eggs and juveniles population in H. trifolii cyst per pots.


		H. trifolii
Especie	Cultivar	Pob. I	Pob. II	Pob. III	Pob. IV

T. repens T. pratense T. Subterraneum M. sativa L. uliginosus L. corniculatus T. incarnatum	Huia Kopu Quiñequeli Clare M. Barker WL 320 Pionner 555	33.883,4 c 29.814,9 c 1.344,1 ab 2.290,6 ab 28,9 b 0,5 b 0,0 ab 2,6 a 41,1 b 0,0 ab	9.856,9 b 4.831,6 b 357,6 a 5.739,6 b 36,0 a 6,0 a 2,8 a 6,0 a 1,1 a 0,0 a	8.521,2 e 12.278,2 e 177,2 b e 1.657,6 d 17,8 b e 83,0 b e 0,0 a 0,3 a 49,1 b e 4,6 ab	14.652,6 ef 46.824,5 f 1.852,6 cd 6.463,7 de 0,5 ab 0,0 a 5,3 ab 5,0 ab 14,3 ab 0,0 a

Letras distintas en una misma columna indican diferencias estadísticas según pruebas de Kruskal Wallis.

Cuadro 6. Número promedio de huevos y juveniles formados por quiste.
Mean number of eggs and juveniles per H. trifolii cyst.

Especie Cultivar

H. trifolii

Pob. I

Pob. II

Pob. III

Pob. IV

T. repens	Huia 1
	Kopu
T. pratense	Quiñequeli
T. Subterraneum	Clare
	M. Barker
M. sativa	WL 320
	Pionner 555
L. uliginosus
L. corniculatus
T. incarnatum

74,30
90,25
28,35
66,90
1,95
0,10
0,00
1,10
8,25
0,00

108,70
62,10
23,10
67,90
3,60
0,80
0,55
1,80
0,25
0,00

95,45
76,50
17,20
56,20
2,55
10,70
0,00
0,10
6,00
0,75

70,00
49,80
18,55
62,60
0,10
0,00
1,05
0,50
2,00
0,00

Esto se comprueba al analizar el número de huevos y juveniles promedio producidos por quiste (Cuadro 6), donde es posible observar una clara diferencia entre los cultivares de trébol blanco, trébol rosado y trébol subterráneo "Clare" respecto del resto de especies evaluadas.

Por otro lado, en trébol subterráneo "Mount Barker", alfalfa, alfalfa chilota, lotera y trébol encamado el número de huevos desarrollados por quiste fue escaso o nulo, lo que resultó por lo tanto en el bajo número de huevos y juveniles totales obtenidos. Singh y Norton(1970) reportan que en hospederos desfavorables, los juveniles del nemátodo que logran penetrar a la raíz desarrollan generalmente quistes pequeños en los cuales no se forman huevos , lo que coincide con los resultados del presente ensayo.

CONCLUSIONES

Bajo las condiciones en que se desarrolló el ensayo y de acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que:
— La infestación de H. trifolii no provocó una disminución significativa en el rendimiento de las plantas, medido este como peso seco radical y aéreo.

— Aún cuando los resultados numéricos mostraron variaciones entre las cuatro poblaciones del nemátodo inoculadas sobre un mismo hospedero no se registraron diferencias significativas entre ellas.

— El trébol blanco se comportó como el mejor hospedero para el nemátodo, permitiendo la formación de un número significativamente mayor de quistes, así como de huevos y juveniles en estos, con respecto a las restantes especies evaluadas.

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EVALUACION DE CUATRO POBLACIONES DE Heterodera trifolii Goffart EN LEGUMINOSAS FORRAJERAS1