CARACTERIZACION MORFOLOGICA Y GERMINACION
DE CEPAS DEL HONGO ENTOMOPATOGENO
METARHIZIUMANISOPLIAE VARANISOPLIAE, ASOCIADO
A LARVAS DE ESCARABAEIDOS Y CURCULIONIDOS

Jaime Guerrero C¹. Roberto Carrillo Ll.² y Alfonso Aguilera P.¹
1. Fac. Cs. Agropecuarias y Forestales. Universidad de La Frontera.
2. Fac. Cs. Agrarias. Universidad Austral de Chile.

Recepcion originales 17 de Mayo 1999.
Proyecto 9603.Dirección de Investigación Universidad de la Frontera

ABSTRACT

Morphological characteristic and conidia germination of entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var anisopliae isolated of scarabaeidae and curculionidae larvae.

Ten strains of Metarhizium anisopliae var anisopliae obtained from Hylamorpha elegans, Phytoloema hermanni, Schizochellus breviventris and Brachysternus prasinus (Coleoptera: Escarabaeidae) and Graphognathus leucoloma and Aeghorhinus sp. (Coleoptera: Curculionidae) larvae coming from soil with natural grassland of three different edaphoclimatic areas (pre-mountain chain, central valle and coastal dry land of the 9th Region). The strains were characterized considering conidia morphology and germination.
The characteristic conidia form was observed in the strains of M. anisopliae var. anisopliae. The growth and colour of colony were different amony strains. The conidia mean size was 6.0 mm long (5.2 -7.1 mm) and 2.2 mm wide (2.0- 2.6 mm). Conidia mean germination varied significantly among the strains with a 24 to 92.3% range and a mean of 49.3%, for those coming from scarabeides and 83.8% for the ones from curculionides.

Key words: Entomopathogenic fungi, Metarhizium anisopliae, fungi morphology, fungi germination.

RESUMEN

Las cepas de Metarhizium anisopliae var anisopliae fueron obtenidas desde larvas de Hylamorpha elegans Burm, Phytoloema herrmanni Germ, Schizochellus breviventris y Brachyternus prasinus Guer. (Coleopetera: Scarabaeidae), y de Graphognathys leucoloma y Aeghorhimus sp. (Coleoptera: Curculionidae), provenientes de suelo con pradera natural de 3 áreas edafoclimáticas diferentes; Pre-cordillera, Llano Central y Secano Costero de la IX Región.
Los hongos se caracterizaron por presentar hifas lisas, septadas conidias predominantemente cilindricas, agrupados, hialinas, verde oliva, uninucleados de extremos redondeados, el tamaño promedio fue de 6,0 mm de largo (Rango 5,2 - 7,1 mm) y de 2,2 mm de ancho (rango 2,0 - 2,6 mm), aspectos coincidentes con lo señalado para esta especie. El crecimiento de las colonias del hongo se caracterizó por un crecimiento circular, con variados matices de verde, los que difirieron entre las cepas. La germinación promedio de las conidias varió significativamente entre las cepas con un rango entre 24 y 92,3% y en promedio para las provenientes de escarabaeidos fue de 49,3% y para las de curculiónidos 83,8%.

INTRODUCCION

Escasa son las referencias sobre hongos entomopatógenos que se registran en Chile debido a que ha sido poco estudiados. Al respecto, Aruta y Carrillo (1989), consignan que la identificación de los hongos entomopatógeno y su importancia en la regalación de poblaciones de insectos, ha sido un aspecto escasamente estudiado en Sur América y en Chile.

El primer reporte de un hongo entomopatógeno en Chile, data de 1957, en el que se asocia a Metarhizium anisopliae como un patógeno de las especies de Scarabaeidos Hylamorpha elegans, Phytoloema hermanni y Brachysternus sp. (Dutky, 1957). Vásquez (1977), reporta a los hongos Metarhizium anisopliae (Metsch) y Beauveria vermiconia Hoog y Rov, en larvas de Hylamorpha elegans (Burn), Phytoloema hermanni (Germ) y Sericoides germaini D.T. conocidos al estado adulto como "pololo verde o San Juan", "pololo café" y "pololo café chico", respectivamente.

Determinaciones para Chile de hongos del orden Entomophthorales asociados con especies de áfidos, tipulidos, taquinidos y trips, fueron informados por Aruta, et al, (1974); Aruta et al. (1984) y Aruta y Carrillo (1989).

Prado (1991), señala que en otros países ya se han usado formulaciones comerciales de hongos como controladores de insectos. Sin embargo en Chile no se han utilizado, no obstante se ha constatado que en forma natural están produciendo un control exitoso en determinados casos; tales como especies de Entomophthora, asociados a diferentes especies de áfidos; el género Beauveria asociado con hepiálidos, y B. brongniantti en Pieris brassicae; el hongo Metarhizium sp. en hepiálidos y M. anisopliae, atacando Aegorhinus superciliosus y S. germaini. También menciona a Neozygites parvispora en Trips tabaci y Conidiobolus apiculatus en Ribautania tenerrima.

Ripa y Rodríguez (1989), evaluaron la susceptibilidad de larvas de Naupactus xanthographus (Coleóptera: Curcu-lionidae) a ocho aislamientos de M. anisopliae; determinando que todos los aislamientos mostraron alta virulencia al usarse en concentración de 10⁶ y 10⁷ espora/ml y que a 25° C las cepas causan mayor mortalidad que a 10° y 13° C.

En el género Metarhizium (Hyphomycete), se han reportado siete especies: M. anisopliae (Metschn) Sorokin; M.flavoviride Gams y Rozypal; M. album (Petch); M. pingshaeme Chem y Giro; M. guizhousense Chem y Giro, y M. taii Liang y Liu (Liang et al, citado por Rath et al. 1995a). De las especies conocidas, M. anisopliae, M.flavoviride y M. album, son las que presentan una mayor gama de hospederos y amplia distribución geográfica Tulloch, 1976; (Fegan et al. 1993). Estos autores estiman también que la toxonomía de este género, aún es causa de controversia. El género Metarhizium, tiene una amplia distribución geográfica y rango de hospederos (Tulloch, 1976). M. anisopliae, es un patógeno facultativo que ataca más de 200 especies de insectos (Fargues 1976). La especie ha sido clasificada en dos variedades sobre la base del tamaño de las conidias; M. anisopliae var anisopliae (conidias más pequeñas 3,5-9 mm de largo) y M. anisopliae varmajus (conidias más larga, en un rango de 9-18 mm) (Tulloch 1976; Samson et al. 1988). Respecto de los hospederos la var anisopliae muestra un amplio rango de hospedantes, y la var. majus un menor rango y restringido primariamente al coleóptero Oryctes rhinoceros (Rombach et al.) citado por Gillespie y Claydon, (1989). También es distintivo que ambos tipos de M. anisopliae, producen in vivo e in vitro, compuesto péptidos llamados destruxinas durante el proceso de patogénesis (Roberts, 1981).

Jackson y Glare (1992), citando a varios autores indican que M. anisopliae, consiste en una colección de capas que exhiben diferencias morfológicas, enzimáticas, bioquímicas y patogénicas. Rosen y Debach, (1973) consideran que la identificación correcta de las plagas y sus enemigos naturales a través de una sistemática precisa y rigurosa tiene la máxima importancia y es la base de los programas de investigación en control biológico.

Poprawski et al., (1988), indican que la ocurrencia frecuente de hongos Deuteromycetes en la población de insectos plaga, como coleópteros, da la posibilidad de estudiar aislamientos de hongos entomopatógenos como Beauveria y Metarhizium.

En este trabajo se presentan los resultados en relación con la identificación, caracterización morfológica y germinación de conidias de cepas de M. anispliae.

MATERIALES Y METODOS

Las larvas sanas y enfermas colectadas y debidamente identificadas, se mantuvieron en envases de plástico con suelo del lugar muestreado, bajo condiciones de laboratorio (18°C y 90% HR) indicando fecha de recolección y localidad. Cuando mostraban síntomas de estar parasitadas por hongos, fueron separadas del sistema y dejadas aisladas para su observación y posterior aislamiento del hongo.

El origen de las cepas de Metarhizium se presentan en el Cuadro 1, se consideraron siete cepas provenientes de larvas de cuatro especies de scarabaeidos y tres provenientes de larvas de dos especies de curculiónidos.

Las cepas se aislaron en medio de cultivo, utilizando conidias obtenidas directamente del micelio espomlado que crecía en las larvas muertas y mediante un suspensión de conidias removidas por inmersión de las larvas en agua destilada estéril a la que se agregó el adyuvante humectante., Citowet (0,05%); alícuotas de la suspensión (0,5 ml) se dispensaron sobre la superficie del medio selectivo. La purificación de las colonias se efectuó mediante repiques.

Los aislamientos en placas de Petri, se mantuvieron por 15 días en estufa de cultivo a 25°C±1°C. Posteriormente fueron repicados a tubos de ensayo con igual medio de cultivo y mantenidos en condiciones de refrigeración a 4° C. Como medio de cultivo se usó agar (1,5%), dextrosa (1,0%), extracto de malta (1,0%), peptona (1,0%) por cada 1000 ml. Este medio es informado en la literatura consultada como adecuado para el aislamiento de M. anisopliae, (Barnes et al. 1975; Garza, 1994. La preparación del medio de cultivo se realizó según la metodología indicada por (Frech y Herbert, 1980).

El tipo de crecimiento y color verde y predominante de las colonias fue evaluado luego del período de incubación, mediante observación visual, consignándose esta caracterización para cada una de las cepas y agrupándolas según características comunes.

Para la identificación del hongo se utilizaron los criterios y clasificación propuestos por Weiser y Briggs (1971), Tulloch (1976), Weisser (1977), Samson et al, (1988) y Humber (s.f.). Para corroborar los cultivos puros de los hongos fueron enviados al "International Micological Institute" Inglaterra
.
La germinación de las conidias fue evaluada en agar dextrosa (4%) después de 48 h de incubación a 20°C. Usando el microscopio de contraste de fase, las conidias se consideraron germinadas cuando el largo del tubo germinativo medía más de la mitad del diámetro ecuatorial de la conidia. Para determinar la viabilidad fueron examinadas 300 conidias en tres grupos de 100. Las placas con las cepas fueron dispuestas en un diseño completamente aleatorizado y cada placa constituyó una repetición sobre la cual se evaluó la germinación. Los resultados fueron sometidos a un análisis de varianzas y las medias fueron comparadas a través de la prueba de rango múltiple de Tukey a un nivel de significancia de 5%.

RESULTADOS Y DISCUSION

El aspecto característico de M. anisopliae var. anisopliae parasitando larvas de H. elegans, se presenta en la figura 1. Las características de las conidias se aprecian en la figura 2. El hongo esporuló abundantemente en el medio (agar-dextrosa-extracto de malta-peptona) luego de 5-7 días, formando colonias circulares y extensas de textura variable y con variados matices de verde, predominando el color verde oliváceo de las masas de esporas, adquiriendo posteriormente un verde más oscuro (Figura 3).

Figura 1      Larvas de Hylamorpha elegans con infección de Metrhizium anisopliae var anisopliae. a) inicio de infección natural y b) fase de esporulación.

Hylamorpha elegans larvae with infection of Metarhizium anisopliae var anisopliae. a) begining natural infectio, and b) porulation.

Figura 2      Conidioforos y conidias de Metarhizium anisopliae var anisopliae obtenidas de larvas de Hylamorpha elegans. Aumento 40x y l00x respectivamente.

Metarhizium anisopliae var anisopliae conidiphore and conidias obteined from Hylamorpha elegans larvae.

Figura 3     Aspecto de colonias de Metarhizium anisopliae var anisoplia en medio de cultivo (agar, dextrosa, Ext. Malta, peptona), a 20°C.a) con 7 días de incubación, b) Diferencias entre cepas.

Metarhizium anisopliae colony aspect in cultive médium (agar, dextrosa, Ext, Malt, peptone) at 20°C. a) 7 days of incubation, b) different growth between strains.

En base al tipo de crecimiento y color verde predominante de las colonias, se ordenaron las cepas. Grupo 1 (cepas 36, 53, 89 y 321); verde oliváceo, claro crecimiento circular muy definido. Grupo 2 (cepas 7, 85 y 78); verde oscuro, crecimiento circular definido. Grupo 3 (cepas 101. 110 y 120); verde oscuro, crecimiento circula poco definido y con esporulación más abundante. Respecto de las características de cultivo del hongo, Yip et al. (1992), indican que por este medio se ha podido separar algunas poblaciones de M. anisopliae, pero no siempre son seguras para discriminar entre aislamientos individuales. Algunas características morfológicas del hongo y del crecimiento en medio de cultivo artificial, han sido también descritas por St. Leger et al. 1986.

Las cepas provenientes de larvas de Hylamorpha, exhibieron un patrón de crecimiento y aspecto similar, muy semejante a las cepas obtenidas desde Schizochelus, Brachysternus y Phytoloema, los que diferían de las colonias provenientes de Aeghorrhinus y Graphognatus. Por lo tanto el aspecto de la colonia en el medio de cultivo usado, estuvo relacionado con la especie insectil hospedera y no con la distribución geográfica. Al comparar las cepas según lugar geográfico de origen y época de colecta, no se estableció una relación con el aspecto de las colonias. En relación al color de las colonias de M. anisopliae, Brady (1979 a y b) describe que se caracterizan por presentar variados matices de amarillo verdoso, oliváceo, verde oscuro, rosado y vinaceos.

Goettel et al. (1989), señalan que también se utiliza para la identificación de Metarhizium, la correlación de aspectos morfológicos propuesta por Humbert en 1983, que considera las características del núcleo, número de núcleos de las conidias primarias, forma y presencia de capiloconidias y otras formas conidiales secundarias; sitio y localización del desarrollo vegetativo, relación entre hospedero y patógeno y rango de hospedantes.

En este estudio el tamaño promedio de las conidias de las cepas de M. anisopliae var anisopliae (Cuadro 2) fue de 6,0 mm de largo (rango 5,2 y 7,1 mm) y de 2,2 mm de ancho (rango 2,0 y 2,6), las dimensiones extremas variaron entre 1,5 y 3,1 mm de ancho 4,4 y 7,5 mm de largo (Figura 2). Las características y tamaño promedio de las conidias de las cepas evaluadas, se enmarcan en el rango (3,5 y 9,0 mm de largo, usualmente 5,0 y 8,0 mm de largo) indicados para M. anisopliae var anisopliae por Tulloch (1976) Samson (1988) y Brady (1979). Según Tulloch (1976), los aislamientos de M. anisopliae var anisopliae, producen colonias que pueden tener uno o muchos matices de verde, las conidias son cilindricas a ovales comúnmente truncada en los extremos y miden 3,5-9,0 mm de largo (promedio 5-8 mm). Al respecto St. Leger et al. (1992), encontraron que el tipo de crecimiento de las colonias de M. anisopliae, estaba relacionada con el hospedante original del aislamiento y que éstos fueron genéticamente distintos. El hongo se caracterizó por presentar hifas lisas, septadas, de crecimiento dicotónico, con conidióforos cilindricos en grupos; conidias con la forma típica de M. anisopliae, predominantemente cilindricas, hialinas, verde oliva, uninucleadas, de extremos redondeados y agrupadas en cadenas de sucesión basipétala que se rompían en conidias individuales.

Se observó que la forma predominante de las conidias difería entre algunos aislados, observándose para los aislados 101, 110 y 120 provenientes de larvas de curculiónidos que las conidias eran más cilindricas y levemente más anchas, que las de las cepas 7, 36, 53, 78, 85, 89 y 321, provenientes de larvas de scarabaeidos, las que presentaban un leve estrechamiento de la parte media y que corresponde a la forma típica de la var anisopliae indicada en la literatura.

Respecto de las dimensiones de las conidias Bridge et al. (1993), señalan que es un carácter taxonómico que permite diferenciar las especies del género Metarhizium; sin embargo, las dimensiones de las conidias de M. anisopliae y M. flavoride se pueden superponer, en consecuencia no es suficiente sólo la medida de las conidias para discriminar entre las especies de este género. Los mismos autores, citando a Kamat et al. (1952), indican que el tamaño de las conidias de M. anisopliae puede depender también del medio de cultivo empleado.

La taxonomía clásica se basa en las características de micelio, tamaño, forma y color de conidióforos y conidias y color de las colonias. El género Metarhizium presenta conidióforos cortos, erectos o ramificados agrupados semejando estromas; habitualmente mononemateaceos pero también sinemataceos, cuando ocurren sobre artrópodos enterrados en el suelo o bajo otro sustrato. Las células conidiogénicas cilindricas o ligeramente curvadas con ápices redondeados, nacen en verticilo, semejando un candelabro. Las conidias de una célula, de pared lisa, cilindricas a ovoides, hialinas, brillantemente coloreadas verde oliva, se forman en largas cadenas basipétalas comúnmente agrupadas en columnas prismáticas. Teleomorfo no conocido (Samson et al, 1988).

Según Tulloch, 1976, este hongo no tiene ciclo sexual conocido y se reproduce sólo por conidias. Sin embargo, Liang et al, 1991, informan que el estado sexuado de Metarhizium corresponde a Cordyceps. La germinación de las conidias de las cepas en agar-dextrosa (4%) a 20°C, se presenta en el Cuadro 3 y el análisis respectivo indica que la germinación promedio varió significativamente entre las cepas con un rango entre 24% y 92,3%.

Rath et al. (1995) denotan que los aislamientos de M. anisopliae, pueden ser agrupados de acuerdo a características biológicas relevantes, como germinación y crecimiento a diferentes temperatura y características de las conidias (tamaño, color y forma predominante) los mismos autores consideran que la heterogenidad y no obstante la naturaleza grupal de Metarhizium ha sido objeto de numerosos estudios; sin embargo, el aspecto taxonómico es todavía poco claro. Según lo consigna Rath et al. (1995b), el mayor problema en la investigación de la taxonomía de Metarhizium es que las cepas examinadas difieren entre los laboratorios y en consecuencia los resultados no pueden ser correlacionados unos con otros, sugieren que a futuro la investigación debería orientarse a caracterizar grupos comunes de aislamientos a través de variadas técnicas.

La identificación de los aislamientos fueron corroborada por el "International Mycological Institute". Se seleccionaron dos cepas basado en el criterio de que éstas representaran a dos familias de coleópteros plaga evaluados en este estudio. La cepa 321, obtenida de H. elegans. (Col. Scarabaeidae) y la 101 obtenida de Aegorhinus sp. (Col. Curculionidae), fueron clasificadas como M. anisopliae var anisopliae, quedando registradas en dicho centro micológico, con los números clave IME 373481 e IMI 373482 respectivamente.

Basado en la forma y tamaño de las conidias, se concluye que todas las cepas evaluadas provenientes de especies de scarabaeidos y curculiónidos correspondieron a M. anisopliae var anisopliae.

CONCLUSIONES

Se identificó el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae va.r anisopliae, asociado con Hylamorpha elegans, Phytoloema
hermanni, Schizochelus breviventris y Brachysternus prasinus (Col. Scarabaeidae) y con Aeghorhinus sp. y Graphognathus eucoloma (Col. Curculionidae).

El tamaño promedio de las conidias de la cepas de M. Anisopliae var anisopliae fue de 6,0 mm de largo (rango 5,2-7,l mm) y de 2,2 mm de ancho (rango 2,0 - 2,6 mm) valores en el rango señalado para esta especie.

La germinación promedio de las conidias en medio agar-dextrosa varió significativamente entre las cepas, con un rango entre 24% y 92,3% y en promedio, para las obtenidas desde scarabaeidos fue 49,3% y desde curculiónidos 83,8%. Las cepas de M. Anisopliae var anisopliae provenientes de larvas de H. elegans exhibieron menor germinación.

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