Recepcion originales 2 de Febrero de
1999
Biotechnoloyy abd plant genetic resources
Keywords : Biotechnology; cryopreservation; molecular
markers; genetic resources.
Although most Chilean genetic resources are considered endemic species and unique
on a world-wide basis, important fact to develop new valuable agronomic alternatives,
there are cases reflecting their effective use by countries other than Chile.
The latest biotechnological developments concerning management of plant genetic
resources are discussed in this paper. Application of molecular marker technologies,
in vitro approaches to germplasm conservation and development of core
collections may lead to a more efficient and focused management of genetic resources.
The increasing difficulty to obtain germplasm necessary for breeding activities
sustains the active integration of biotechnological approaches into the management
of genetic resources. This may lead to a more rational exploitation of Chilean
genetic resources not only from an agricultural but also from an industrial,
chemical and pharmaceutical perspectives.
Palabras claves: biotecnología; criopreservación;
marcadores moleculares; recursos genéticos.
Aún cuando Chile posee una elevada proporción de recursos genéticos
endémicos, únicos a nivel mundial y de gran valor para el desarrollo
de nuevas alternativas agrícolas, existen ejemplos que reflejan su efectiva
utilización por otros países en lugar de su uso para beneficio
nacional. El presente trabajo discute los avances biotecnológicos más
recientes de relevancia para el manejo de recursos genéticos vegetales.
La utilización de marcadores moleculares, la conservación in
vitro de germoplasma y el desarrollo de colecciones nucleares permitirán
un uso más eficaz y dirigido de los recursos genéticos, particularmente
en aquellas etapas que preceden su colecta. La creciente dificultad en acceder
a germoplasma valioso para fitomejoramiento hace necesaria la efectiva integración
de la biotecnología al manejo de recursos genéticos, lo cual facilitará
la explotación racional del germoplasma chileno desde una perspectiva
agrícola, industrial, química y farmacéutica.
La situación agrícola actual de Chile, basada en una agricultura competitiva de exportación, posee una creciente demanda por nuevas alternativas productivas. Los recursos fitogenéticos constituyen una importante fuente de diversificación, generando nuevos productos y/o servicios agropecuarios, y se definen como aquellos materiales vegetales de uso actual o potencial en beneficio de la humanidad (Cubillos, 1994). Según Frankel (1971), se consideran recursos genéticos vegetales: las especies silvestres y primitivas de las plantas cultivadas, las razas o variedades locales ("landraces"), los cultivares obsoletos, los cultivares modernos y los genotipos especiales. Ejemplos de tales categorías se observan en el Cuadro 1.
| Cuadro 1: Clases y ejemplos de recursos genéticos. Table: Classes and examples of genetic resources. |
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Si bien Chile en comparación con otros países no es una nación rica en cuanto al número de especies disponibles, posee un gran potencial derivado de la variabilidad genética existente en las especies que posee, Marticorena (1990), indica que Chile posee alrededor de 6.265 especie de plantas de las cuales 85,5 % corresponden a especies naturalizadas y/o endémicas. Los materiales endémicos revisten especial importancia, puesto que constituyen un material estratégico como patrimonio fitogenético único y exclusivo en el mundo.
Es esencial desarrollar mecanismos que permitan utilizar activamente los recursos genéticos del país como fuente de diversidad genética útil para la creación y mejoramiento de variedades y nuevas alternativas productivas.
La recolección de germoplasma es la etapa inicial del estudio de los recursos genéticos, sin embargo, posee un valor limitado si no se articula con una adecuada conservación, caracterización y posterior evaluación. Estas dos últimas etapas se consideran mucho más importantes en el caso de aquellas especies carentes de programas de mejoramiento genético desarrollados en el país. El desafío actual es colectar y caracterizar apropiadamente los recursos genéticos, posibilitando así el uso directo de su variabilidad genética en fitomejoramiento.
Las actividades genéricas asociadas al manejo de recursos fitogenéticos son: prospección, colecta, caracterización, evaluación, conservación e intercambio de germoplasma a nivel nacional e internacional. Mediante técnicas biotecnológicas es posible lograr un desarrollo más enciente de las actividades mencionadas, proporcionando así nuevas alternativas para utilizar los recursos genéticos, como se discute a continuación.
Exploración y colección de germoplasma
Según Raven (1994), la tasa de extinción de especies vegetales alcanza a 5%, implicando que anualmente a nivel mundial se extinguen irreversiblemente unas 1.250 especies de plantas. Las razones para lo anterior son múltiples, entre las cuales destacan: a) destrucción de ecosistemas naturales debido a proyectos de irrigación, hidroeléctricos, construcción de nuevos caminos y urbanización; b) desplazamiento de cultivares tradicionales y/o razas nativas por variedades mejoradas de mayor productividad; y c) cambios en las prácticas agrícolas y uso indiscriminado de agroquímicos. Bajo tales circunstancias es imperativo colectar y conservar la diversidad genética aún disponible en manos de pequeños agricultores o en el hábitat natural de las especies.
El análisis de la distribución espacial de la fitodiversidad permite comprender la dinámica de las poblaciones naturales, el flujo de genes entre material cultivado y silvestre y la evolución de estos acervos, permitiendo una efectiva planificación y muestreo de germoplasma en una región particular (Roca, 1997).
Si bien el material colectado corresponde a un conjunto de fenotipos, su real utilidad la constituye su componente genotípico. En este sentido, un aporte sustantivo de la biotecnología al manejo de recursos genéticos lo constituye el uso de marcadores moleculares (ver sección siguiente).
Mediante simulaciones se ha determinado que el uso de marcadores genéticos permite retener una mayor cantidad de alelos en los materiales colectados y particularmente aquellos fijados geográficamente, la clase alélica más frecuentemente eliminada mediante erosión genética (Bataillon et al., 1996). En tomate, Miller y Tanksley (1990), determinaron mediante RFLPs que agregar una accesión extra de L. peruvianum en lugar de una de L. esculentum incrementaba 20 veces la posibilidad de agregar nuevos alelos valiosos durante una colecta de material latinoamericano. Así mismo, el tamaño aproximado de las colecciones a desarrollar pueden ser determinados en función de la riqueza alélica determinada mediante marcadores moleculares (Zoro et al., 1998).
Colectas in vitro de germoplasma
Técnicas de cultivo in vitro se utilizan en terreno para reducir las dificultades prácticas de colectas de germoplasma, especialmente en especies cuyo traslado hacia los bancos de germoplasma causa deterioros por daño mecánico y/o ataques de plagas y enfermedades (Ashmore, 1997; Rao y Riley, 1994). Lo anterior esencialmente consiste en esterilizar explantes del material colectado para posteriormente depositarlos en medios de cultivo estériles a través de un procedimiento simple que sólo requiere equipo rudimentario. La técnica ha sido utilizada exitosamente en algodón (Gossypium spp.), cacao (T. cacao), vides (Vitis spp.). (Altman et al., 1990; Elias, 1988; Withers, 1995) y algunas forrajeras (Rudezco, 1991). El traslado de material in vitro desde el sitio de colecta es especialmente conveniente para especies alógamas, especies con semillas de reducido poder germinativo, especies con semillas recalcitrantes y aquellas de reproducción vegetativa.
Caracterización y evaluación de germoplasma
Dificultades presupuestarias y de infraestructura han limitado la transición de la etapa de colecta a la de caracterización y evaluación de germoplasma de numerosos programas de recursos genéticos.
Históricamente, las colectas de germoplasma tenían como objetivo principal dilucidar el status taxonómico y las relaciones evolutivas entre las especies colectadas y las cultivadas. En la actualidad sin embargo se considera que el sustento principal de la colecta y conservación de germoplasma es su utilización en fitomejoramiento. La caracterización de la variabilidad disponible solamente se logra mediante una sistemática caracterización y evaluación de las colecciones existentes.
Según Potter y Jones (1991) y Harding (1996), la caracterización del germoplasma puede realizarse utilizando una gran variedad de métodos tales como: Marcadores morfológicos y caracteres agronómicos; marcadores citológicos (cariotipos); marcadores bioquímicos (análisis de isoenzimas, electroforesis de proteínas, metabolitos secundarios) y marcadores moleculares (RFLPs, AFLPs, RAPDs, microsatelites y otros).
La tendencia actual es utilizar marcadores moleculares, entendiéndose por tal a todo aquel sistema que permite detectar variabilidad directamente al nivel del ADN. Una descripción detallada de los sistemas de marcadores moleculares existentes se encuentra en Andersen y Fairbanks (1990); Campos De Quiroz (1996); Caetano- Anollés y Greshoff (1997) y Vekemans y Jacquemart (1997). Los marcadores moleculares ofrecen un grado de resolución superior al de otras alternativas tecnológicas como proteínas de reserva o metabolitos secundarios (Rao y Riley, 1994), además de generar un volumen de información superior.
El uso de marcadores moleculares permite determinar una serie de interrogantes como: análisis de diversidad genética, estudios de relaciones filogenéticas entre especies y taxas superiores, identificación de materiales duplicados en las colecciones y análisis molecular de los procesos de regeneración de germoplasma.
Los volúmenes de material asociados al análisis de recursos genéticos determinan el uso preferente de marcadores moleculares basados en PCR (Polymerase Chain Reaction) puesto que ellos requieren una menor cantidad de ADN y no utilizan radioactividad o sistemas alternativos para revelar polimorfismo como RFLPs, los cuales requieren además de mayor infraestructura y experiencia molecular.
Aquellos marcadores moleculares basados en PCR permiten analizar una mayor cantidad de muestras en un menor lapso de tiempo, y presentan un mayor potencial de automatización analítica e informatización de la información generada.
Análisis de diversidad y estructura genética
La información referente a la diversidad genética disponible dentro del germoplasma permite definir estructuras poblacionales y la biología de las poblaciones colectadas, determinando así cómo encauzar la información genética disponible en el germoplasma hacia los materiales de interés agronómico (Lee, 1998; Tanksley y McCouch, 1997). De este modo se identifican aquellas poblaciones de mayor utilidad potencial para fitomejoramiento (Kresovich et al., 1995). Lo anterior puede lograrse a través del análisis del genoma de los individuos colectados de forma complementaria al análisis morfológico tradicional. Sin embargo, es necesario un cuidadoso análisis para definir el marcador molecular a utilizar en función del tipo de información necesaria, región del genoma a estudiar, resolución requerida, velocidad, infraestructura, expertise disponible y costos. Finalmente, es importante considerar la naturaleza genética de la información generada para su correcto análisis e interpretación.
En amaranto (Amaranthus spp.), mediante RAPDs se analizaron
60 poblaciones silvestres, determinándose una elevada variabilidad entre
las distintas accesiones, un importante grado de homogeneidad genética
dentro de ellas y un mayor polimorfismo entre las accesiones herbáceas
silvestres cultivadas (Chan y Sun, 1997). La elevada variabilidad
observada entre las formas herbáceas se relaciona con el escaso o nulo
mejoramiento genético efectuado sobre ellas y la mínima presión
de selección ejercida por el hombre durante su cultivo. En lenteja (L.
culinaris), el análisis RAPD de 54 accesiones permitió determinar
valores de diversidad genética al nivel subespecífico, definiendo
los grupos de mayor valor de conservación (Sharma et
al, 1995). En otra especie leguminosa como soya (G. max), mediante
AFLPs se determinaron relaciones genéticas y de diversidad entre soya
silvestre y cultivada, observándose una mayor diversidad molecular en
este último grupo (Maughan et al., 1996). En
especies del genero Beta, mediante RAPDs se determinó que B.
colloriflora es más variable que B. lomatogona y B. macrorhiza,
lo cual afecta su utilidad potencial para el mejoramiento de B. vulgaris
(Reamon-Buttner et al., 1996).
El uso de marcadores moleculares permite además clasificar germoplasma
en función de "pooles" genéticos. Un ejemplo al respecto
lo constituye el estudio de Johns et al (1997), el
cual mediante el análisis de información RAPD clasificó
y asignó razas locales chilenas de fréjol dentro de los "pools"
genéticos predefinidos para esta especie.
Análisis de relaciones filogenéticas de los materiales colectados
En numerosas ocasiones tanto el status taxonómico como las relaciones filogenéticas existentes entre los materiales colectados y sus parientes silvestres se desconocen o no se encuentran suficientemente establecidas. Dicha información permite predecir la utilidad potencial del germoplasma. Dentro de los sistemas analíticos existentes, el cladístico permite reconstruir historiales filogenéticos mediante el análisis de caracteres derivados compartidos (sinapomorfias) entre taxas.
Numerosos métodos de reconstrucción filogenética se basan en el principio de parsimonia, el cual permite detectar relaciones filogenéticas entre organismos basado en el menor número posible de eventos moleculares. Del mismo modo, existe un enfoque fenético para reconstruir filogenias, el cual clasifica organismos en base a su similitud (o distancia) general basada en numerosos caracteres. En papa cultivada (Solanum tuberosum), especie para la cual existen numerosas interrogantes taxonómicas dentro de la sección Petota, solamente mediante el uso de RAPDs recientemente se determinó que las especies S. astleyi y S. boliviense, morfológicamente muy similares y cuyos híbridos son fértiles, corresponden a taxas de un grado tal de similitud que su separación taxonómica se define al nivel de subespecies en lugar de especies (Spooner et al., 1997). Del mismo modo, mediante RAPDs se definió un origen monofilético para todas las especies de Amaranthus productoras de grano (Lanoue et al., 1996). Mediante marcadores moleculares se demostró además la múltiple e independiente evolución de la resistencia a la sequía en el género Amaranthus, lo cual posee importantes consecuencias prácticas para su fitomejoramiento (Lanoue et al., 1996). En arroz (O. sativa), mediante la aplicación de RAPDs y microsatélites se han desarrollado sistemas que permiten adscribir nuevas accesiones a grupos de cruzamiento predefinidos y determinar si ellas pertenecen a los grupos indica o javanica con mayor precisión y velocidad que las clasificaciones morfológicas (Ford-Lloyd et al., 1997; Virk et al., 1995). Un creciente número de estudios filogenéticos intraespecíficos se basan en AFLPs, como es el caso de germoplasma de vid, trigo, y Manihot spp. (Cervera et al., 1998; Heun et al., 1997; Roa et al., 1997).
Detección de accesiones duplicadas
La dificultad en diferenciar genotipos sólo en base a caracteres fenotípicos conlleva la conservación de numerosas accesiones duplicadas en los bancos de germoplasma.
En términos prácticos esto reduce la eficiencia de manejo del germoplasma e incrementa los costos de mantención, regeneración, caracterización y documentación. Una alternativa al respecto es la detección de duplicados mediante marcadores moleculares, determinándose así si dos accesiones bajo sospecha son efectivamente idénticas o en su defecto similares. En arroz, RAPDs han permitido establecer un sistema de identificación molecular de accesiones duplicadas en el IRRI (International Rice Research Institute).
Desarrollo de colecciones nucleares
Una colección nuclear ("core collection") corresponde a un número limitado de accesiones derivado de una colección existente de germoplasma, cuya función es representar el espectro genético y la diversidad genética existente en la colección original (Brown, 1995). Las colecciones nucleares se desarrollan como una forma más eficaz de mantener germoplasma adecuadamente caracterizado, comprenden aproximadamente un 10% de la colección original y se utilizan como fuente primaria de semilla en el fitomejoramiento de los cultivos. La riqueza alélica determinada mediante marcadores moleculares constituye un valioso complemento a la información fenotípica, contribuyendo al desarrollo de colecciones nucleares en especies como manzano (Malus pumila) cebada (Hordeum vulgare) y Brassica oleracea (Kresovich et al., 1995).
Conservación de recursos genéticos
Las estrategias de conservación de germoplasma dependen
principalmente de las características biológicas de éstos,
de los recursos humanos e infraestructura disponibles, número de accesiones
y ubicación geográfica (Rao y Riley, 1994).
Existen dos estrategias generales de conservación de germoplasma: in
situ (ecosistemas y habitáts naturales) y ex situ (bancos
de germoplasma de semilla, colecciones de campo, jardines botánicos y
colecciones in vitro)', estos métodos no son mutuamente excluyentes
sino más bien complementarios.
La mayoría de las semillas de cereales, leguminosas y oleaginosas pueden ser conservadas sin mayores dificultades con baja temperatura y baja humedad relativa en bancos de germoplasma, denominándose especies ortodoxas (Robert 1973). Sin embargo, existen otras especies denominadas recalcitrantes cuyas semillas presentan problemas de conservación, las cuales principalmente corresponden a plantas tropicales perennes cuyas semillas pierden su viabilidad en un corto período de tiempo al ser conservadas por métodos convencionales debido a sus elevados contenidos de humedad (Robert, 1979). En paralelo, existen especies que no producen semilla botánica verdadera como es el caso del ajo (A. sativum y otras como papa (S. tuberosum) y camote (I. batata) de propagación agámica. Los recursos genéticos de estas especies, además de aquellas especies forestales caracterizadas por su heterocigosidad debido a su naturaleza alógama, son generalmente conservados como colecciones de campo.
Este sistema de conservación ofrece ciertas ventajas relacionadas con la facilidad de acceso al germoplasma por parte de los fitomejoradores, sin embargo presenta varias desventajas como: elevados requerimientos de espacio y mano de obra, riesgo de infestación con plagas y enfermedades, daño provocado por catástrofes naturales y pérdida de la integridad genética de las accesiones (Whithers, 1995). Los sistemas de mantención de campo dificultan además el intercambio de germoplasma e incrementan los procedimientos cuarentenarios.
Conservación in vitro de recursos genéticos
Las dificultades derivadas de las colecciones de campo y la preservación de especies recalcitrantes han permitido desarrollar metodologías como la conservación in vitro de germoplasma, entendiéndose por cultivo in vitro al conjunto de técnicas mediante las cuales un explante, es decir, una parte de la planta (órgano, tejido, célula o protoplasto) se cultiva asépticamente en un medio nutritivo bajo condiciones de luz y temperatura controlada.
Entre las ventajas que presenta la mantención in vitro de germoplasma destacan: conservación de un gran número de plantas en espacios pequeños; mayor control sobre el estado fitosanitario de las plantas; reducción en los tiempos de multiplicación; facilidad de intercambio de material genético debido a su sanidad e incremento de la tasa de multiplicación de germoplasma valioso.
La conservación del germoplasma in vitro puede realizarse a corto-mediano plazo y a largo plazo mediante métodos criogénicos.
La alternativa a utilizar dependerá de la capacidad tecnológica, infraestructura disponible, objetivos de conservación y la naturaleza de las especies a conservar.
La conservación in vitro a corto-mediano plazo necesariamente requiere de subcultivos periódicos, actividad que generalmente dificulta su conservación, aún cuando se han desarrollado métodos que permiten retardar el crecimiento de los explantes y así prolongar el tiempo requerido entre los sucesivos subcultivos. En manzano, los explantes pueden ser almacenados in vitro durante un año al reducir la temperatura a 4°C, mientras que el cultivo in vitro de explantes de pera a 5°C permite su conservación por períodos superiores sin recurrir a subcultivos (Lundergan y Janick, 1979; Oka y Niino, 1997). Otras alternativas utilizadas para prolongar el período de conservación in vitro son el uso de inhibidores de crecimiento, reducción de tensión de oxígeno, defoliación de brotes y manipulación de la presión osmótica de los medios de cultivo (Bajaj, 1998).
Protocolos que permiten la efectiva conservación de germoplasma in vitro han sido desarrolladas para aproximadamente 37.600 accesiones en el mundo (Ashmore, 1997). Si bien el cultivo in vitro elimina los problemas asociados con la conservación en campo, su éxito es función de la eficiencia de la micropropagación y de la mantención de la integridad genética de las colecciones.
Ciertas propiedades del cultivo in vitro reducen la fidelidad de los sistemas de mantención in vitro de germoplasma. La variabilidad asociada al cultivo in vitro se denomina variación somaclonal, y puede ser parcialmente minimizada utilizando ápices meristemáticos, los cuales poseen células con un menor grado de diferenciación y genéticamente más estables (Niino, 1998).
En consecuencia, es importante la elección del explante y el monitoreo de las colecciones a objeto de detectar posibles variantes en relación al material original, el cual puede ser efectuado mediante marcadores moleculares (Godwin et al., 1997).
Criopreservación
El desarrollo de métodos de conservación de germoplasma a temperaturas criogénicas ha surgido como una nueva alternativa de conservación a largo plazo (colección base) para un gran número de especies. La Criopreservación se basa en la reducción y subsecuente detención de las funciones metabólicas y la división celular de los tejidos vegetales debido a la disminución de su temperatura al nivel del nitrógeno líquido (-196°C), manteniendo así la viabilidad de los materiales conservados por periodos indefinidos de tiempo. Una exitosa criopreservación depende de numerosos factores como tipo y condición fisiológica del explante, crioprotectores empleados, temperatura de mantención y estrategia de recuperación de los tejidos entre otras (Bajaj, 1995). Esta metodología ha sido utilizada en aproximadamente cien especies a nivel mundial, lo que permite suponer que en un futuro cercano se convertirá en la metodología de conservación más eficaz, segura y de bajo costo (Bajaj, 1995). Niino (1995), indica que los tejidos más apropiados para criopreservar son: granos de polen, semillas, yemas invernales, meristemas, embriones y callos.
Desarrollo de bancos de genes
El objetivo último de la conservación de recursos genéticos corresponde a la preservación de genes, esto es segmentos de ADN que codifican la síntesis de una proteína determinada y sus secuencias regulatorias o promotoras, lo cual se realiza de forma indirecta al conservar germoplasma. Mediante ADN recombinante es posible conservar directamente el material genético, es decir secuencias de ADN de interés ya sea como ADN genómico o como fragmentos discretos de ADN clonados y almacenados en E. coli en lugar de semillas, propágulos vegetativos o material in vitro (Adams y Adams, 1992). De este modo se pretende facilitar el uso directo de los genes y las secuencias regulatorias existentes en los recursos genéticos, acelerar la identificación y clonación de genes valiosos existentes en los recursos genéticos y a la vez de hacer más directa su transferencia a especies cultivadas mediante transgénesis.
Es importante señalar sin embargo que esta iniciativa
aún se encuentra a nivel experimental debido a los costos implicados.
Además, considerando que la amplia mayoría de los procesos y características
de interés para el mejoramiento vegetal se regulan por una gran cantidad
de genes actuando en forma compleja entre sí, su utilidad se limita a
genes de herencia simple, entre los cuales destacan genes de resistencia a enfermedades,
genes regulando enzimas involucradas del metabolismo secundario y proteínas
de importancia nutricional.
Desarrollo a nivel nacional
En Chile, investigaciones referentes a la mantención de colecciones in vitro de especies frutales y hortícolas se desarrollan tanto en INIA como en algunas Universidades, mientras que en relación a la caracterización de recursos genéticos, recientemente Hinrichsen et al. (1999) reportaron el análisis basado en RAPDs de una colección chilena de Fragaria chiloensis.
Nuestro país posee una adecuada riqueza vegetal, de gran valor potencial efitomejoramiento. En caso de no ser utilizada proseguirá la pérdida de materiales valiosos de gran potencial económico.
Ejemplo de lo anterior corresponden a las accesiones de Hordeum chilense utilizadas para generar el Tritordeum y el germoplasma nacional de lenteja, el cual constituye una de las escasas fuentes de semilla de calibre grande a nivel mundial. Es esencial desarrollar la etapa de caracterización de recursos genéticos, lo cual permitirá generar germoplasma con valor agregado, tanto científico como agronómico. La biotecnología juega un rol central dentro de esta transición, generando información molecular complementaria a la fenotípica y desarrollando nuevas metodologías de conservación de germoplasma. El área de los recursos genéticos nacionales requiere la integración de otras especies nacionales endémicas, las cuales no solamente pueden generar materia prima valiosa para fitomejoramiento sino además compuestos de utilidad farmacéutica y/o nutricional de enorme valor potencial tanto científico como comercial para la humanidad.
Investigación parcialmente financiada por Fundación Andes, Proyecto C13413/7
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