DISCRIMINACION DE CEPAS NATIVAS CHILENAS DEL HONGO
ENTOMOPATOGENO METARHIZIUM ANISOPLIAE Var ANISOPLIAE
CON MARCADORES MOLECULARES RAPD

Jaime Guerrero C. Facultad Cs. Agropecuarias y Forestales, La Frontera, Temuco,
Mario Mera K., Haroldo Salvo G., Centro Regional de Investigación Carillanca, INIA,Temuco
y Roberto Carrillo L. Facultad de Cs, Agrarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia.

Recepcion originales 17 de Mayo de 1999

ABSTRACT

Chilean strains of the enthomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var anisopliae discriminated by RAPD markers.

Key words: Entomopathogenic fungi, Metarhizium anisopliae, Random amplified polymorphic DNA (RAPD's).

Variability of six strains of entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var anisopliae isolated from Hylamorpha elegans, Phytoloema hermanni, Schizochellus breviventris and Brachysternus prasinus (Coleoptera: Scarabaeidae), Graphognathus leucoloma and Aeghorhinus sp (Coleoptera: Curculionidae) larvae found in soils covered by natural grass-land from three edaphoclimatic areas (the Andes foothills, the central Llano and the coastal dryland) from the 9th Region was studied. The strains were analyzed through random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique where 27 random 10-mer primers were found to be able to detect polymorphisms among the strains. The high degree of polymorphism observed suggested a high degree of genetic variation among the six evaluated strains and supported previous reports on M. anisopliae var anisopliae variability.
Complementing the molecular analysis, the strains were also found to differ in conidia morphology, germination and virulence. The conidia mean size of the six strains was 6.0 mm long and 2.2 mm wide, with range of 5.2-7.1 mm and 2.0-2.6 mm, respectively. The strains were also found to differ in colony color and growth pattern.

RESUMEN

Palabras Claves: Hongo entomopatogénico, metarzium anisopliae, Ramnizado ampiado DNA.(RAsD).

Se evaluó la diversidad de seis cepas del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae var anisopliae, obtenidas de larvas de Hylamorpha elegans, Phytoloema herrmanni, (Coleóptera: Scarabaeidae), Graphognathus leucoloma y Aeghorhinus sp (Coleóptera: Curculionidae) provenientes de suelos con pradera natural de tres áreas edafoclimáticas (pre-cordillera, Llano central y secano costero) de la IX Región. Se utilizó la técnica de amplificación de segmentos polimórficos de ADN, usando partidores de diseño aleatorio (Random Amplified Polymorphic DNA,(RAPD); encontrándose 27 partidores de diez bases capaces de detectar polimorfismos en las cepas evaluadas. El alto nivel de polimorfismo encontrado corroboró la gran variabilidad genética reportada para M. anisopliae var anisopliae.
Los datos moleculares indican que las seis cepas evaluadas fueron diferentes, confirmándose grupos y sub-grupos con diferente grado de similitud entre cepas provenientes de una misma especie insectil hospedante, pero independiente de la localización geográfica. Esta variabilidad quedó también demostrada por las diferencias que se observaron en otros parámetros evaluados en este estudio, como germinación y tamaño promedio de las conidias (6.0 mm de largo, con rango 5.2-7.1 mm) y 2.2 mm ancho, con rango 2.0-2.6 mm), virulencia, de las cepas y tipo de crecimiento y color de las colonias.

INTRODUCCION

El hongo Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorok. es un patógeno importante de insectos que se encuentra ampliamente distribuido en el mundo. Se han descrito dos variedades de la especie sobre la base del tamaño de las conidias; M. anisopliae var anisopliae, con conidias mas cortas y M. anisopliae var majus, con conidias mas largas. Las conidias son ovaladas a cilindricas, truncadas en ambos extremos, con un tamaño que varía entre 3,5 y 9 mm de largo, predominando 5-8 mm. Las colonias del hongo exhiben variadas formas y matices de verde (Tulloch, 1976 ; Poinar y Thomas, 1978). Domsch et al., 1993 indican que M. anisopliae tiene un alto grado de especialización que ocurre casi enteramente en dos familias de coleópteros, Elateridae y Curculionidae.
Sin embargo, se ha informado el parasitismo de M. anisopliae var anisopliae también sobre otras especies, especialmente de los órdenes ortóptera, hemiptera, coleóptera (Scarabaeidae y Curculionidae) y dermáptera (Zimmermann, 1993). También ha sido detectado en especies de coleópteros predatores como escarabeidos y estafilínidos (Steinmberg et al., 1995).

Debido al potencial uso de este hongo como agente biocontrolador, se han desarrollado numerosas y variadas investigaciones entre las que destacan aquellas relativas a la determinación de cepas (Yip et al., 1992).

Muchas especies de hongos entomopatógenos están compuestos de grupos de cepas genéticamente diversos, pero estas cepas no siempre pueden ser diferenciadas por criterios morfológicos. Diversas técnicas y metodologías han sido desarrolladas para caracterizar estos hongos y su relación con la patogenicidad. Hasta 1980, poca información sobre la variación en patogenicidad en relación con la genética de hongos entomopatógenos era conocida, pero con la utilización de técnicas bioquímicas y moleculares se ha expandido el conocimiento de la variabilidad intraespecíñca en hongos (Hajek y St. Leger, 1994). Se ha detectado diversidad genética de M. anisopliae, a través de técnicas como alozimas (Riba et al., 1985, Poprawski et al., 1988, St. Leger et al., 1992a), ELISA (Guy y Rath, 1990), y utilización diferencial de carbohidratos (Rath et al., 1995).

Michelmore y Humbert (1987) informan la utilización de marcadores moleculares como herramientas eficaces para estudiar variaciones genéticas entre poblaciones de hongos fitopatógenos. Dentro de éstos, la amplificación de segmentos de ADN usando partidores de diseño aleatorio(Random Amplified Polimorphic DNA, RAPD) está siendo utilizada preferentemente para determinar la variabilidad genética entre aislamientos.de hongos. Fegan et al., (1993), determinaron con RAPD un alto grado de diversidad genética en M. anisopliae var anisopliae, señalando que fue posible distinguir hasta sub-especies de este hongo y que esta gran diversidad genética entre los aislamientos, estaría relacionada con localización geográfica y grupos de patogenicidad.

La técnica conocida como RAPD se basa en la amplificación de segmentos aleatorios de ADN, a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde ha sido fundamental una polimerasa (Taq polimerasa) termoresisiente (Seiki et al., 1988). Se utilizan partidores de diez bases de diseño aleatorio. Los fragmentos generados pueden dar lugar a polimorfismos entre ADN de diferentes fuentes, que permiten distinguir genotipos y eventualmente estimar su distancia genética.
Esta técnica ofrece varias ventajas; la cantidad de ADN es reducida (10-25 ng), los partidores son pequeños, no se requiere de un conocimiento previo de la genética del organismo, y la ejecución es de poca complejidad y de menor costo que otras técnicas (Welsh y Mc Clelland, 1990 ; Williams et al, 1990).

En Chile, la información disponible en relación con hongos entomopatógenos es escasa y recientemente se han estado desarrollando diversas investigaciones en torno al tema. Este estudio tuvo como objetivo determinar la variabilidad genética entre cepas de M. anisopliae var anisopliae aisladas de larvas de especies de escarabeidos y curculiónidos provenientes de diferentes áreas edafoclimáticas de la IX Región de Chile.

MATERIALES Y METODOS

El origen de las cepas, localidades y fecha de muestreo se incluyen en el cuadro 1. En estos lugares se realizaron muestreos sistemáticos de suelo cuya cubierta vegetal estaba constituida por pradera natural. Las larvas colectadas se mantuvieron en envases de plástico con suelo del lugar muestreado, a 18°C y 90% HR, debidamente identificadas e indicando fecha de recolección y localidad.

Las larvas sanas colectadas se dejaron en envases con suelo proveniente del mismo lugar de muestreo. Periódicamente fueron examinadas y aquellas que presentaban aspecto de estar enfermas se colocaron individualmente en frascos de vidrio de 100x50 mm, en oscuridad, a aproximadamente 18°C, para posteriormente aislar en medio de cultivo el o los hongos asociados. Las larvas con síntomas y signos de hongos entomopatógenos se mantuvieron individualmente en frascos y placas Petri en oscuridad a aproximadamente 18°C, para su esporulación y posterior aislamiento en medio de cultivo. Los ejemplares fueron debidamente individualizados, consignando fecha de colecta, localidad, tipo de suelo, especie de insecto hospedante y características de la larva enferma (aspecto, color, presencia de micelio). Las cepas se aislaron en medio de cultivo, utilizando conidias obtenidas directamente del micelio esporulado que crecía en las larvas muertas y mediante una suspensión de conidias removidas por inmersión de las larvas en agua destilada estéril a la que se agregó el adyuvante humectante (Citowet, 0.05%) a fin de bajar la tensión superficial; alícuotas de la suspensión (0.5 ml) se dispensaron sobre la superficie del medio selectivo. La purificación de las colonias se efectuó mediante repiques hasta obtener el cultivo puro.

Los aislamientos en placas de Petri, se mantuvieron por 15 días en cámara (incubadora) de cultivo a 25ºC ± 1ºC. Posteriormente fueron repicados a tubos de ensayos y mantenidos a 4°C. Como medio de cultivo se usó agar (1,5%), dextrosa (l%), extracto de malta (l%) y peptona (l%) por cada 1000 ml. Este medio es informado en la literatura como adecuado para el aislamiento de M. anisopliae (Barnes et al., (1975), Garza, 1994). La preparación del medio de cultivo se realizó según la metodología indicada por French y Herbert (1980). La esterilización del medio de cultivo se realizó en autoclave por 20 min a una presión de 15 libras por pulgada cuadrada. Para la obtención del micelio del hongo se procedió según la metodología utilizada por Pfeifer y Khechatourios (1993) y Jenkins y Thomas (1996). El medio líquido consistió en dextrosa (4%) y peptona (1 %) en 1000 cc agua destilada estéril. Se prepararon frascos Erlenmeyer de 250 cc de capacidad con 100 cc del medio líquido, fueron autoclavados y posteriormente se agregó con aguja hipodérmica esterilizada 1 m de conidias (aproximadamente 1x10⁶ conidias/ml) cuantificada en cámara de Neubahuer. Los cultivos fueron sometidos a agitación en un agitador orbital a 150 rpm para mantener la oxigenación del sustrato, durante 4-5 días, en condiciones de laboratorio (18 ± 2ºC). Posteriormente, el micelio fue lavado en agua estéril y separado a través de gasa fina. Para el secado del micelio se utilizó una bomba de vacío de 5 HP. Una vez seco, el micelio fue depositado en tubos Eppendorf y mantenido durante 24 horas a 0°C. A partir de este micelio se procedió con los análisis RAPD en el Centro Regional de Investigación Carillanca.

Se extrajo ADN genómico de 0,1 g de micelio joven en 0,5 ml de una solución tampón basada en el detergente catiónico CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio), con un rendimiento de 1 mg / g de tejido. El buffer de extracción de ADN correspondió a 2X CTAB : 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4 M Na Cl, 20 mM EDTA (ácido etilendiamino-tetra-acético), 2% CTAB, 3,8 g/L bisulfito de sodio e hidróxido de sodio y 0.5% mercaptoetánol. Se agregó dos gotas de una mezcla de cloroformo (para evitar la precipitación de proteínas hidrofóbicas) y alcohol isoamílico (para disminuir la formación de interfases durante la extracción) en proporción 24:1. Se sometió las muestras a 65°C baño María por 30 min, y después de enfriar se agregó nuevamente cloroformo y alcohol isoamílico 24:1 hasta completar el tubo. Se agitó vigorosamente por 5 min y luego se centrifugó 5 min a 14.000 rpm y se extrajo el sobrenadante. Se agregó a esta fase etanol 95% para precipitar el ADN. Después de secar a temperatura ambiente, se agregó una solución de etanol 75% y acetato de sodio 0,2 M, para lavar el pellet de ADN y se dejó secar. Se agregó Tris-EDTA 10:1 a un tubo con el pellet, para disolverlo. Luego se agregó RNAsa y se incubó a 37°C por 1 hora. Se guardó a -20°C cuando no se utilizó inmediatamente.

Para generar marcadores moleculares se usó la técnica RAPD (Ramdom Amplified Polymorphic DNA), descrita por Welsh y McClelland (1990) y Williams et al., (1990).

Se utilizaron 27 partidores de diez bases (Operon Technologies Inc., Alameda, California), cuyas secuencias se indican en el cuadro 2. La enzima Taq polimerasa se obtuvo de Promega, Madison, Wisconsin. Las amplificaciones PCR fueron realizadas en un termociclador Perkin-Elmer de 48 pocillos. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (Ultrapure de Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland). Los geles fueron fotografiados sobre un transiluminador UV Cole Parmer 97500.

Como estándar de peso molecular se utilizó un estándar de peso molecular de 1 kb DNA (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland), con fragmentos de 0,4 a 12,2 Kb.

Para la reacción PCR se preparó una solución tampón basada en Tris pH 8.5, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, ficoll, azul de bromofenol y xileno glicol. Se agregó agua, nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), partidores y finalmente Taq polimerasa. A 4 ml de ADN templado diluido se adicionaron 11ml de la solución preparada, para un volumen final de 15 ml por reacción. La mezcla de reacción, en un tubo Eppendorf de 0.6 ml, se cubrió con aceite mineral para evitar la deshidratación. También se agregó aceite mineral al pocillo del termociclador para mejorar el intercambio de temperatura. Se programó el termociclador para la secuencia térmica: 2 min a 94°C (desnaturalización); 40 ciclos de 25 seg a 94°C, 60 seg a 35°C y 90 seg a 72°C (amplificación); 4 min a 72°C (extensión final); y 4°C indefinidamente (mantención). Una vez finalizada la reacción PCR, los fragmentos de ADN fueron separados por electroforesis horizontal en geles de agarosa 1.4%, con adición de bromuro de etidio para la posterior visualización de las bandas con luz ultravioleta, en un transiluminador. La solución tampón de carga, para la electroforesis, estuvo basada en Tris base y EDTA pH 8, con ácido acético para regular el pH. Para someter el gel al campo eléctrico, se reguló la fuente de poder a 100 volt, 100 mA, por 2,5 horas. Los geles fueron fotografiados en el transiluminador, en una cámara oscura, con película blanco y negro, inmediatamente después de finalizada la separación de los fragmentos.

La presencia o ausencia de fragmentos de ADN polimórficos entre las diferentes entradas se denotaron como 1 ó 0 respectivamente, y como 99 los datos no consignados. Los datos se analizaron con el software NTSYS-pc (Numeral Taxonomy and Multivariate Analysis System) versión 1.8 (Rohlf, 1993). Primero se calcularon coeficientes de similitud cualitativa con el programa SIMQUAL, utilizando la comparación "simple matching" y luego la matriz de coeficientes de similitud sirvió para crear un dendograma con el programa SAHN-clustering usando el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method winth Arithmetic Mean), y un gráfico tridimensional de diversidad en base a un ajuste a escala multidimensional (multidimensional scaling, MDS).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran que hay una variación genética natural entre las cepas de M. Anisopliae; Estos antecedentes se derivan de las observaciones realizadas que determinaron fluctuaciones de las bandas polimórficas entre 300 y 5000 pares de bases, para lograr estos resultados se utilizaron 27 partidores (Cuadro 2) los que entregaron bandas polimórficas para al menos un par de cepas. Este resultado sugiere que las seis cepas evaluadas fueron todas diferentes (78, 89, 321, 101, 110 y 120), siendo las cepas 110 y 78 las de mayor similitud, pero no idénticas; en tanto que las cepas 78 y 120 fueron las de menor similitud genética.(Figura 1). Este resultado es un indicador de la ocurrencia natural de variación genética de M. anisopliae var anisopliae y posiblemente de diferencias en virulencia observadas entre las cepas utilizadas en este estudio.

De acuerdo con la información presentada en el dendrograma (figura2a). las cepas evaluadas se han reunido en dos grupos principales. El primero lo conforman las cepas 110 y 78, aisladas de G. leucoloma y P. hermanni, respectivamente, con un índice de similitud de 0,794. El segundo grupo principal lo conformó el resto de las cepas, con diversos grados de similitud entre ellas.

En este segundo grupo, la cepa 321 (H. elegans) formó un subgrupo separado, con una similitud entre estas cepas que fluctuó entre 0,412 y 0,512. Las cepas 89 (H. elegans) y 101 (Aeghorhinus sp), aparecen formando un subgrupo con un coeficiente de similitud de 0,719. La Figura 2b representa esta misma información en un graneo de escala multidimensional (MDS), donde se observa la conformación de dos grupos principales : las cepas 110 y 78 y las cepas 101, 89 y 120. La cepa 321 aparece en una posición intermedia entre estos dos grupos. Ambas representaciones son coincidentes.

La variabilidad observada entre las dos cepas aisladas de H. elegans (89 y 321) y las dos cepas que atacan a G. leucoloma (110 y 120) sugieren que la variabilidad entre cepas que atacan una misma especie de insecto, pero provenientes de diferentes lugares geográficos, puede llegar a ser mayor que la variabilidad entre cepas de hospedantes diferentes.

Los resultados concuerdan con lo señalado por diversos autores, antecedentes que respaldan la información obtenida . Al respecto; Fegan et al. (1993) han señalado que el alto grado de diversidad genética de M. anisopliae var anisopliae determinado por análisis RAPD estaría relacionado con la localización geográfica y grupos de patogenicidad. Hajek y St. Leger (1994), señalan que el aislamiento geográfico y la limitada capacidad de dispersión de las esporas, especialmente para M. anisopliae, pueden ser importantes en la evolución de los diferentes genotipos. Sin embargo, consideran que la variabilidad intraespecffica de los hongos ha sido además caracterizada por diferencias en patogenicidad, y que los casos documentados de variabilidad en la susceptibilidad del hospedero al patógeno demuestran la ocurrencia potencial de coevolución entre el insecto hospedero y el hongo patógeno.

Poprawski et al. (1988), sostienen que la evolución de los hongos entomopatógenos se incrementa por el polimorfismo de las poblaciones geográficas, como consecuencia de variaciones generacionales por mutación, hibridación, parasexualidad. Además, debido a la presión de selección que ejercen factores bióticos y abióticos, se afecta su capacidad patogénica. Estudios acerca de la variabilidad genética entre diferentes cepas de M. anisopliae, han encontraron que cepas con un mismo nivel electroforético presentan cepas virulentas y no virulentas (Riba et al., 1985).

Hajek y St. Leger (1994), analizaron diversos aspectos que explicarían la alta variabilidad genética intraespecífica que se observa entre aislados de Metarhizium; en este contexto sostienen que muchas de las cepas de Metarhizium están incluidas en unas pocas clases de genotipos geográficamente distribuidos y que la persistencia de estos genotipos en el tiempo y espacio sugiere que en muchas situaciones estos hongos han tenido una estructura poblacional clonal; indican también que muchas de estas clases genotípicas contienen sólo cepas aisladas desde coleópteros y ellos presumiblemente evolucionaron a través de una especialización patogénica.

Riba et al. (1985), consideran que M. anisopliae var anisopliae es un grupo muy heterogéneo, con sub-poblaciones genéticas que pueden ser separadas usando criterios geográficos y de hospedante. Usando el criterio del hospedante, han logrado separar grupos de cepas de M. anisopliae con comportamiento diferente y demostrar que las cepas de curculiónidos forman un grupo discreto. Acotan, citando a St. Leger et al. (1992) que M. aniopliae var majus está restringido a especies de Orycetes (Coleoptera: Scarabaeidae).

Figura 1: Bandas generadas por RAPD's entre seis cepas del hongo Metarhizium anisopliae var anisopliae, obtenidas por tres partidores diferentes. A la derecha se indica el tamaño (en pb) de los fragmentos del estándar (DNA Ladder i kb Gibco Bel). Carriles E=estándar; Carril CN=control negativo con todos los ingredientes de la reacción, menos el ADN; carriles con partidores: 1-6=AN-14, 7-12=AA-01, 13-18=ba-03. Carriles1,7,13=cepa 110; carriles 5, 11, 17=cepa 101; carriles 6, 12, 18=cepa 321. Figure 1: Bands generated by RAPD's among six strains of Metarhizium anisopliae var anisopliae, fungus obtained with three different starters. On the right are shown the size (in pb) of the fragments of the standard (DNA ladder 1 kb Gibco Bel) E track=standard; CN Tracks=negative control with all the reaction ingredients, excepting ADN; tracks 3, 9, 15=cepa 12j0; tracks 3, 9, 15=strain 89; tracks 5, 11, 17=strain 101, tracks 6, 12, 18=strain 321.

Figura 2: Dendograma (A) y Gráfico de escala multidimensional (B) de disimilitud de seis cepas de Metarhizium anisopliae basado en datos del análisis RAPD's. Figure 2: Dendogram and Multidimensional scale graph of dissimilitude of six Metarhizium anisopliae strains based on data of RAPD's markers analysis.

CONCLUSIONES

Se constató mediante el análisis con marcadores moleculares, RAPD que las cepas evaluadas presentaban alto nivel de polimorfismo, lo que sugiere un alto grado de variabilidad molecular intraespecífica entre las seis cepas evaluadas de M. anisopliae var anisopliae. Esta variabilidad entre cepas quedó también demostrada por las diferencias observadas en el tamaño promedio de las conidias, que varió entre 5,2 a 7,1 mm y 2,0 y 2,6 mm, la forma predominante de las conidias, la germinación y virulencia, y el tipo de crecimiento y color de las colonias.

Basado en el tamaño de conidias, umbral térmico, virulencia y conformación genética, se determinó que las cepas de M. anisopliae var anisopliae evaluadas difirieron entre si, confirmándose la hipótesis planteada. No obstante, fue posible establecer grupos de similitud en virulencia y constitución genética, conformados predominantemente por cepas provenientes de una misma especie insectil hospedera.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto 9603 Dirección de Investigación, Universidad de la Frontera

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