VALIDACION DEL METODO BUTIROMETRICO DE GERBER
POR COMPARACION CON EL METODO DE REFERENCIA DE RÖSE
GOTTLIEB PARA LA DETERMINACION DE MATERIA GRASA EN LECHE.

Manuel Pinto C., Erwin Carrasco R., Bernardo Fraser L., Carolina Barriga I.
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos,
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile.
Casilla 567. Valdivia. Chile.
mpinto@uach.cl

Recepcion originales 12 de Enero del 2000

ABSTRACT

Validity of Gerber butyrometric method compared with Röse Gottlieb method for milk fat determination.

Key words: Validity Gerber, Röse Gottlieb, milk fat.

A validity methodology of the Gerber method through a comparison study to the Rose Gottlieb reference method is presented.
The analysis of Gerber (G) and Röse Gottlieb (RG), in a total of 100 raw milk samples, with a range of 1.80 and 5.50% (m/m) of fat, were carried out according to oificial FIL-IDF 152 A: 1997 and FIL-IDF ID: 1996 rules respectively. The regression equation found (RG = 0.9998 G + 0.0278) presented a gradient not significantly different to 1.000 (0.9846 < b < 1.0149) and an intercept not significantly differing from 0 (-0.0274 < a < 0.0830). The residual standard deviation was Sy,x = 0.0853 and the accuracy of the method was therefore + 0.17g/100 g (+ 1.987 Sy,x) at present conditions. Gerber method exactuess, expressed as repeatability, presented a repeatability standard deviation of Sr= 0.0308 and a repeatability of r = 0.087 g/100 g, according to FIL-IDF 128: 1985; thus allowing to estimate both the method reproducibility (R = 2 r) and confídence Ínterval, including the mean precisión and accuracy (random error and systematic error). On the other hand, the analysis of media values indicated the acceptance of the nule hypotesis, t_0.05 = -0.1645 (P = 0.86) and a correlation coefficient of r = 0.9972.
It is concluded that Gerber Method for milk, carried out according to FIL-IDF 152A: 1997 rule, with a milk volume of 10.77 ml presented acceptable validity parameters, in lineal, precision and accuracy terms.

RESUMEN

Palabras Claves: Validación Gerber, Röse Gottlieb, grasa láctea.

Se presenta una metodología de validación del método de Gerber mediante un estudio comparativo frente al método de referencia de Röse-Gottlieb.
Los análisis de Gerber (G) y Röse-Gottlieb (RG) en un total de 100 muestras de leche cruda, con un rango entre 1,80 y 5,50%(m/m) de materia grasa, se realizaron según las normas oficiales FIL-IDF 152A: 1997 y FIL-IDF ID: 1996, respectivamente la ecuación de regresión obtenida (RG= 0,9998G + 0,0278), presentó una pendiente que no difiere significativamente de 1,000 (0,9846 < b < 1,0149) y un intercepto que no difiere significativamente de 0 (-0,0274 < a < 0,0830). La desviación estándar residual fue S =0,0853 y la exactitud del método fue, por lo tanto, de±0, 17g/100g. (±1,987 S_y,x) en las presentes condiciones. La precisión del método de Gerber, expresada como repetibilidad, presentó una desviación estándar de repetibilidad Sr=0,0308 y una repetibilidad de r=0,087g/ l00g, según FIL-IDF 128:1985. Esto nos permite estimar la reproducibilidad del método (R=2r) y el intervalo de confianza, que incluye el error de precisión y el error de exactitud de la media (error de azar y error sistemático). Por otra parte, el análisis de los valores medios indicó la aceptación de la hipótesis nula, t_0.05= -0,1645 (P=0,86) y un coeficiente de correlación r =0,9972.
Se concluye que el método de Gerber, aplicado a leche, realizado en conformidad con la norma FIL-IDF 152 A: 1997, con un volumen de leche de 10,77ml, presentó parámetros de validación aceptables, en términos de linealidad, precisión y exactitud.

INTRODUCCION

El método butirométrico de Gerber, que fuera propuesto por el Dr. Nicolais Gerber en 1895, es un método empírico que permite la determinación del contenido de materia grasa en leche, en gramos de grasa por 100 gramos de leche o 100 ml de leche dependiendo de la capacidad de la pipeta usada, y tiene como referencia el método gravimetrico de Röse Gottlieb (Fleischmann, 1945).

La Organización Internacional de Estandarización, en su norma ISO N°2446: 1976, sobre la determinación de materia grasa en leche por el método de Gerber (método de rutina), recomienda realizar comparaciones periódicas de éste método con el método gravimétrico de referencia de Röse Gottlieb, para asegurar su validación. Lo anterior adquiere relevancia especial en aquellos casos en que el método de Gerber se utiliza para calibrar equipos instrumentales para la determinación de materia grasa en leche, tales como Milko-Tester MKIII (Buxade y Bergmann, 1972) o Milko-Scan (Kernof et al., 1982, ABD et al., 1986).

Estudios comparativos tendientes a la validación del método de Gerber, con respecto al método de referencia de Röse Gottlieb, se presentan en Holanda (Radema y Mulder, 1951), Alemania (Schwarz, 1954), Inglaterra (Crocker et al., 1955), Africa del Sur (Laboschagne y Vogt, 1960), y Yugoslavia (Slanovec et al., 1971), entre otros. Se proponen mecanismos de ajustes para deducir el volumen óptimo de leche a utilizar en la determinación de materia grasa por el método de Gerber (Brouwer, 1965).

En un trabajo anterior de Pinto et al., en 1973, quedó demostrado que los valores de materia grasa expresados en % (m/m), encontrados por el método de Gerber utilizando un volumen de leche de 11,00 ml, da valores superiores con respecto al método de referencia de Röse Gottlieb, encontrándose diferencias significativas, para valores de materia grasa promedio en el país. Fue necesario realizar un proceso de validación del método y se encontró que el volumen óptimo de leche a utilizar en el método de Gerber es de 10,77 ml ( volumen vertido en agua destilada a 20°C), con el cual se logra una perfecta concordancia con los valores obtenidos por el método de referencia ( Pinto et al., 1976). El estudio mencionado contribuyó en la elaboración de la Norma Chilena Oficial NCh N°1016/Of.79. Determinación del contenido de materia grasa : Método de Gerber (Instituto Nacional de Normalización, 1979).

Dada la recomendación de la norma ISO N°2446 mencionada anteriormente y considerando que el método de referencia FIL-IDF 1 A: 1969 ha incorporado cambios importantes, en el tiempo transcurrido hasta su versión actual, FIL-DF ID: 1996, es altamente recomendable revisar el método de Gerber.

El presente trabajo tiene por objetivo realizar los estudios de validación del método de Gerber, en términos de linealidad, precisión y exactitud con respecto al método de referencia de Röse Gottlieb.

MATERIALES Y METODOS

Todos los reactivos utilizados son de grado analítico. Las metodologías de análisis son las estipuladas en las normas estándares para Gerber y Röse Gottlieb, FIL-IDF 152A: 1997 y FIL- IDF ID: 1996 respectivamente.

La pipeta para leche (10,77 ± 0,02) y los butirómetros (O- 6%), fueron calibrados previamente, según las normas internacionales correspondientes ISO N°2446: 1976 y FIL- IDF 105: 1981. Se realizó previamente un estudio acerca de la robustez del método de Gerber, centrando la atención en el material volumétrico utilizado, especialmente pipetas para leche y butirómetros (Ríos, 1999).

Se prepararon 100 muestras de leche con un rango de concentración en materia grasa de 1,80 a 5,50 % (m/m), a partir de adiciones de crema a leche descremada (ISO N°2446: 1976), con incrementos de 0,5 %, rango de contenido graso en leche de productores de las regiones VIII, IX, y X (Pinto et al., 1998). Las muestras se preservaron con dicromato de potasio (1mg/ml de leche) y fueron mantenidas en refrigeración hasta el inicio de los análisis; luego fueron analizadas en triplicado por el método de Gerber y en duplicado por el método de Röse Gottlieb.

El estudio de validación del método de Gerber, con respecto al método de referencia de Röse Gottlieb, incluye los análisis estadísticos relacionados con la precisión (repetibilidad - error de azar; reproducibilidad), exactitud de la media -error sistemático; ecuación de regresión lineal - pendiente, intercepto. La metodología usada para estas determinaciones son las recomendadas por la Organización Internacional de Estandarización (International Standard ISO N°5725:1986) y la Federación Internacional de Lechería (FIL-IDF N°128: 1985)

RESULTADOS Y DISCUSION

Los valores promedio y los parámetros estadísticos básicos de comparación entre los métodos de Gerber y Röse Gottlieb se presentan en el Cuadro 1. Cabe destacar que a nivel de valores promedios para el total de muestras analizadas (n=100), no se encontró diferencia significativa (P<0,05), situación esperable dado que dicho valor Gerber (3,5%m/m) está dentro del intervalo 3,26-4,25 %, que no presenta porcentaje de corrección con respecto al método de referencia, según lo establecido en la Norma Chilena Oficial NCh N° 1016/1 (Instituto Nacional de Normalización, 1998). Otro valor que cabe destacar es el coeficiente de variación o desviación estándar relativa (DER), con los valores de 0,6 y 0,21 para Gerber y Röse Gottlieb, respectivamente. Al respecto, se debe señalar que el método de referencia presenta un valor de repetibilidad del 0,02% en cambio en el método de rutina se acepta un valor de 0,087%.

La Federación Internacional de Lechería (FIL-IDF 128: 1985) establece la precisión de un resultado en términos de repetibilidad y reproducibilidad, los cuales define de la siguiente manera:

Repetibilidad (r). Es el grado de acercamiento entre resultados de análisis independientes, obtenidos por un mismo método, sobre una misma muestra, en un mismo laboratorio y analista, usando el mismo equipo y dentro de un corto intervalo de tiempo. En terminos estadísticos se define como r = (2 2 )S_r = 2,8S_r.

Reproducibilidad. Es el grado de acercamiento entre resultados de análisis, obtenidos por un mismo método, sobre la misma muestra en diferentes laboratorios y analistas, usando diferentes equipos. En términos estadísticos se define como R = 2,8S_R = 2,8(2S_r).

La precisión del método de Gerber, expresada como repetibilidad, presentó una desviación estándar S_r = 0,0308 y una repetibilidad r = 0,087 g/100 g de leche, lo cual permite estimar la reproducibilidad del método (R = 2r), resultando igual a 0,174 g/ l00 g de leche.

Luego un intervalo de confianza de ± 0,202, para la diferencia entre muestras individuales, indica que si la diferencia entre los duplicados de valores dados por el método de Röse Gottlieb y el método de Gerber están dentro del intervalo mencionado se puede suponer, con un 95% de nivel de confianza, que el método de Gerber se encuentra correctamente calibrado y que la composición de las muestras son normales. En la determinación del intervalo de confianza intervienen variables como la varianza de repetibilidad, varianza de reproducibilidad y desviación estándar de los residuos, variables relacionadas estrechamente con la exactitud del método.(PINTO et al., 1998; FIL-IDF 128:1985).

La frecuencia de las diferencias existentes entre los valores promedios, según el método de Gerber, con respecto al método de Röse Gottlieb se presenta en el Cuadro 2. Se puede observar que la mayor frecuencia se presentó en el intervalo -0,010 a 0,065 con un 40% de los valores dentro de dichos límites. Por otro lado, es posible observar en la Figura 1, que la máxima diferencia entre ambos métodos, para muestras individuales, es similar al intervalo de confianza calculado (± 0,202), con un 95% de confianza.

Figura 1: Histograma de frecuencia de las diferencias entre los métodos de Gerber y Röse Gottlieb en la determinación de materia grasa en leche de vaca. Figure 1: Frequency chart of difference between Gerber and Röse Gottlieb methods in the determination of milk fat content.

Una alternativa confiable para estudiar el comportamiento entre los métodos de Gerber y Röse Gottlieb es la regresión lineal como modelo matemático. Alternativa utilizada por varios autores, entre los cuales cabe destacar a Radema y Mulder (1948), en Holanda (RG = 0,9615 G + 0,07), recomendando una pipeta de 10,77 ml para Gerber; Crocker et al., (1955) en Inglaterra (RG = 0,9652 G + 0,097 ), sugiriendo un volumen de pipeta de 10,94 ml en remplazo de la anterior de 11,04. En el presente trabajo se dedujo la siguiente ecuación de regresión lineal RG = 0,9998 G + 0,0278, uülizando una pipeta para Gerber de 10,77 ml, en conformidad con la Norma Chilena Oficial NCh N°1016/98 (Instituto Nacional de Normalización, 1998).

Un estudio de las cualidades de la ecuación de regresión lineal obtenida se presenta en el Cuadro 3. Cuando un método de rutina (Gerber) está debidamente ajustado al método de referencia (Röse Gottlieb), la desviación estándar de las diferencias es aproximadamente igual a la desviación estándar residual (S²x-y = S²y,x)(Grappin, 1984). En el caso presente la desviación estándar de las diferencias encontradas fue Sx-y = 0,0852, muy similar a la desviación estándar residual Sy,x = 0,0853 (exactitud). Por otro lado el alto grado de asociación entre los métodos está reflejado por el coeficiente de correlación obtenido (r = 0,9972).

La Figura 2 explica en forma gráfica el comportamiento lineal de los resultados de Gerber y de referencia. Se observa en el comportamiento de los residuales, en relación a la línea de regresión, una dispersión homogénea incluso en los valores extremos de la curva (exactitud).

La ecuación de regresión obtenida (RG = 0,9998 G + 0,0278) fue analizada según la norma estándar FIL-IDF 128: 1985. Se encontró que su pendiente no difiere significativamente de 1,000 ( 0,9846 £ b £ 1,0149) y el intercepto no difiere significativamente de cero ( 0,0274 £ a £ 0,0830). Conocida la desviación estándar residual (S_y,x = 0,0853), la exactitud del método es, por tanto, de ± 0,17 g/l00g (± 1,987 x S_y,x) en las presentes condiciones. Por otro lado, la precisión del método presentó una desviación estándar de repetibilidad de S_r = 0,0308 y una repetibilidad de r = 0,087 g/100 g. Esto nos permite estimar la reproducibilidad del método (R = 2_r), R = 0,174 g/ l00g.

Se concluye que el método de Gerber, aplicado a leche, realizado en conformidad con la norma FIL-IDF 152A: 1997 la cual se corresponde con la Norma Chilena Oficial NCh N°1016/Of 98), realizado con la pipeta para leche de 10,77 ± 0,02 ml (volumen vertido en agua destilada a 20ºC), presenta parámetros de validación aceptables, en términos de linealidad, precisión y exactitud.

Figura 2: Regresión lineal del método de referencia (Röse Gottlieb) v/s método de Gerber en la determinación de materia grasa en leche de vaca. Figure 2: Reference method of lineal regresion (Röse Gottlieb) v/s Gerber method in determination of milk fat.

AGRADECIMIENTOS

Financiado por la Universidad Austral de Chile, proyecto DID-UACH N° 199940 y FONDECYT Nº 1961046

BIBLIOGRAFIA

ABD, E., K. AL. y E. EL. 1986. (Evaluation of the Milkoskan 104 A/ B for Determination of Milk Fat, Protein and Lactose in Milk of Some Mammals). Food Chemistry 19(3):213 -224. Original no consultado, FSTA Retrospective Abastracts 1987 - 1989.

BROUWER,TH., 1965. On theCalculation of Correction Tables for the Butyrometric Determination of Fat in Milk. J. of Dairy Res. 22(3): 336 - 339.

BUXADE, C. y J. BERGMAN. 1972. Large Escale Application of the Milko-Tester Automatic and Milko-Tester III for Photometric Determination of Milk Fat Content. Anales del Instituto Nacional de Producciones Agrarias, Producción Animal. N° 3: 15-25.

CROCKER, W., D. JENKINS., A. PROVAN., F. MACDONALD., S. ROWLAND. y J. WHITE. 1955. A Comparison of the Gerber and Röse-Gottlieb Methods for the Determination of Fat in Milk. J. of Dairy Res 22(3): 336 - 339.

FLEISCHMANN, W. 1945. Tratado de Lechería. Ed. Gustavo Gili S.A. Barcelona, España. 740pp.

GRAPPIN, R. 1984. Assessment and Optimization of Indirect Instrumental Methods for Testing Mayor Constituents in Milk and Dairy Product. Challenges to Contemperary Dairy Analytical Techniques. University of Reading. England. Special Publication N°49:77-90.

INSTITUTO NACIONAL DE NORMALIZACIÓN. 1979. Leche. Determinación del Contenido de Materia Grasa: Método de Gerber. Parte I: Procedimiento, INN NCH N° 1016/1 of. 79: 13 pp.

____. 1998. Leche. Determinación del Contenido de Materia Grasa: Método de Gerber. Parte I: Procedimiento, INN NCH N°1016/I of.98 : 13 pp.

INTERNATIONALDAIRY FEDERATION. 1969.Milk. Determinetion of Fat Content. Gravimetric Method (Reference Method), FIL - IDF Standard 1A: 5pp.

____. 1981. Milk and Milk Products. Determination of Fat Content: Gerber Butyrometers, FIL - IDF Standard 105: 8 pp.

____. 1985. Milk. Definition andEvaluation of the Overall Accuracy of Indirect Methods of Milk Analysis - Application to Calibraíion Procedure and Quality Control in Dairy Laboratory, FIL - IDF Standard 128: l0 pp.

____. 1996.Milk. Determinetion of Fat Content. Gravimetric Method (Reference Method), FIL - IDF Standard ID: 7 pp.

____. 1997. Milk and Milk Products. Determination of Fal Content : General Guidance of the Use of Butyrometric Methods, FIL - IDF Standard 152A : 5 pp.

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZARON. 1976. Milk. Determination of Fat Content (Routine Method). International Standards ISO 2446: 7pp.

____. 1986. Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests. International Standards ISO N°5725. 52 pp.

KERNOF, M., L KOOPS., R. NEETER., KJ. SLANGEN.,H. HEMERT.O. KOOYMAN, y H. WOOLDRIK. 1982. (Routine Testing of Farm Tank Milk with the Milko-Scan 203. I. Calibration Procedure and Small-Scale Experiments). Netherlands Milk and Dairy Journal 36(2): 115-133. Original no consultado, FSTA Retrospective Abstracts 1969 -1989.

LABOSCHAGNE, J., y K. VOGT. 1960. The accuracy of the Gerber test for the determination of fat in milk. Afr. Journal Agric. Science. 3(1): 83-89.

PINTO, M., P. BIDEGAIN. y L. JARAMILLO. 1973. Estudio Comparativo de los Métodos de Gerber y Röse-Gottlieb en la Determinación de la Materia Grasa en Leche. Arch. Med. Vet. Universidad Austral de Chile 5(2): 77 - 83.

PINTO, M., M. ROJAS., L. ISRAEL, y H. MOLINA. 1976. Exactitud del Método de Gerber para la Determinación de Materia Grasa en Leche. Arch. Med. Vet. Universidad Austral de Chile 8(2): 83 - 89.

PINTO, M.; E. CARRASCO., B. FRASER., A. LETELIER y W. DÖRNER. 1998. Composición Química de la Leche Cruda y sus Variaciones a Nivel de Silos en Plantas Lecheras de la VIII, IX y X Regiones de Chile. Parte 1: Macrocomponentes. Agrosur pp. 97-109.

PINTO, M., S. VEGA, y N. FLORES. 1998. Métodos de Análisis de la Leche y Derivados. Universidad Austral de Chile. Valdivia. Chile. 2a Edición pp. 48 -64.

RADEMA, L. y H. MULDER. 1948. Method for determining the fat contents of milk II. the Gerber method. Neth. Milk Dairy J. Holland. 2(4): 210-222.

RADEMA, L. y H. MULDER. 1951. Methods for Determining the fat Content in Milk. III The Correction of the figures Found by the Gerber Method. Neth. Inst. for Dairy R. 2 (4) : 210-222.

RIOS, A. 1999. Validación de Métodos Químicos y Microbiologicos. In: Compatibilidad, Trazabilidad de Mediciones Química en la Integración de América Latina y el Caribe. III Simposio y Exposición de la Sección de América Latina y el Caribe de la AOAC Internacional. Centro de estudios Nucleares de La Reina. Comisión Chilena de Energía Nuclear, 1- 5 Agosto 1999.

SCHWARZ, G. 1954. Report of the German Commission on the standarization of the methods for analysis of milk and dairy products. Milchwissenschaft. Germany 9(3): 93-96.

SLANOVEC, T, SOLTAR y E. KERUINA. 1971. Standarization of methods for milk fat determination. Mljekarstvo. 21(5):99-104.