AGRO SUR 36(3) 130-136 2008
DOI:10.4206/agrosur.2008.v36n3-02

CIENCIA AGRARIA

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IMPLICADAS EN LA VIRULENCIA DE CEPAS DE Pectobacterium carotovorum SUBSP. carotovorum Y Dickeya chrysanthemi AISLADAS DE PAPA

Determination of enzymatic activities implicated in the virulence of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum and Dickeya chrysanthemi isolated from potato

Yuliet Franco Cardoza y Marusia Stefanova Nalimova

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 Nº. 514 e/ 5a B y 5a F, Playa, Ciudad de la Habana. Cuba. CP 11600.
Dirección de contacto: yfranco@inisav.cu.

ABSTRACT

The plant pathogenic bacteria Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum and Dickeya chrysanthemi can cause severe economic damage to potato and other plant crops. Progression of the disease requires the action of extracellular enzymes produced by these bacteria that degrade the cell walls of host plants. The activities of pectate lyase, polygalacturonase, cellulase and protease from four strains of P. carotovorum subsp. carotovorum and four strains of D. chrysanthemi were determined in vitro. The highest maceration ability on potato tubers of Spunta cultivar were found for Q35, Ms11, B13 of the latter species, E505, E1003 and Alq41 of carotovorum while E1105 and Art41 belonging to£the frst and the second species respectively were less virulent. For D. chrysanthemi the elevated virulence was related with a high pectate lyase and cellulase activities ranging from 2.4 to 4.6 U and 0.24 to 0.3 U, respectively. In the case of subspecies carotovorum the high level of virulence was associated with a high polygalacturonase activity between 1.1 and 1.7 U. The highest protease activity with gelatine hydrolysis halos above 18 mm, corresponded to Ms11 and Q35. For the rest of the strains, the values were similar, except for E1105 where this enzymatic activity was not detected.

Key words: Solanum tuberosum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Dickeya chrysanthemi, extracelular enzymes, virulence.

RESUMEN

Las bacterias fitopatógenas Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y Dickeya chrysanthemi pueden causar daños severos en papa y varios cultivos. El desarrollo de la enfermedad se debe a la acción de enzimas extracelulares producidas por estas especies, que degradan la pared celular de las plantas hospedantes. En este, trabajo se analizó la actividad de las enzimas pectato liasa, poligalacturonasa, celulasa y proteasa en condiciones in vitro para cuatro cepas de P. c. subsp. carotovorum y cuatro de D. chrysanthemi. Q35, Ms11, B13 de esta última especie y E505, E1003, Alq41 de la otra presentan un comportamiento muy virulento en tubérculos de papa de la variedad Spunta mientras que E1105 y Art41 de D. chrysanthemi y P. c. subsp. carotovorum respectivamente, muestran menor virulencia. Para la especie D. chrysanthemi la mayor virulencia fue vinculada con una elevada actividad pectato liasa y celulasa con valores entre 2,4 y 4,6 U para la primera y de 0,24 a 0,3 U para la segunda; mientras que para la subespecie P. c. subsp. carotovorum se relacionó con una alta actividad poligalacturonasa, entre 1,1 y 1,7 U. La mayor actividad proteasa, con halos de hidrólisis de la gelatina superiores a 18 mm, correspondió a Ms11 y Q35 de D. chrysanthemi.
Para el resto de las cepas, los valores fueron similares, con la excepción de E1105, de esta misma especie, en la que no fue detectada esta actividad enzimática.

Palabras clave: Solanum tuberosum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Dickeya chrysanthemi, enzimas extracelulares, virulencia.

INTRODUCCIÓN

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (= Erwinia carotovora subsp. carotovora Jones 1901) y Dickeya chrysanthemi (= Erwinia chrysanthemi Burkholder, McFadden & Dimock 1953) tienen una distribución mundial y se consideran las bacterias patógenas de mayor importancia en el cultivo de la papa desde el punto de vista comercial. Estas especies causan pudriciones blandas en los tubérculos y pie negro en los tallos de papa, y ocasionan como consecuencia grandes pérdidas que han sido estimadas entre 50 y 100 millones de dólares anuales a nivel mundial (Benelli et al., 2004; ; Duarte et al., 2004, Burr et al., 2006). El desarrollo de la enfermedad se debe a la acción de enzimas extracelulares producidas por estas bacterias como pectato liasa, poligalacturonasa, celulasa y proteasa, que degradan los componentes de la pared celular de las plantas, lo cual conlleva a la maceración de los tejidos y la liberación de nutrientes para el crecimiento bacteriano (Py et al., 1998; Toth et al., 2003). La actividad de estas enzimas, principalmente de las pectato liasas, ha sido correlacionada con la patogenicidad y la virulencia de estas bacterias fitopatógenas (Matsumoto et al., 2003).

La vía más importante de transmisión de la enfermedad es a través de los tubérculos contaminados donde estas especies pectolíticas están presentes de forma latente en la superficie o en las lenticelas (Scott et al., 1996). Las condiciones ambientales de humedad, temperatura y disponibilidad de oxígeno ejercen una gran influencia tanto en la aparición de la enfermedad como en la extensión del daño causado. La temperatura es un factor principal y su nivel puede determinar cuál organismo predomina en una lesión aunque estén presentes en igual número (Pérombelom, 2002; Smadja et al., 2004). El exceso de agua también es esencial pues permite que las células bacterianas se muevan más fácilmente a través del tejido de la planta. Además conlleva a una disminución en la disponibilidad de oxígeno, lo cual crea un ambiente anaeróbico dentro de la planta y limita sus defensas dependientes de oxígeno (Toth et al., 2003).

Durante las campañas de papa 2002-2003; 2003-2004 y 2004-2005 se produjeron notables afectaciones en papa importada para semilla y en condiciones de campo en la provincia Habana, Cuba. De diferentes muestras de plantas y tubérculos se aislaron cepas bacterianas que fueron identificadas como P . c . subsp. carotovorum y D. chrysanthemi. Estudios de caracterización de estas cepas realizados por Franco (2008) mostraron que aunque todas eran patógenas existían diferencias en su virulencia pues algunas fueron capaces de ocasionar mermas superiores a 14 % en el peso de los tubérculos mientras otras sólo provocaron reducciones entre 4 y 8 %. El objetivo de este trabajo fue analizar, en condiciones in vitro, las actividades pectato liasa, poligalacturonasa, celulasa y proteasa implicadas en el proceso patológico para cepas seleccionadas, algunas que presentaron un comportamiento muy virulento y otras que resultaron poco virulentas.

MATERIALES Y MÉTODOS

En el estudio se emplearon cuatro cepas de P . c . subsp. carotovorum y cuatro de D. chrysanthemi aisladas de papa y seleccionadas por su comportamiento en el test de maceración de tubérculos (Cuadro 1).

Determinación y cuantificación de enzimas extracelulares

Condiciones de cultivo y obtención de los sobrenadantes

El cultivo de las bacterias se llevó a cabo en frascos Erlenmeyer de 250 mL que contenían 45 mL de medio líquido descrito por Smadja et al., (2004) y 0,4% de ácido poligalacturónico (PGA) obtenido en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) a partir de cáscara de lima persa mediante un procedimiento patentado por Cabrera et al., (2003). Los cultivos se mantuvieron en agitación a 100 r·min^-1 en zaranda reciprocante (Karl Kolb, Germany) y una temperatura de 28 º C durante 24 horas. La estimación del crecimiento se realizó mediante la lectura de la densidad óptica (DO) a 600 nm en espectrofotómetro GENESYS 10 UV. Para cada cepa se realizaron dos cultivos independientes.

Para la obtención de los sobrenadantes, las muestras fueron colectadas de cada cultivo a las 24 horas por centrifugación a 12000 r·min^-1 durante 10 min (rotor Eppendorf, F45-30-11). Los sobrenadantes se filtraron a través de filtro Millipore de 0,22ºm (Millipore Cop., Bedford, Mass.) y se congelaron a -20 º C hasta su uso (Smadja et al., 2004).

Cuantificación de actividad pectato liasa

La actividad pectato liasa se determinó monitoreando la formación de productos 4,5 insaturados en espectrofotómetro a 235 nm con el empleo de ácido poligalacturónico al 1% como sustrato (Laurent et al., 2000). Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que produjo un incremento de una unidad de absorbancia a 235 nm por minuto por mililitro. La actividad específica fue expresada como unidad de actividad por unidad de DO a 600 nm.

Cuantificación de actividades poligalacturonasa y endoglucanasa

Ambas actividades en los sobrenadantes de cultivo se midieron valorando la formación de azúcares reductores mediante el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959). Para la actividad hidrolasa se empleó como sustrato una solución de ácido poligalacturónico (0,5%) preparada en buffer citrato 0,05 M pH 4 y en el caso de la acitividad endoglucanasa el sustrato fue una solución de carboximetilcelulosa al 0,5 % preparada en el mismo buffer. Se leyó absorbancia a 540 nm.

La cantidad de azúcares reductores liberados por la actividad enzimática se valoró frente a una recta patrón de ácido D-galacturónico (Sigma). La unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1 µmol de azúcar reductor por minuto por mililitro de sobrenadante bajo las condiciones de ensayo utilizadas. La actividad específica fue expresada como unidades de actividad enzimática por DO a 600 nm.

Detección y determinación semicuantitativa de actividad proteasa en placas

La detección y estimación de la actividad proteasa se llevó a cabo en placas Petri de 100 mm de diámetro con 15 mL de medio que contenía gelatina al 3 % y caldo nutriente al 0,4 %, pH 7,4. El medio se suplementó con 0,8 % de agarosa y 0,2 % de azida sódica (Chatterjee et al., 1995b). Luego de solidificado se abrieron 5 pocillos de 5 mm de diámetro donde se colocaron 30 µ L de las muestras e igual cantidad de agua destilada estéril como control negativo. Se incubó a 28 º C durante 36 horas y posteriormente se midieron los halos de hidrólisis del sustrato.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistica para Windows versión 6.0. Para cada enzima se efectuó un ANOVA de clasificación simple y las medias se compararon a través de la prueba de rangos múltiples de Duncan. Los gráficos se realizaron en Excel de Windows XP

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuantificación de actividades enzimáticas

Las cepas Ms11, Q35 y B13 de D. chrysanthemi tuvieron una alta actividad pectato liasa (2,4 - 4,6 U), celulasa (0,24 – 0,3 U), mientras que para las poligalacturonasas los valores de actividad fueron bajos con valores entre 0,36 y 0,65 U (Figuras 1 A y B). En E505, E1003 y Alq41 de P . c. subsp. carotovorum sucedió lo contrario pues la actividad poligalacturonasa fue elevada con valores de 1,1 a 1,7 U y las de pectato liasas y celulasas resultaron bajas con valores de 0,22 a 0,81 U y de 0,01 a 0,06 U respectivamente. Sin embargo, cabe señalar que los niveles de pectato liasas de E505 y E1003 resultaron los más altos con respecto a las otras cepas de su especie. Art41 de P . c. subsp. carotovorum y E1105 de D. chrysanthemi tuvieron baja actividad de las tres enzimas al comparar entre todas las cepas empleadas en el experimento.

En el caso de las proteasas, a excepción de Ms11 y Q35 que mostraron las mayores actividades con halos superiores a 18 mm y E1105 en la que no se detectó esta enzima, el resto de las cepas presentó valores bastante similares (Fig. 2). Varios autores entre los que podemos citar a Stromberg et al., (1994) plantean que aunque las proteasas no maceran tejidos, contribuyen a la virulencia al aumentar la acción de las pectinasas, ya sea inflingiendo estrés en las células de la planta previo al daño por la actividad pectolítica o proveyendo a la bacteria de fuentes de nitrógeno utilizables a través de la degradación de sustancias poliméricas.

Figura 1. Actividad pectato liasa (A), poligalacturonasa (B) y celulasa (C) de cepas de D. chrysanthemi y de P. c. subsp. carotovorum. Cultivo 24 h a 28 º C, 100 r.min-1, medio de sales minerales (Smadja et al., 2004) suplementado con PGA. n=3, p<0,05. Figure 1. Pectate lyase (A), polygalacturonase (B) and cellulase activity of D. chrysanthemi and P. c. subsp. carotovorum strains. Grown for 24 h at 28º C, 100 r.min-1, in a salt mineral medium (Smadja et al., 2004) supplemented with PGA. n=3, p<0.05.

 

Figura. 2. Halos de hidrólisis de la gelatina debido a la actividad proteasa de cepas de D. chrysanthemi y P . c . subsp. carotovorum. Las condiciones para la detección fueron descritas anteriormente por Chatterjee et al., (1995). Figure. 2. Gelatine hydrolysis halos due to protease activity of D. chrysanthemi y P. c. subsp. carotovorum strains. Conditions for detection were those described by Chatterjee et al., (1995).

Recepción de originales:19 de noviembre 2008