Hemagglutinating properties of Escherichia coli strains isolated from diarrheic lambs

The intestinal content of 107 neonatal dead lambs was examined in order to isolate producers of thermostable toxin (ST) and verotoxin (VT) E. coli strains. Besides, the hemagglutinating properties were also tested.
Eighty four (78.5%) strains of E. coli were isolated, 70 (83.3%) of which were hemagglutinating to red blood cells of different animal species, mainly hen; most of them proved mannose resistent (MRHA). Also, 18 strains ST producers and 11 VT producers were isolated, all of them with agglutinating activity; the MRHA type predominating.
It is recommended to run the hemagglutination test and secondly to study the antigenic structure and enterotoxic capacity of the isolated strain, particulary when a big number of strains is analized, in order to decrease the diagnostic costs and to obtain preliminary information on presumably, pathogenous strains.  

Palabras claves:  E. coli,  hemaglutinación,  diarrea,  cordero.

Key words:  E. coli,  hemagglutination,  diarrhea,  lambs.

* Proyectos  FONDECYT 92-0067  y  DID UACH S-94-16.

INTRODUCCION

La infección intestinal por E. coli, tanto en el hombre como en los animales domésticos, es provocada por cepas que se adhieren y colonizan las células superficiales epiteliales del intestino delgado (Evans y col., 1978, 1979), lo que logran por diferentes adhesinas, entre las que destacan las fimbrias en las cepas enterotóxicas (ETEC) (Evans y col., 1978, 1980b). Así, se describen diferentes fimbrias que se encuentran presentes en cepas de origen animal como K88 (F4) preferentemente en infecciones del cerdo y las K99 (F5) en terneros y ovinos (Burrows y col., 1976; Jones y Rutter, 1974; Arp, 1988). También se describen cepas que exhiben fimbrias que tendrían una función discutible como adhesinas de la mucosa del intestino delgado, como acontece con los pilus tipo I (F1), las que pueden diferenciarse de otras por ser hemaglutinantes manosa sensibles (HAMS); en cambio las cepas enterotóxicas presentan fimbrias que son manosa resistentes (HAMR) (Evans y col., 1978; Arp, 1988).

En atención a que las propiedades hemaglutinantes pueden corresponder a importantes factores de virulencia, el objetivo del presente artículo es dar a conocer la capacidad de hemaglutinación de cepas de E. coli aisladas de corderos neonatos diarreicos, relacionándolas con la capacidad enterotóxica que exhiben.

MATERIAL Y METODOS

Se obtuvieron muestras del contenido intestinal de 107 corderos muertos menores de 30 días de edad que presentaban diarrea. Las muestras se sembraron en placas de agar eosina azul de metileno con el objeto de aislar cepas de E. coli. De aquellas siembras en que se desarrollaron colonias características de ser E. coli en más del 80% de la placa Petri (Schudel, 1985), se replicaron en agar peptona para purificarlas, identificándolas posteriormente por sus propiedades bioquímicas y fisiológicas.

A las cepas que resultaron ser E. coli se les estudió su capacidad de producir toxina termostable (ST), verotoxina (VT) y sus propiedades hemaglutinantes. Para la producción de ST se procedió como se describió anteriormente (Zamora y col., 1994), con la salvedad de que para la detección de la toxina en los filtrados obtenidos se empleó la técnica de ELISA de competencia, usando kit elaborado por el laboratorio Oxoid, Inglaterra. Para la pesquisa de VT se siguió la misma técnica de inoculación de los filtrados en monocapa de cultivo celular Vero utilizada en 1994 (Zamora y col., 1994). 

Para determinar las propiedades hemaglutinantes, las cepas se cultivaron a 37°C por 18 - 24 h en medio agar CFA (Evans y col., 1979, 1980a) consistente en agar 2%, casamina ácida 1%, extracto de levadura 0.15%, MgSO4 0.005% y MnCl2 0.0005% a pH 7.4 con la finalidad de incrementar el desarrollo de fimbrias. Los cultivos se suspendieron en PBS pH 7.2 a una concentración de aproximadamente 109/ml mezclando sobre una placa 20 µl de la suspensión bacteriana con una gota (20 µl) de suspensión de eritrocitos al 3% previamente lavados por tres veces en PBS. La placa se agitó suavemente haciéndola rotar a temperatura ambiente, leyéndola dentro de un minuto. Para examinar la especificidad de las hemaglutininas, cada cepa se probó por separado frente a eritrocitos de gallina, bovino y cobayo. Para detectar la sensibilidad de la hemaglutinina a la manosa, se repitió la prueba con las cepas hemaglutinantes suspendiendo, tanto las cepas como los eritrocitos, en D-manosa al 1% en PBS pH 7.2 (Cox y Houvenaghel, 1987; Evans y col., 1978, 1979).

  

RESULTADOS

De las 107 muestras de fecas se lograron aislar 84 cepas de E. coli (78.5%), de las cuales 70 (83.3%) demostraron tener capacidad hemaglutinante, tal como se resume en el cuadro 1.

La prueba de ELISA pesquisó 18 cepas que eran productoras de ST; a su vez las lesiones citopáticas en línea celular Vero indicaron que 11 cepas eran productoras de Verotoxina. La relación entre las cepas toxigénicas y sus propiedades hemaglutinantes se resumen en el cuadro 2.

DISCUSION

Un total de 70 (83.3%) cepas de E. coli presentaron propiedades hemaglutinantes, 69 (98.6%) de las cuales se detectaron con eritocitos de gallina, 51 (72.9%) con eritrocitos de cobayo y 34 (48.6%) con eritrocitos de bovino (cuadro 1). Consecuentemente, las hemaglutininas de las cepas aisladas –sean fímbricas o de otro tipo– reaccionaron preferentemente con los eritrocitos de gallina, correspondiendo mayoritariamente al tipo de HAMR, aunque 3 cepas resultaron ser sensibles a la manosa (HAMS), las que podrían pertenecer al biotipo A de Smyth (1982) que se caracterizan por no aglutinar los eritrocitos de gallina al ser tratadas con manosa.

Diferentes investigadores (Evans y col., 1980a y b; Isaacson, 1988; Gyles, 1993) sostienen que cepas HAMR juegan un importante papel en la adhesión a los enterocitos de la mucosa del intestino delgado evitando ser desplazadas por el peristaltismo intestinal y, por ende, con la consecuente colonización de la mucosa. A su vez, las cepas HAMS podrían corresponder a fimbrias tipo 1 (F1), las que según algunos autores corresponderían a E. coli de la flora normal (Evans y col., 1979). También se sostiene que tendrían un papel más significativo en infecciones extraintestinales, como sucede en las aves con infecciones del epitelio del aparato respiratorio (Dho-Moulin, 1993); no obstante, otros investigadores aseveran que la F1 sirve como factor de colonización en algunas cepas enterotóxicas y enteropatógenas (Levine y col., 1980; Wilson y Francis, 1986; Takahashi y col, 1990). Con todo, se debe recordar que diversos investigadores informan el aislamiento de cepas de E. coli K88, K99, F41 que fueron HAMR (Morris y col., 1977; Velázquez y col., 1991).

En cuanto a las cepas productoras de ST todas resultaron hemaglutinantes, relacionándose más bien con el tipo HAMR en eritrocitos de gallina, ya que 15 cepas son resistentes a la manosa y sólo 3 sensibles a este azúcar (cuadro 2). Los eritrocitos de cobayo pesquisan cepas que son HAMR y HAMS prácticamente en partes iguales. Por último, los eritrocitos de bovinos son aglutinados en menor proporción, puesto que únicamente 3 cepas presentan hemaglutininas.

Con las 11 cepas productoras de verotoxina se constató que todas ellas poseían hemaglutininas, predominando la de tipo HAMR al igual como sucedió con las ST (cuadro 2).

Al asociar estos resultados resumiéndolos en la secuencia gallina-bovino-cobayo e identificando por R los HAMR, por N los no hemaglutinantes y por S a los HAMS, se puede mencionar que en el caso de las cepas ST serían preferentemente RNR o RNS. En cuanto a las cepas productoras de verotoxinas corresponderían mayoritariamente a RNN o RNS. Con todo, no se puede concluir con un modelo de clasificación como lo han hecho Evans y col. (1979, 1980a) con cepas de origen humano, quienes utilizaron la tipificación hemaglutinante como prueba presuntiva de identificación de cepas ETEC que poseen las fimbrias CFA I (F2) y CFA II (F3) (Evans y col., 1979); además, estos investigadores dan a conocer en 1981 una alta y directa correlación existente entre la hemaglutinación que ellos denominan "tipo VI" y cepas aisladas en casos de bacteremia (Evans y col., 1981).

Se pretende construir en el futuro un esquema clasificatorio de las cepas E. coli hemaglutinantes, ya que no es posible hacerlo con los datos obtenidos en el presente trabajo, no sólo por el reducido número de cepas, sino que también porque es necesario considerar otras características, entre las que cabe mencionar antígenos O, H, K y fímbricos, presencia de cápsulas, elaboración de otras toxinas además de VT y ST, etc., lo que además se debe correlacionar con el origen de las cepas aisladas, con eritrocitos obtenidos de un mayor número diferentes especies animales y con la técnica hemaglutinante empleada (Aning y Thomlinson, 1983; Cox y Houvenaghel, 1987). En el intertanto, en atención a que las adhesinas fímbricas constituyen una importante herramienta en el diagnóstico de la diarrea neonatal, puesto que se presentan raramente en cepas E. coli no enterotóxicas (Thorn y Roeder, 1988), es dable concluir, coincidiendo con Evans y col. (1980a), que el test de hemaglutinación puede servir de base para seleccionar cepas que se someten posteriormente a examen serológico y clasificación antigénica de las fimbrias, ya que el estudio hemaglutinante es económico, rápido y fácil de realizar, por lo que está al alcance de laboratorios modestos.

RESUMEN

Se examinó el contenido intestinal de 107 corderos neonatos muertos con el objeto de aislar cepas de E. coli productoras de toxina termoestable (ST) y verotoxina (VT) y también comprobar su capacidad hemaglutinante.
Se aislaron 84 (78.5%) cepas de E. coli, 70 (83.3%) de ellas fueron hemaglutinantes de eritrocitos de diversas especies de animales, preferentemente de gallina, la mayoría de las cuales resultaron ser manosa resistentes (HAMR). A su vez, se logró el aislamiento de 18 cepas elaboradoras de ST y de 11 de VT, todas ellas con capacidad hemaglutinante, predominando las de tipo HAMR.
Se recomienda hacer la prueba de hemaglutinación y posteriormente pesquisar la estructura antigénica y capacidad enterotóxicas de las cepas aisladas, particularmente cuando se analiza un gran número de cepas, con la finalidad de disminuir los costos de diagnóstico, logrando una información preliminar de cepas presumiblemente patógenas.

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Aceptado: 09.09.96