Efecto de la densidad poblacional y temperatura en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) inoculadas con Piscirickettsia salmonis

Efecto de la densidad poblacional y temperatura en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) inoculadas con Piscirickettsia salmonis^*

J.J. LARENAS, M.V.; J. CONTRERAS, M.V.; S. OYANEDEL, Ing. Ejec.;
M.A. MORALES, M.V., Mag. Bioest.; P. SMITH, M.V., Ms.C.

Piscirickettsiosis is the most important disease affecting farmed salmonids in Chile since 1989. It is produced by a rickettsial agent named Piscirickettsia salmonis which has been described in all species of salmonids reared in seawater. The effect of water temperature (°C) and fish loading density (k/m3) on piscirickettsiosis was evaluated. Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (n=300) were inoculated by intraperitoneal injection with P. salmonis (0.2 ml in 105.8 TCID50/ml (LF-89 strain) and divided into three groups (n=100 each one) according to water temperature (8, 14 and 18°C). Subsequently, each group was divided in two according to loading densities (5 k/m3 and 20 k/m3); 24% cumulative mortality was obtained in the group with highest density (20 k/m3) and 14°C. This was significantly higher than the other groups (p 0.001). These results suggest that both, temperature and loading density, and their interactions, are significant epidemiological factors for the disease.

Palabras claves: Piscirickettsia salmonis, piscirickettsiosis, epidemiología.

La piscirickettsiosis (Fryer y col., 1992) o SRS (Síndrome Rickettsial Salmonídeo) (Cvitanich y col., 1991) es una de las enfermedades más importantes que afectan a salmones de cultivo en fase marina en Chile debido a las altas mortalidades que produce. Su agente etiológico, Piscirickettsia salmonis (Fryer y col., 1992), afecta a todas las especies salmonídeas mantenidas en condiciones de cultivo intensivo en Chile (Bravo, 1994). Agentes similares a este microorganismo se han observado en salmonídeos en Canadá (Brocklebank y col., 1992; Kent, 1992), Noruega (Olsen y col., 1993) e Irlanda (Rodger y Drinan, 1993), sin embargo, las mortalidades nunca han alcanzado la magnitud que éstas tienen en Chile.

La enfermedad normalmente se presenta durante el ciclo de vida marino de los salmonídeos (Bravo y Campos, 1989; Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Branson y Nieto, 1991) y raramente se ha presentado en agua dulce (Bravo, 1994). Los brotes principales de piscirickettsiosis ocurren durante la época de otoño y primavera, al parecer en relación a la temperatura del agua, que varía en esas épocas entre 9-16°C (Lannan y Fryer, 1994). Al respecto, los estudios in vitro han demostrado que P. salmonis tiene una temperatura óptima de replicación entre 15 a 18°C (Fryer y col., 1990); sin embargo, no existen antecedentes del efecto que tiene este factor sobre la presentación de la enfermedad en los peces.

Para tratar de minimizar las mortalidades que produce esta enfermedad se han realizado distintas medidas de manejo, como es la disminución de la densidad poblacional por balsa-jaula. Sin embargo, no existen reportes con respaldo experimental que corroboren si esta decisión es un factor importante que contribuye en la disminución de la severidad o frecuencia de cuadros de piscirickettsiosis.

En el presente estudio se reporta el efecto concomitante de diferentes temperaturas del agua y densidades poblacionales en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) inoculadas experimentalmente con P. salmonis.

Peces. Se utilizaron truchas arco iris de 30 gr (n=480) clínicamente sanas, provenientes de una piscicultura ubicada en la Región Metropolitana, Santiago, Chile, zona en la cual nunca se ha descrito piscirickettsiosis. Los peces fueron sometidos a un período de cuarentena y adaptación de 3 semanas previo a la inoculación, tiempo durante el cual se les realizaron controles de salud. Al respecto, 30 peces fueron seleccionados al azar, eutanasiados y analizados mediante un estudio de necropsia e histopatología de riñon, hígado, branquias y bazo. Además, a todas las muestras renales se les realizó una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IF) para la detección de P. salmonis, de acuerdo a lo descrito por Lannan y col. (1991).

Posterior al período de adaptación, las truchas fueron divididas, en estanques separados, en 3 grupos experimentales, de acuerdo a la temperatura del agua utilizada, la cual fue en promedio de 8°, 14° y 18°C, respectivamente. A su vez cada grupo de peces fue dividido en dos subgrupos, de acuerdo a la densidad poblacional, de 5 k/m3 o 20 k/m3, de esta manera cada estanque, con su respectivo duplicado, contenía 25 peces. La densidad fue mantenida durante todo el experimento, disminuyéndose proporcionalmente el nivel del agua de los estanques cada vez que se presentaron mortalidades. Cada pez fue inyectado intraperitonealmente con 0.2 ml de sobrenadante de cultivo celular inoculado previamente con la cepa LF-89 P. salmonis, de acuerdo a lo descrito por Garcés y col. (1991) y Smith y col. (1996). Estos grupos tuvieron sus respectivos controles negativos inoculados vía intraperitoneal con una solución estéril de "buffer" fosfato salino (PBS) (pH = 7.0). Durante el transcurso del experimento se tomaron muestras de frotis renales y de contenido intestinal de todos los peces moribundos o muertos, para realizar IF para la detección de P. salmonis. El mismo procedimiento se realizó al término (35 días postinoculación), muestreándose al azar el riñon de 10 peces sobrevivientes por cada grupo experimental.

La menor temperatura del agua (8±0.4°C) fue mantenida mediante unidades de refrigeración (Trilab®, Chile). La temperatura de 14±1.1°C correspondió a la temperatura de la red de agua potable de la ciudad de Santiago. Por último, la temperatura más elevada (18.0±0.45°C) fue mantenida en forma individual mediante termocalefactores con termostato para acuarios (Hagen®, Italia).

Los porcentajes de mortalidad entre las tres temperaturas o entre las dos densidades se compararon mediante la prueba de homogeneidad que usa la distribución de chi cuadrado. Para el análisis de sobrevivencia se usó el método de tabla de vida y las comparaciones se realizaron por la prueba de log-rango (Lee, 1980).

Todos los experimentos se realizaron en la Unidad de Patología de Organismos Acuáticos del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, en Santiago, Chile. Los peces se mantuvieron en estanques de vidrio, con suministro de agua dulce potable, previamente filtrada y declorada, usando un filtro automático de carbón activado (Aguasin®, modelo CA-30, Chile). A todos los estanques se les suministró aire en forma permanente a través de una bomba inyectora (Takatsuki Electric®, Tipo SPP400GJL, Japón) para mantener oxígeno disuelto en una concentración entre 6-9 ppm. El agua de salida de los estanques fue clorada en cantidad suficiente para eliminar posibles patógenos presentes, utilizando al menos 0.5 ppm de cloro libre residual (INN, 1984).

Piscirickettsia salmonis. Se utilizó la cepa LF-89 (ATCC (R) VR 1361) (Fryer y col., 1992) como inóculo para todos los peces experimentales. Esta bacteria fue mantenida y multiplicada en la línea celular CHSE-214 (ATCC CRL 1681) (Lannan y col., 1984), de acuerdo a la metodología establecida por Fryer y col. (1990). Para efectos de inoculación, se empleó una suspensión de cultivo celular que contenía el microorganismo rickettsial y que fue utilizada una vez que se observó un efecto citopático cercano al 100% en la monocapa. Posteriormente fue titulada mediante microplacas (Fryer y col., 1990). El título final correspondió a 105,8 Dosis Infectante Cultivo de Tejido 50% por ml (TCID50/ml).

En ninguno de los grupos controles negativos se produjeron mortalidades durante todo el período experimental que duró 35 días postinoculación (PI). Lo mismo ocurrió en todos los grupos de peces inoculados con P. salmonis, mantenidos a 8°C con cualquier densidad, y en el de 18°C-20 k/m3. Una mortalidad no superior al 2% se presentó en los peces mantenidos a 14°C-5 k/m3 y 18°C-5 k/m3, la cual no difirió estadísticamente de los grupos anteriores (pz0.05). En el grupo de 14°C-20 k/m3 las mortalidades alcanzaron un total acumulado de un 24%, valor que presentó diferencias significativas (p0.0001) comparado con los otros grupos inoculados. En este grupo las mortalidades comenzaron el día 12 PI y finalizaron el día 32 PI (fig. 1). Al comparar las tasas de mortalidad, considerando únicamente la temperatura, se encontraron diferencias estadísticas entre 14°C respecto de 8°C y 18°C (p0.01) (fig. 2). También se obtuvo una diferencia significativa al comparar las tasas de mortalidad entre las dos densidades poblacionales (p0.05) (fig. 3).

El análisis de sobrevivencia demostró solamente diferencias significativas entre 14°C-20 k/m3 y el resto de los grupos (p0.001). Además, para este grupo, la mayor mortalidad se produjo el día 19 PI, donde alcanza un valor de 0.087 para la probabilidad de morir (qi). Este análisis demostró además una probabilidad de sobrevivencia (Si) de 0.98 para los grupos de 14°C-5 k/m3 y 18°C-5 k/m3, de un 0.76 para el grupo de 14°C-20 k/m3 (tabla 1) y de 1.0 para el resto de los grupos analizados.

Figura 1. Mortalidad acumulada en truchas arco iris inoculadas
experimentalmente con P. salmonis de acuerdo a temperatura y
densidad poblacional.
Cumulative mortality in rainbow trout inoculated with P. salmonis
according to temperature and loading density.

qi: Probabilidad de morir, Si: Probabilidad de sobrevivir.
qi: Conditional mortality rate, Si: Survival function.

En general, los peces antes de morir presentaron signos clínicos tales como anorexia, letargia marcada y oscurecimiento del dorso. A la necropsia la mayoría evidenció petequias en la base de las aletas, ascitis amarillenta, hemorragia en ciegos pilóricos e intestino posterior, palidez de hígado, esplenomegalia y aumento de tamaño de la porción posterior del riñón. Todo el sistema gastrointestinal presentaba un contenido mucoso amarillo. En todos los peces moribundos y muertos analizados se observó la presencia de P. salmonis en frotis de riñón y en contenido intestinal mediante IF (tabla 2).

Al día del término del experimento (35 PI), ninguno de los peces inoculados sobrevivientes demostró signos clínicos o lesiones macroscópicas a la necropsia. Un 56.6% de los peces estudiados (n=60) presentó presencia de P. salmonis en frotis renales, mediante IF (tabla 3), pero no hubo diferencias estadísticas al analizar los porcentajes de positividad entre los diferentes grupos (p³ 0.05).

Las lesiones macroscópicas en todos los peces inoculados con P. salmonis, moribundos o muertos, fueron similares a las descritas en la enfermedad natural (Bravo y Campos, 1989; Cvitanich y col., 1991; Branson y Nieto, 1991). Sin embargo, es preciso mencionar que todos los peces enfermos presentaron un contenido mucoso amarillento en el intestino, que no se observó en peces aparentemente sanos. Este tipo de fluido contenía, en todos los casos, altas cantidades de micro-organismos, lo que sugiere que la vía intestinal podría contribuir en la diseminación del agente en condiciones naturales. Estudios in vitro realizados por Lannan y Fryer (1994) han demostrado una sobrevida relativamente prolongada del agente en agua salada, lo cual sugiere que el agente rickettsial presente en el contenido fecal, en condiciones marinas, sería capaz de transmitirse horizontalmente. Esta vía de excreción podría explicar los resultados obtenidos por Cvitanich y col. (1991), que indican una transmisión horizontal para la enfermedad en ausencia de vectores.

La detección de P. salmonis en los peces inoculados experimentalmente y sobrevi-vientes, al término del experimento, demostró que no todos los individuos resultaron positivos a la presencia del agente rickettsial (tabla 3). En relación a lo anterior, cabe mencionar una mayor positividad en los peces donde hubo mayor mortalidad, correspondien-te a 14°C y 20 k/m3. La ausencia de positivi-dad en algunos peces inoculados con P. salmonis podría estar sugiriendo algún tipo de mecanismo defensivo que no permite la multiplicación de P. salmonis en el pez. Al respecto, una aparente respuesta inmunopro-tectiva a vacunación en condiciones de terreno ha sido recientemente propuesta por Smith y col. (1995).

De acuerdo a los resultados obtenidos, la temperatura más favorable para reproducir la enfermedad en condiciones experimentales fue de 14°C, lo cual es cercano al rango inferior de la temperatura óptima de replicación de P. salmonis en cultivos celulares (Fryer y col., 1990). La enfermedad no se reprodujo utilizando bajas temperaturas, y, por otra parte, aunque se presentó mortalidad en un solo grupo de 18°C, éstas fueron bajas y no difirió estadísticamente de los otros grupos donde no hubo mortalidad.

La alta densidad poblacional favoreció la producción de la enfermedad cuando se usaron 20 k/m3, sin embargo, a la luz de los resultados, temperatura y densidad parecen ser sinérgicos para producir la piscirickettsiosis. Una temperatura cercana a los 14°C, asociada a una alta densidad poblacional, aparecen como factores que deben estar simultáneamente presentes para favorecer el desarrollo de la enfermedad. Lo anterior se comprueba al comparar el fenómeno con las mortalidades obtenidas en el grupo de baja densidad (14°C - 5 k/m3).

Los resultados sugieren que condiciones extremas de temperatura (8°C o 18°C) no favorecen el desarrollo de la enfermedad, lo mismo que bajas densidades poblacionales. Sin embargo, existe una particular asociación entre la temperatura y la cantidad de peces por m3 sobre la presentación de piscirickettsiosis.

En el presente estudio se reporta el efecto concomitante de tres temperaturas diferentes del agua y dos densidades poblacionales sobre truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) inoculadas experimentalmente con P. salmonis. Los peces fueron inoculados intraperitonealmente con el agente rickettsial (cepa LF-89), utilizando 0.2 ml provenientes de una suspensión de cultivo celular infectado con un título de 105.8 TCID50/ml. Las truchas fueron divididas en tres grupos experimentales según la temperatura del agua: 8°, 14° y 18°C. A su vez, cada grupo de temperatura fue subdividido de acuerdo a la densidad poblacional de 5 k/m3 o 20 k/m3 y mantenidos por 35 días en acuarios.

Los resultados demostraron mortalidades de un 24% en el grupo mantenido a 14°C y 20 k/m3, lo cual fue estadísticamente superior al resto de los grupos (p0.001). Un efecto de sinergismo fue demostrado entre 14°C y 20 k/m3 para desarrollar la enfermedad. En los otros grupos experimentales no hubo mortalidades o bien éstas no fueron superiores a un 2%. Muestras de heces provenientes de peces moribundos demostraron la presencia P. salmonis. El presente estudio sugiere que el efecto de la densidad poblacional y la temperatura del agua pueden ser factores importantes en la presentación de la piscirickettsiosis.

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Figura 2. Mortalidad acumulada en trucha arco iris inoculada experimentalmente con P. salmonis de acuerdo a la temperatura a los 35 días postinoculación.a los 35 días postinoculación. Cumulative mortality in rainbow trout inoculated with P.salmonis according to temperature at postinoculation day 35.	Figura 3. Mortalidad acumulada en trucha arco iris inoculada experimentalmente con P. salmonis de acuerdo a la densidad poblacional a los 35 días postinoculation. Cumulative mortality in rainbow trout inoculated with P. salmonis according to loading density at postinoculation day 35.