As a contribution to the epidemiology of SHU in Chile, this work was focused on cattle and pigs as a possible reservoir of EHEC. This was achieved by analyzing E. coli isolates from faecal samples of healthy animals slaughtered in two abattoirs in Santiago. EHEC strains were identified by DNA hybridization with specific gene probes for Shiga-like toxin I (SLTI) and II (SLTII). Positive strains were hybridized with specific gene probes for fimbrial adhesin and eae factor, serogrouped and examined for sorbitol fermentability. Among the 136 steers and 120 pigs studied, 39 (28.7%) and 82 (68.3%) were found to carry EHEC strains, respectively.

Of the 40 bovine strains that hybridized with two SLT DNA probes, 29 (72.5%) hybridized with only SLTI probe, 6 (15%) hybridized with only SLTII probe and 5 (12.5%) hybridized with both SLTI and SLTII probes. Only 6 (15%) of the 40 EHEC hybridized with fimbrial adhesin probe and 14 (35%) hybridized with eae probe. An important number of strains (14/40) belonged to serogroups O157, O26 and O111; serogroups also commonly isolated from SHU cases in Chile. One steer was found to carry two EHEC strains of different serogroups. 50% of EHEC were sorbitol positive, irrespective of the O serogroup or genotypic profile.

Of the 82 pig strains, the predominant cytotoxic profile was SLTI-SLTII (68.3%); only 35 (42.7%) hybridized with fimbrial adhesin probe. An important number of strains (80/82) hybridized with eae probe. The serogroups found were: O157, O26, O111, O114, O119, O126, O127, O128, O142 and O158. Approximately 50% of EHEC strains were sorbitol positive, O157 included. Results obtained in this study strongly suggest that cattle and pigs in Chile are a reservoir of EHEC associated with diseases in humans.

Palabras claves: Escherichia coli enterohemorrágica, bovinos, cerdos.

Key words: enterohaemorrhagic Escherichia coli, cattle, pigs.

INTRODUCCION

E. coli es una bacteria que figura como una especie predominante entre la flora anaeróbica facultativa normal del intestino del hombre y animales, donde juega un rol importante en su fisiología. Sin embargo, dentro de la especie se encuentran cepas patógenas que causan distintos síndromes diarreicos. Se las ha clasificado en cinco categorías, de acuerdo a sus propiedades de virulencia, interacción con la mucosa intestinal, cuadro clínico, epidemiología y serotipos O:H (Levine, 1987): E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli enteropatogénica (ECEP), E. coli enterohemorrágica (ECEH), E. coli enteroinvasiva (ECEI) y E. coli enteroagregativa (ECEA). Actualmente se propone subdividir la categoría ECEA en E. coli enteroagregativa (ECEAgg) y E. coli de adherencia difusa (ECAD) según su patrón de adherencia a la mucosa intestinal (Prado y O'Ryan, 1994). De todas las categorías, la única considerada como zoonosis es ECEH (Griffin y Tauxe, 1991).

La relevancia clinicoepidemiológica del cuadro diarreico originado por cepas ECEH lo consti-tuye su capacidad de producir síndrome hemolítico urémico (SHU) en un 2 a 7% de los pacientes. Esta enfermedad afecta a niños menores de 5 años, principalmente lactantes (82%), con una letalidad que puede llegar a 10% y un 30% de secuelas graves tales como insuficiencia renal crónica e hipertensión arterial (Griffin y Tauxe, 1991). En Argentina y Chile, el SHU es una realidad y constituye una importante causa de insuficiencia renal aguda en niños menores de 4 años (Soler, 1973; López y col., 1989; Prado y col., 1997).

E. coli O157:H7, perteneciente a la categoría ECEH, fue inicialmente considerada como patógeno humano en dos brotes de diarrea hemorrágica ocurridos durante 1982 en Estados Unidos. Estudios epidemiológicos indicaron que dichos brotes estaban asociados a consumo de hamburguesas en restaurantes de comida rápida (Riley y col., 1983). A partir de entonces la entidad ha sido considerada como una enfermedad transmisible por alimentos (ETA), destacándose la participación de la carne y subproductos cárnicos, así como también jamón, carne de pavo, sidra casera, salame, leche cruda, yogurth y aguas contaminadas (Salmon y col., 1989; Dorn y Angrick, 1991; Swerdlow y col., 1992; Dorn, 1993; Morgan y col., 1993; Besser y col., 1993).

Numerosos esfuerzos se han realizado para establecer la participación de los animales de abasto en la epidemiología del SHU. Esta bacteria ha sido aislada del contenido intestinal de diversos animales, tales como bovinos, ovinos, caprinos, cerdos, perros, gatos y pollos (Bülte y col., 1990; Griffin y Tauxe, 1991; Beutin y col., 1993; Chapman y col., 1993 ). En general, las cepas de origen animal no corresponden a los serotipos asociados frecuentemente a enfermedad en el hombre, con excepción de las cepas aisladas de bovino en que se identifica el serotipo O157:H7 y otros de menor importancia. Las frecuencias de aislamiento de cepas ECEH en bovinos sanos fluctúan entre 2.6 y 24.7% (Samadpour y col., 1990; Montenegro y col., 1990; Wells y col., 1991; Wilson y col., 1992; Blanco y col., 1993; Chapman y col., 1993; Willshaw y col., 1993), dependiendo de la técnica diagnóstica utilizada. No se ha observado predominio por sexo ni raza y aparentemente se aísla con mayor frecuencia en animales jóvenes (Wells y col., 1991; Wilson y col., 1992). A pesar de que existen algunos estudios que logran aislar la bacteria a partir de bovinos diarreicos (Blanco y col., 1993; Mohammad y col., 1993; Zamora y col., 1994), la inoculación experimental de cepas ECEH, patógenas para el hombre, en terneros y bovinos adultos demuestra que la bacteria no es capaz de inducir un cuadro clínico ni alteraciones histopatológicas a nivel intestinal (Cray y Moon, 1995).

Dado que el SHU y la diarrea hemorrágica son patologías prevalentes en el país, y a la falta de antecedentes sobre el rol de los animales de abasto en las infecciones producidas por esta bacteria en Chile, este trabajo pretende caracterizar los factores asociados a virulencia en las cepas ECEH aisladas, entregando con ello un aporte al conocimiento epidemiológico del SHU que, sin duda, ayudará a determinar futuras estrategias de control.

MATERIAL Y METODOS

Tamaño muestral. Se analizaron 136 bovinos y 120 porcinos (Snedecor y Cochran, 1980). Las muestras se colectaron en dos plantas faenadoras de la Región Metropolitana, que corresponden a las de mayor faenamiento para la región. En ambos animales se obtuvo una muestra de heces mediante hisopado rectal en la fase de eviscera-ción y se transportaron a temperatura de refrigeración.

Aislamiento e identificación de E. coli. La totalidad de las muestras se sembraron en placas de agar McConkey e incubaron por 18-24 horas a 37° C. De cada muestra se seleccionó un máximo de 10 colonias lactosa positivas y se las sometió a identificación bioquímica rápida por métodos estándares (Krieg y Holt, 1984). Las colonias correspondientes a E. coli se mantuvieron en caldo tripticasa de soya con glicerina al 30% a -70° C y en medio Dorset a temperatura ambiente.

Detección y caracterización de cepas ECEH. Para detectar la presencia de cepas ECEH en el total de cepas de E. coli aisladas se les realizó hibridización con sondas biotiniladas asociadas a las toxinas Shiga-Like I y II . Para ello, todas las colonias fueron transferidas a filtros de papel Whatman para realizar la hibridización mediante la técnica de estampado de colonias. Los métodos para la preparación de los filtros y sondas biotiniladas fueron descritos previamente en detalle por Gicquelais y col. (1990). En breve, los filtros impresos fueron tratados con una solución de NaOH (pH 13) y tratamiento térmico para liberar el ADN de las colonias, obtener monohebras y fijarlas a la fase sólida. Los filtros se expusieron a una solución con 1.5 mg/100 ml de Lisozima^R1 y 25 g/100 ml de sucrosa durante 30 minutos, se lavaron y trataron con una solución de Proteinasa K^R1 (25 µg/ml) por 30 min a 37° C. Los filtros procesados se sometieron a hibridización a una temperatura de 42° C por 18 horas, luego se lavaron y bloquearon con BSA (seroalbúmina bovina). Posteriormente se incubaron con fosfatasa alcalina-estreptavidina^R2 (1 µg/ml) y se revelaron con 5-bromo-4-cloro-3-indolilsulfato^R1 (BCIP) y Azul de nitro-tetrazolio^R1 (NBT). En todos los filtros se consideró una cepa control positivo y negativo por cada sonda.

La sonda SLTI consiste en un fragmento Hind III de 1.1 kb, derivado de un fago y que codifica un 98% de la subunidad A y la subunidad B completa de la toxina (Newland y Neill, 1988). La sonda SLTII corresponde a un fragmento Sma-Pst I de 0.8 kb, también derivado de fago y que codifica el 95% de la subunidad A (Newland y Neill, 1988). Las sondas fueron obtenidas del Centro de Desarrollo de Vacunas, Universidad de Maryland. Para el propósito de este estudio las cepas ECEH fueron definidas como aquellas que hibriden con al menos una de las dos sondas para las citotoxinas.

Además de la caracterización del genotipo toxigénico, todas las cepas identificadas como ECEH se sometieron a hibridización con una sonda denominada ECEH, que corresponde a un fragmento Hind III de 3.4 kb del plasmidio de 60 Mda de la cepa prototipo ECEH 933, cuya secuencia porta la información para la síntesis de una fimbria de adherencia al enterocito (Levine y col., 1987). Asimismo, todas las cepas se hibridizaron con una sonda para determinar la presencia del factor eae, responsable de la lesión característica de las microvellosidades intestinales (Donnenberg y col., 1993). Esta sonda consiste en un fragmento KpnI-Sal II de lkbp proveniente del ADN cromosomal de una cepa de E. coli enteropato-génica, homologable con el fragmento que codifica para el mismo factor en ECEH (Jerse y col., 1990; Louie y col., 1994).

Serogrupificación y fermentación de sorbitol. La totalidad de las cepas ECEH identificadas se sometieron a una prueba de aglutinación en lámina con los sueros monovalentes O157, O26 y O111 ^R3. La prueba de fermentación de sorbitol se realizó de acuerdo a lo descrito por Ojeda y col. (1995).

RESULTADOS

Prevalencia de ECEH en bovinos y cerdos. En 39 de 136 bovinos (28.7%) y en 82 de 120 cerdos analizados (68.3%) se detectó la presencia de ECEH en su contenido intestinal.

 

Cuadro 1 Perfil toxigénico de E. coli enterohemorrágica  proveniente de bovinos y porcinos faenados en un  matadero de Santiago.  Toxygenic profile of enterohaemorrhagic E. coli isolated  from slaughtered bovine and pigs in an abattoir in Santiago.
Perfil toxigénico	Bovinos		Porcinos
Hibridización sonda	Nº cepas	%	Nº cepas	%
SLT I	29	72.5	12	14.6
SLT II	6	15.0	16	17.1
SLT I-II	5	12.5	56	68.3
Total	10	100	82	100

Caracterización de cepas ECEH. Se analizó un total de 122 cepas ECEH, 40 provenientes de bovinos y 82 de porcinos. En las heces de un bovino se encontraron 2 colonias ECEH con el mismo perfil genético pero correspondientes a 2 serogrupos distintos, por ello se consideraron como dos cepas diferentes; esta situación explica que se analizaran 40 cepas provenientes de 39 bovinos. La caracterización genotípica de las cepas aisladas en relación a factores de virulencia se presenta en los cuadros 1 y 2. En la especie bovina, el perfil toxigénico de las cepas aisladas resultó ser predominantemente SLTI (72.5%), seguido de los genotipos SLTII (15.0%) y SLTII-SLTI en asociación (12.5%). En la especie porcina, sin embargo, el genotipo toxigénico predominante fue SLTI- SLTII (68.3%), seguido de SLTII (17.1%) y en menor proporción cepas SLTI (14.6%). En relación a otros factores de virulencia, tanto en las cepas ECEH aisladas de bovino como de porcinos se observó una baja proporción de homología con la sonda para la fimbria de adherencia, 15% y 42.7%, respectivamente. No se observó una clara asociación entre el genotipo toxigénico y la presencia de fimbria de adherencia, hecho que no pudo ser comprobado dado el escaso e irregular número de cepas en cada categoría. Es importante destacar que sólo unas pocas cepas de origen bovino (14/40) fueron capaces de hibridar con la sonda eae, mientras que las de origen porcino en casi su totalidad presentaron homología con dicha sonda (80/82).

Serogrupificación y fermentación de sorbitol. Tanto en bovinos como en porcinos se identificaron cepas correspondientes a los serogrupos prevalentes en pacientes chilenos con SHU, esto es, O157, O111 y O26. En las cepas aisladas de bovino un 10% (4/40) de ellas resultaron corresponder al serogrupo O157 y un 12.5% (5/40) a los grupos O26 y O111, respectivamente. En cerdos, los valores fueron de 15.9% (13/82) para el grupo O157, 3.6% (3/82) para O26 y 6.1% (5/82) para O111. A pesar de que un número importante de cepas no reaccionaron con los tres sueros monovalentes utilizados inicialmente en este estudio, en las cepas de origen porcino se pudo constatar la presencia de otros serogrupos que, aunque en menor frecuencia, también se han asociado a pacientes con SHU y diarrea (cuadro 3). Sólo en un bovino se detectó la presencia de ECEH de dos serogrupos, O111 y O26.

Alrededor del 50% de las cepas ECEH aisladas de bovinos y cerdos fueron incapaces de fermentar el sorbitol, característica que, a pesar del escaso e irregular número de cepas, no tuvo relación con algún genotipo toxigénico ni con el serogrupo. Es importante destacar que algunas cepas del serogrupo O157 fueron capaces de fermentar el sorbitol, así como también cepas O26 y O111; de las 4 cepas O157 aisladas de bovinos, dos fueron fermentadoras de sorbitol y de las 13 cepas O157 de origen porcino, cinco de ellas fermentaron este azúcar.

DISCUSION

El análisis de los resultados revela que un porcentaje no despreciable de bovinos (28.7%) y porcinos (68.3%) faenados en un matadero de la Región Metropolitana son portadores asintomá-ticos de E. coli enterohemorrágica en sus deposiciones. Es interesante destacar que los bovinos portadores de ECEH provenían de la VII, X y Región Metropolitana. Las tasas de aislamiento observadas resultan elevadas si se comparan con estudios internacionales realizados bajo condiciones similares, donde se indican frecuencias del orden de 8 a 21% para la especie bovina y hasta de 7.5% en la especie porcina (Bülte y col., 1990; Montenegro y col., 1990; Wells y col., 1991; Wilson y col., 1992; Beutin y col., 1993).

Estas diferencias pueden ser debidas, en parte, a la metodología de detección de cepas ECEH. Generalmente la preselección de cepas ECEH se basa en la presencia de un marcador fenotípico, tradicionalmente la capacidad fermentadora de sorbitol (March y Ratnam, 1986); todas las cepas ECEH O157 aisladas de pacientes con SHU son incapaces de fermentar este azúcar y por ello para el primer aislamiento se utiliza agar sorbitol-McConkey que permite seleccionar rápidamente las colonias no fermentadoras, descartando el resto (March y Ratnam, 1986). En este estudio, por el contrario, la selección de cepas de E. coli como pertenecientes a la categoría enterohemorrágica fue de tipo genético, es decir, aquellas que fueron capaces de hibridar con las sondas asociadas a las toxinas SLTI y/o SLTII y posteriormente se les caracterizó su fenotipo. De esta forma, se observó que cepas ECEH con el mismo perfil toxigénico y del mismo serogrupo reaccionaban diferente a la prueba de fermentación de sorbitol. Esta situación ocurrió en cepas provenientes de un mismo animal como en la totalidad de ellas. Más aún, aproximadamente un 50% de las cepas ECEH O157 aisladas de bovinos y porcinos fueron sorbitol positivas. Estos resultados permiten sugerir que, al menos en las cepas de origen animal, no debieran dejar de analizarse aquellas fermentadoras de sorbitol. Hasta la fecha no se ha demostrado que cepas fermentadoras de sorbitol sean apatógenas para el hombre o que carezcan de factores de virulencia, de hecho Gunzer y col. (1992) aislaron a partir de pacientes con SHU cepas ECEH O157:H-, SLTII+ y positivas a la prueba de sorbitol. Es perfectamente factible que cepas sorbitol positivas de origen animal puedan, bajo ciertas circunstancias, no expresar su fenotipo al momento de ingresar al hombre.

Otra razón que da cuenta del mayor porcentaje de aislamiento de cepas ECEH en contenido intestinal es el número de colonias de E. coli seleccionadas por cada muestra. Analizar 10 colonias sospechosas por animal es el valor sugerido como óptimo para aumentar las probabilidades de aislar cepas ECEH entre la abundante flora bacteriana comensal del tracto intestinal (Bülte y col., 1990; Montenegro y col., 1990). De un promedio de 8 colonias de E. coli aisladas por animal, sólo tres de ellas fueron identificadas como ECEH mediante hibridización.

Parece interesante destacar el hecho de que en animales con restricción alimentaria previo a su faenamiento aumenta notoriamente la eliminación de ECEH a través de sus deposiciones (Kudva y col., 1995), situación que ocurrió en los animales analizados y que también pudo aumentar nuestras posibilidades de aislamiento.

Actualmente se reconoce que cepas vero-toxigénicas de E. coli son parte de la flora intestinal de animales domésticos sanos, pero no todas son patógenas para el hombre (Griffin  y Tauxe, 1991). La mayoría de las cepas aisladas de niños enfermos tienen propiedades comunes relacionadas directamente con la virulencia, entre ellas, producción de hemolisina, presencia de un plasmidio de 60 Mdal, inducción de lesiones "attaching" y "effacing" en células del epitelio intestinal y producción de toxina "Shiga-like" (Levine, 1987; Karch y col., 1987; Griffin  y Tauxe, 1991; Wilshaw y col., 1994). Por tanto, para predecir si las cepas aisladas de animales son potencialmente patógenas para el hombre, es necesario determinar la presencia y perfil de los factores o marcadores de virulencia. En este estudio, el claro predominio de cepas SLTI aisladas de bovino coincide plenamente con el perfil de cepas ECEH aisladas de pacientes chilenos con SHU (Cordovez y col., 1992; Prado y col., 1997). No ocurrió lo mismo con las cepas de origen porcino donde el perfil toxigénico SLTI sólo fue encontrado en un bajo porcentaje de ellas. Esta situación coincide con publicaciones europeas y americanas, que señalan la similitud del perfil toxigénico entre cepas de origen bovino y humano.

Llama la atención que la mayoría de las cepas ECEH, bovinas y porcinas, no presentaran homología con la sonda utilizada para detectar genes asociados a la fimbria de adherencia, factor de virulencia específico para la categoría y asociado a cepas patógenas para el hombre (Karch y col., 1987; Griffin y Tauxe, 1991). Esto, aparentemente debido a una pérdida del plasmidio de 60 Mdal durante el período de almacenamiento, situación descrita en otros estudios (Dorn y Angrick, 1991; Mohammad y col., 1993) o simplemente a que carecen de capacidad para adherirse al enterocito en una primera fase de la colonización.

La ausencia de homología con el factor eae en la gran mayoría de las cepas bovinas era esperable según lo señalado por Gannon y col. (1993) y Louie y col. (1994), quienes encuentran que cepas ECEH aisladas de animales diarreicos presentan con mayor frecuencia este factor en comparación con las aisladas de animales sanos. Por el contrario, la casi totalidad de las cepas de origen porcino presentaron homología con la sonda eae, situación no descrita en esta especie animal a nivel internacional (Gannon y col. (1993)3; Beutin y col., 1995) y que pudiera significar una mayor virulencia de las cepas ECEH aisladas de cerdos (Beutin y col., 1995). Los trabajos de Barret y col. (1992) y Louie y col. (1994) sugieren que la presencia de este factor sería necesaria para la expresión de todos los factores de virulencia reconocidos para la categoría, tanto en cepas aisladas de humanos como de bovinos. Nuestros resultados hacen pensar que la epidemiología del SHU en Chile es diferente, debiendo considerar a la especie porcina como un reservorio de cepas potencialmente patógenas para el hombre.

Finalmente, la presencia de serogrupos patógenos para el hombre en las cepas aisladas de bovinos y porcinos, especialmente aquellos de mayor frecuencia en Chile (O157, O26 y O111), y la presencia de factores asociados a la virulencia permiten concluir que ambas especies animales constituyen un riesgo para la salud pública en nuestro país. Especial énfasis debe darse a la eventual participación de los cerdos en la epidemiología del SHU a nivel nacional, así como también conocer la situación en otras especies animales de abasto que han adquirido importancia.

RESUMEN

Con el fin de establecer la posible participación de bovinos y porcinos en la epidemiología del SHU se analizó la presencia de cepas ECEH en contenido intestinal de animales sanos caracterizando marcadores fenotípicos y genotípicos asociados a virulencia.

Se aislaron cepas EHEC en el 28.7% de los bovinos y 68.3% de los cerdos. Las cepas EHEC fueron definidas como aquellas capaces de hibridizar, mediante técnica de estampado de colonias, con al menos una sonda para las citotoxinas (SLTI-SLTII).

El perfil toxigénico de las cepas bovinas fue predominantemente SLTI, mientras que en porcinos fue el SLTI-SLTII. Menos del 40% de las cepas aisladas de ambos animales presentaron homología con la sonda asociada a la fimbria de adherencia; un valor similar se encontró en las cepas bovinas en relación al factor eae. Llama la atención que sobre un 90% de cepas aisladas de cerdos hibridaran con la sonda para el factor eae, situación que hace pensar en un mayor riesgo para la salud pública en nuestro país.

La serogrupificación demostró la presencia, aunque en baja proporción, de cepas O157, O26 y O111 tanto en bovinos como en porcinos. Alrededor de un 50% del total de las cepas aisladas, tanto de bovinos como porcinos, fueron capaces de fermentar el sorbitol, incluyendo cepas del serogrupo O157.

La presencia de cepas EHEC O157, O26 y O111, portadoras de factores de virulencia, hacen sugerir que tanto los bovinos como porcinos constituyen, en nuestro país, reservorios de cepas potencialmente patógenas para el hombre.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la valiosa colaboración de los médicos veterinarios de turno en las dos plantas faenadoras analizadas.
____________________
Aceptado: 29.07.97.

* Proyecto FONDECYT Nº 1950736.

R1 Sigma, St. Louis, U.S.A.

R2 Gibco BRL, U.S.A.

R3 Pro Bac, Sao Paulo, Brasil.

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