Classical swine fever (CSF) is an important worldwide disease. In Chile, it is subject to a control and erradication programme.

The objective of the present assay was to standardize an immunoenzimatic technique (CIV-ELISA) that detects antibodies of the IgG type directed against the CSF virus and to compare it with seroneutralization.

Twenty hybrid Landrace x Large White pigs with a live weight of 20 kg were used. They were experimentally inoculated with a dose of 100.000 TCID₅₀ of the Quillota virulent isolate of the CSF virus. A four-pig group was vaccinated 14 days before inoculation. Blood samples were taken 3, 6, 9, 12 and 14 days post-inoculation. Serological samples were obtained from 100 sows. The anti-CSF antibodies were determined for a policlonal CIV-ELISA and were compared with a seroneutralization test (serological official test).

The CIV-ELISA test did not detect antibodies in the experimentally inoculated pigs until day 14 post-inoculation. However, the positive-sera condition of previously vaccinated pigs was ratified by the seroneutralization test.

The sensibility and specificity of the CIV-ELISA was about 90.1% and 76.4% respectively. The CIV-ELISA is an easy-to-apply test and the results obtained are similar to those obtained with seroneutralization.

Palabras claves: peste porcina clásica, diagnóstico, ELISA.

Key words: classical swine fever, diagnosis, ELISA.

INTRODUCCION

La peste porcina clásica (PPC) es la enfermedad viral más importante de la producción porcina mundial, debido a su gran poder de diseminación, por lo que está presente en un gran número de países productores de cerdos (Gómez-Tejedor y Valenciano, 1994). En Chile, está sometida a un estricto programa de control y erradicación, no observándose brotes desde 1993 (Adriazola, 1994)

Es producida por un pestivirus estrechamente relacionado a otros virus de importancia económica como son el virus de la diarrea viral bovina (DVB) y el virus de la enfermedad de las fronteras de los ovinos (EF) (Moennig y col., 1990). En forma natural, la PPC afecta a los suidos domésticos y salvajes, y experimentalmente la enfermedad se ha reproducido en animales de laboratorio, siendo el conejo el hospedador heterólogo más importante, ya que en esta especie se logró desarrollar una vacuna (vacuna cepa china lapinizada) (Dahle y Liess, 1992).

En los últimos años se han logrado extraordinarios avances en relación a los aspectos moleculares del virus, lo que también ha significado mejorar las técnicas tradicionales de diagnóstico (Wensvoort y col., 1989). En un principio, éste se basa en los antecedentes y hallazgos de terreno, los que son confirmados por pruebas de diagnóstico in vivo e in vitro (Pearson, 1992). Las técnicas in vitro como la inmunofluorescencia directa (IFD), indirecta (IFI) (Fenner y col., 1992; Rosell y col., 1994) y el aislamiento del virus en cultivos de células PK-15 (Terpstra, 1991 Rosell y col., 1994), utilizan tejidos de los animales sospechosos, por lo que solamente sirven como método de diagnóstico confirmativo en un posible brote de la enfermedad. Por esta razón, en la actualidad se ha intentado desarrollar, principalmente, pruebas in vivo, las que agrupan distintas técnicas serológicas que pueden aplicarse a un gran número de animales y son de especial interés para controlar los focos de la enfermedad, permitiendo su rápido diagnóstico y eliminación (Have, 1984; Koenen y col., 1992; Rosell y col., 1994).

Los anticuerpos contra el virus de la PPC pueden ser detectados por diferentes métodos, como seroneutralización (SN) y técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) (Saunders, 1977; Wensvoort y col., 1988; Schagemann y col., 1991; Koenen y col., 1992; Rosell y col., 1994), siendo su detección muy útil en hembras sospechosas de estar infectadas con cepas de baja virulencia. Por otra parte, también se pueden encontrar en cerdos anticuerpos contra virus DVB (Dahle y Liess, 1992; Jensen, 1981), dificultando el diagnóstico de la PPC; por esta razón se recomienda utilizar, preferentemente,  aquellas  pruebas  que  logran diferenciar los anticuerpos dirigidos contra el  virus de la PPC de los antivirus DVB, como son las técnicas que utilizan anticuerpos monoclonales  (Leforban  y  col.,  1987;  Leforban  y  col., 1990; Wensvoort y col., 1986; Wensvoort y col., 1988).

Actualmente, muchos países utilizan para sus programas de control y erradicación de la enfermedad las técnicas de SN y ELISA (Rosell y col., 1994). Una ventaja adicional que ofrecen las técnicas ELISA sobre las demás técnicas es la rapidez, sin que esto implique una pérdida en la sensibilidad. Las técnicas de ELISA permiten procesar un gran número de muestras, por lo que son de gran utilidad en áreas o países donde la PPC es esporádica o desea erradicarse (Rosell y col., 1994). Así, para el control de la enfermedad en países europeos esta técnica fue usada como prueba "screening" para la detección de los animales enfermos o portadores (Wensvoort y col., 1988). Sin embargo, este método no logra diferenciar anticuerpos vacunales de los debidos a infección por virus de campo, y por lo tanto para interpretar correctamente los resultados serológicos deben tenerse en cuenta la situación de cada país y los programas de vacunación que se utilizan.

El presente trabajo compara los resultados obtenidos con un ELISA policlonal y la técnica de SN, con el fin de aportar nuevos antecedentes en el diagnóstico serológico de la enfermedad.

HIPOTESIS. Se postula que la prueba de ELISA presenta igual sensibilidad que la SN, que se usa como prueba de "screening" en el programa de erradicación de la PPC en Chile.

MATERIAL Y METODOS

En el presente estudio se analizaron mediante las técnicas de ELISA y SN un total de 149 sueros provenientes de cerdos inoculados experimentalmente con el virus de la PPC y de muestras de hembras reproductoras de planteles industriales.

1. OBTENCION DE LAS MUESTRAS SEROLOGICAS

1.1. Animales experimentales. Para el estudio de la PPC experimental se utilizaron 20 cerdos híbridos Landrace x Large White de 20 kg de peso vivo al inicio de la experiencia. Con ellos se constituyeron 5 grupos de 4 cerdos cada uno, 4 grupos correspondientes a animales inoculados experimentalmente sin vacunar, y el quinto grupo estuvo formado por 4 animales vacunados e inoculados. Los animales permanecieron en corrales, debidamente separados por grupos en dependencias del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG).

1.1.1. Cerdos inoculados experimentalmente no vacunados. Los 4 grupos de cerdos fueron inoculados experimentalmente con una dosis de 100.000 DICT₅₀ del aislado virulento Quillota del virus PPC. La toma de muestras se realizó de la siguiente manera:

- Grupo 1. Se recolectaron muestras a los 3 días post-inoculación (dpi).
- Grupo 2. Se recolectaron muestras a los 3 y 6 dpi.
- Grupo 3. Se recolectaron muestras a los 3, 6 y 9 dpi.
- Grupo 4. Se recolectaron muestras a los 3, 6, 9, 12 y 14 dpi.

1.1.2. Cerdos vacunados e inoculados experimentalmente. Este grupo estuvo constituido por 4 cerdos, los cuales fueron vacunados con una dosis de vacuna comercial diluida 160 veces (1/160). Luego de 14 días, los cerdos fueron inoculados de la misma manera como el grupo anterior. De estos animales también se recolectaron muestras a los 3, 6, 9, 12 y 14 dpi.

De todos los animales inoculados experimentalmente, se llevó un registro de temperatura corporal por 28 días (desde el día de la vacunación hasta el día del sacrificio del último cerdo, 14 dpi).

1.2. Hembras reproductoras. Para ello se utilizaron 100 sueros provenientes de hembras reproductoras, aportados por el SAG. Las muestras fueron obtenidas en planteles industriales localizados en áreas de mayor riesgo epidemiológico durante los brotes de la enfermedad el año 1993.

En cada muestreo se obtuvieron 10 ml de sangre por cerdo, y se dejaron reposar hasta que la sangre coaguló. Posteriormente los tubos fueron centrifugados y los sueros almacenados en congelación (-20° C) hasta el momento de su análisis.

2. DETERMINACION DE LOS ANTICUERPOS

La determinación de los anticuerpos se realizó mediante la técnica de SN en el Laboratorio de Virología del SAG, y la prueba de ELISA (CIV-ELISA policlonal, Girona, España) en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Concepción.

Para la interpretación de la prueba de ELISA se consideraron como negativos los sueros con menos de un 40% de inhibición, sospechosos entre 40 y 50% de inhibición y positivos con más de un 50% de inhibición.

3. ANALISIS DE RESULTADOS

La cinética de los anticuerpos séricos fue graficada por una curva de regresión cuadrática (y = a+bx+cx²), en que los dpi se grafican en el eje "X" y el % de inhibición en el eje "Y". La comparación entre el CIV-ELISA y la técnica de SN incluyó:

- 39 de 40 muestras correspondientes a cerdos inoculados experimentalmente no vacunados, ya que el volumen de suero obtenido en un animal no permitió realizar ambas pruebas.
- 10 muestras correspondientes a cerdos vacunados e inoculados experimentalmente. De las 20 muestras a las que se les realizó ELISA, sólo a 10 de ellas se les realizó SN.
- 100 muestras de hembras reproductoras.

En total la comparación incluyó 149 muestras analizadas con ambas técnicas; con los resultados fue posible determinar sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos.

Las fórmulas utilizadas fueron las siguientes (Jenicek, 1987) :
 

Sensibilidad	=	VP
			x 100
		VP + FN

En que:
VP: Verdaderos positivos (positivos a SN y ELISA)
FP: Falsos positivos (positivos a ELISA y negativos a SN).
FN: Falsos negativos (negativos a ELISA y positivos a SN).
VN: Verdaderos negativos (negativos a SN y ELISA).

ANALISIS ESTADISTICO

Para determinar si ambas pruebas son similares, se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba de McNemar.

RESULTADOS

Cerdos inoculados experimentalmente no vacunados. La totalidad de los sueros analizados con el CIV-ELISA entre los 3 y 14 dpi resultaron negativos (% de inhibición <40). Los resultados se presentan como porcentajes de inhibición en la tabla 1, observándose valores de 24.25, 20.00, 28.27, 29.40 y 30.80 a los 3, 6, 9, 12 y 14 días post-inoculación, respectivamente.

La cinética de anticuerpos séricos entre los 3 y 14 dpi se grafica de acuerdo a los promedios grupales en la figura 1; en ella es posible observar que ninguna muestra alcanzó positividad, presentándose la totalidad de ellas bajo el umbral de 40% de inhibición hasta el momento del último muestreo (14 dpi). Sin embargo, la tendencia de la curva es ir en aumento, indicando claramente un incremento de la cantidad de anticuerpos séricos.

Cerdos vacunados e inoculados experimentalmente. Los resultados se presentan como porcentajes de inhibición en la tabla 2, observándose valores de 22.70, 30.75, 45.70, 58.00 y 60.25 a los 3, 6, 9, 12 y 14 días post-inoculación respectivamente.

La cinética de los anticuerpos séricos desde los 3 a los 14 dpi se grafica en la figura 1; en ella se observa un aumento progresivo en la concentración de anticuerpos séricos, los que a los 9 dpi alcanzan el umbral o área sospechosos y desde los 12 dpi son considerados como positivos en ELI-SA con porcentajes de inhibición mayores a 50%.

Grupo de muestras de hembras reproductoras provenientes de planteles industriales. Los resultados del ELISA en este grupo se presentan en la tabla 3; en ésta se observa que un alto porcentaje de los sueros analizados fueron positivos (86.0%), un 5% correspondió a sueros dudosos y un 9.0% resultó negativo.

Comparación de la técnica ELISA con la SN. Los resultados de esta comparación se muestran en la tabla 4; de acuerdo a ellos, la sensibilidad del CIV-ELISA en relación a la prueba de SN es de un 90.1% (82/91), la especificidad relativa del ELISA es de un 76.4% (39/51), la eficiencia relativa del ELISA correspondió a un 64.0% (91/142), el área sospechosa es de un 4.7% (7/149), los falsos positivos son un 8.0% (12/149) y los falsos negativos correspondieron a un 6.0% (9/149).

ANALISIS ESTADISTICO

Mediante la prueba de McNemar se determinó que no existen diferencias estadísticamente significativas (p > 0.05) entre los resultados obtenidos por SN y CIV-ELISA.

Tabla 1 Porcentajes de inhibición obtenidos de los animales inoculados  experimentalmente; promedios grupales (X) desviación estándar (D.S.) y coeficiente de variación (C.V.)  Inhibition (%) obtained from inoculated animals. Average (X), standard deviation (S.D.) and variation coefficient (V.C.)
Variables	Días post-inoculación
	3	6	9	12	14
X	24.25	20.00	28.27	29.40	30.80
D.S.	4.05	4.61	4.76	3.35	3.78
C.V.	16.70	23.00	16.80	11.40	12.20
Nº	16	12	8	4	4

Figura 1. Porcentajes de inhibición obtenidos con la prueba CIV-ELISA en cerdos inoculados y cerdos vacunados e inoculados experimentalmente. Muestreo entre los 3 y 14 dpi.

Inhibition (%) obtained with CIV-ELISA in inoculated and experimentally vaccinated-inoculated pigs. Samples were obtained between 3 and 14 dpi.

DISCUSION

El diagnóstico serológico de la PPC en nuestro país se ha realizado utilizando la prueba de SN; sin embargo, en los últimos años muchos países han incorporado técnicas que ofrecen mayor facilidad, rapidez y economía, entre ellas se encuentran las pruebas ELISA (Saunders, 1977; Wensvoort y col., 1988; Schagemann y col., 1991; Koenen y col., 1992; Rosell y col., 1994) que, aunque cumplen con las características antes mencionadas, aún no son usadas para el diagnóstico de la enfermedad en Chile.

En este ensayo se utilizó un ELISA policlonal de competición que detecta IgG producida en respuesta a la vacunación e infección por virus PPC. Los resultados obtenidos mediante este método fueron comparados con la técnica de SN, que es la prueba oficial en Chile para el diagnóstico serológico de la PPC, junto con la IFD y cultivo celular en células PK-15 (Quinteros, 1994).

En el grupo de cerdos inoculados experimentalmente (sin vacunar) todos los animales fueron seronegativos a la prueba de ELISA, producto probablemente de una débil respuesta antigénica inicial de los cerdos al virus en esta primera etapa. Al respecto, Wensvoort y col. (1988) sólo detectaron anticuerpos después de 21 dpi (41% de inhibición), alcanzando un 65% de inhibicíón a los 28 dpi. Una forma de diagnosticar la enfermedad más tempranamente la constituye la utilización de un ELISA que detecta antígenos en la fase virémica de la enfermedad, como ya ha sido utilizado recientemente por Depner y col. (1995), quienes encontraron con este método animales positivos a partir de los 9 dpi. En este mismo grupo sólo un animal resultó positivo a la SN, presentando bajos títulos de anticuerpos.

Tabla 3  Porcentajes de inhibición obtenidos en 100 muestras de hembras  reproductoras de planteles industriales.  Inhibition (%) obtained in one hundred sows from breeding pig farms.
	ELISA (+)	ELISA (?)	ELISA (-)	Total
Nº muestra	86.0	5.0	9.0	100
Porcentaje (%)	86.0	5.0	9.0	100

En el grupo de cerdos vacunados e inoculados se observó un incremento de los anticuerpos séricos, a diferencia del grupo anterior. Esto se debería a que las muestras pertenecen a animales que recibieron un estímulo antigénico previo (dosis vacunal diluida 1/160); también cabe destacar que el monitoreo de anticuerpos séricos es más extenso, desde los 18 a los 29 días post-vacunación. Estos resultados demuestran que los anticuerpos detectados por el ELISA provienen principalmente del estímulo vacunal, ya que ésta es la única característica que diferencia a este grupo de cerdos con el grupo anterior. Resultados similares a éstos han sido obtenidos por Dahle y Liess (1996), quienes detectaron respuesta de anticuerpos neutralizantes al virus vaccinal después de la segunda semana post-vacunación. Por otra parte, Wensvoort y col. (1988), utilizando un CTB-ELISA monoclonal, detectaron animales seropositivos a anticuerpos neutralizantes desde los 35 días post-vacunación. El CIV-ELISA utilizado en esta investigación reconoce anticuer-pos desde los 23 días post-vacunacion.

Por la técnica de SN nueve animales de este grupo presentaron anticuerpos, de los cuales siete resultaron positivos y dos sospechosos a la prueba de ELISA.

Moennig y col. (1990) realizaron un monitoreo serológico durante 14 semanas utilizando un ELISA de captura, logrando detectar anticuerpos tan temprano como la SN (con títulos desde la tercera semana), que se mantuvieron durante todo el período de muestreo. En el grupo de hembras reproductoras provenientes de planteles industriales se observó un alto porcentaje de sueros positivos al ELISA (86%), debido a que pertenecen a planteles que vacunan periódicamente. Por otra parte, aquellas muestras que no presentaron una cantidad de anticuerpos suficientes para ser detectadas por el ELlSA, pueden pertenecer a casos individuales de vacunación poco exitosa o a cerdos con una respuesta inmune deficiente, que en un futuro podrían provocar riesgos epidemiológicos.

Los resultados obtenidos en este grupo de muestras indican que el CIV-ELISA es efectivo para detectar anticuerpos vacunales o inducidos por infecciones; sin embargo, la prueba no puede discriminar el origen de ellos debido a que detecta IgG. En la actualidad no existen métodos serológicos que permitan diferenciar entre los anticuerpos de origen vaccinal y los producidos en la enfermedad natural (Wensvoort y col., 1988). Con la prueba de SN se obtuvo un 87% de sueros positivos a la PPC en este grupo.

Al comparar el CIV-ELISA con la SN se observa que la sensibilidad y especificidad de este ensayo fue de un 90.1 y 76.4%, respectivamente, valores más bajos que los observados por Yu y col. (1988), quienes compararon un ELISA modificado (virus vacunal de la cepa China, liofilizado) con la SN, obteniendo una sensibilidad y especificidad de un 100 y 92.2%, respectivamente.

Sin embargo, la cinética de los anticuerpos mostrada por Yu y col. (1988) fue similar a la que se obtuvo en este estudio. Las muestras consideradas como falsos negativos (muestras negativas a ELISA y positivas a SN) fueron de un 6.0%, y los resultados falsos positivos (muestras positivas a ELISA y negativas a SN) fueron de un 8.0%. Los resultados falsos positivos podrían corresponder a sueros infectados con virus DVB, ya que el ELISA policlonal no logra discriminar entre estos pestivirus, situación que se podría aclarar usando un ELISA monoclonal, el cual ya se está utilizando en los países declarados libres de PPC (Edwards y col., 1991; Terpstra, 1991; Wensvoort y col., 1988; Rosell y col., 1994). También la SN puede discriminar entre PPC y DVB utilizando diluciones iniciales elevadas de los sueros problemas, descartando las infecciones por virus DVB; el título que logran los anticuerpos dirigidos contra el virus de la PPC es muy alto, a diferencia de aquel inducido por el virus DVB en cerdos que es bajo (Rosell y col., 1994).

Los resultados obtenidos en este ensayo muestran que el CIV-ELISA podría ser muy útil para detectar el nivel de anticuerpos en grupos de cerdos representativos de los diferentes planteles del país, e incorporarlos a los programas de erradicación de esta enfermedad, ya que la prueba de ELISA es fácil de realizar en un gran número de muestras, no presenta diferencias significativas para el diagnóstico comparada con la SN y resulta más económica que otras técnicas.

Debido a que no hay publicaciones referentes a la utilización de ELISA para PPC en Chile, los resultados obtenidos con el CIV-ELISA podrían servir para sentar las bases de posteriores investigaciones con ELISA monoclonales, que son específicos y más sensibles y que es imperativo utilizarlas cuando un país desea ser reconocido internacionalmente como libre de la PPC según la CEE.

RESUMEN

La peste porcina clásica (PPC) es una enfermedad de gran importancia mundial. En Chile está sometida a un programa de control y erradicación.

El presente ensayo tuvo como objetivo estandarizar y comparar una técnica inmunoenzimática (CIV-ELISA) que detecta anticuerpos del tipo IgG dirigidos contra el virus de la PPC, con la seroneutralización (SN), técnica oficial para el diagnóstico serológico.

Se utilizaron 20 cerdos híbridos Landrace x Large White de 20 kg de peso vivo, los que fueron inoculados experimentalmente con una dosis de 100.000 DICT50 del aislado virulento Quillota del virus PPC. Un grupo constituido por 4 cerdos fue vacunado 14 días antes de la inoculación. Se tomaron muestras de sangre a los 3, 6, 9, 12 y 14 días post-inoculación. Además, se obtuvieron muestras serológicas de 100 hembras reproductoras. Los anticuerpos anti-PPC fueron determinados por un CIV-ELISA policlonal, realizándose comparación con la prueba de SN.

La prueba CIV-ELISA no detectó anticuerpos en los cerdos inoculados experimentalmente hasta los 14 días post-inoculación.

Sin embargo, los cerdos vacunados previamente fueron seropositivos, situación ratificada por la SN.

La sensibilidad y especificidad del CIV-ELISA fue de 90.1% y 76.4%, respectivamente. El CIV-ELISA demostró ser una prueba de fácil aplicación y los resultados son similares a los de la SN.
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Aceptado: 13.08.97.

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