The indirect immunoperoxidase and immunofluorescence methods were standardized for the detection of Aujeszky's disease virus in Vero cell cultures, using as a model the RC/79 strain virus."
There was a strong correlation in the results obtained by both methods. The results proved to be highly specific for the identification of the virus and allowed a precise localization of the viral antigen in infected cells. The presence of syncytia with a strong reaction in the nuclear region 16 hours p.i. indicated that RC/79 strain is strongly virulent. This conclusion was supported by the results obtained from experimental rabbit infection. The animals were inoculated with different doses of the virus (102-105 PFU). In all the cases the mortality rate was 100%, even when animals received minor doses of the virus, indicating no dose response. The mean death time was 62 and 120 hours p.i. for the different doses used. Between 6 and 24 hours prior to death, all rabbits presented an exudative lesion in the inoculation area and extensive pruritus.
The methods employed were useful as virulence markers of the RC/79 strain virus and on the other hand, they constitute essential tools in the diagnosis of Aujeszky's disease virus.
Palabras claves: Virus Aujeszky, cepa RC/79, marcadores de virulencia, inmunohistoquímica.
Key words: Aujeszky's virus, RC/79 strain, virulence markers, immunohistochemistry.
INTRODUCCION
La enfermedad de Aujeszky (EA) o su sinónimo, pseudorrabia, es una enfermedad infecciosa de etiología viral que con muy pocas excepciones es aguda, caracterizándose por producir alteraciones en el SNC y trastornos reproductivos y respiratorios. En la naturaleza la infección ocurre más a menudo en el cerdo, su huésped natural, así como en ganado vacuno, ovejas, perros y gatos (Baskerville y col., 1973). Todas las especies son huéspedes terminales en la cadena epidemio-ló-gica ya que siempre mueren, a excepción del cerdo, donde la tasa de mortalidad varía dependiendo de la edad (Akkermans, 1963). El cerdo es el eje fundamental en la epizootiología de la EA, ya que si se recupera de esta afección, permanece latentemente infectado y es el principal reser-vorio y diseminador del virus (Beran y col., 1980).
Desde el primer diagnóstico de pseudorrabia en Argentina en 1978 (Ambrogi y col. 1981), se ha mostrado una incrementada incidencia de la enfermedad en las principales cuencas de producción porcina nacional (Echeverría y col., 1989, Pereyra y col., 1989; Zanon y col., 1991).
Ante esta realidad y no habiéndose establecido aún, a nivel oficial, un plan de lucha apropiado contra la enfermedad, se hace necesario realizar investigaciones epidemiológicas. Las mismas son parte integral de los programas de control que pudieran implementarse y que requieren de medios efectivos para la identificación de cepas de virus de la pseudorrabia que pudieran aislarse. Por otra parte, cualquier laboratorio que forme parte de la estructura de un programa de control de la enfermedad necesitar· contar con herramientas diagnósticas estandarizadas.
En este estudio hemos intentado poner a punto los métodos diagnósticos referenciales (técnicas inmunohistoquímicas indirectas: inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia y la inoculación de conejos) para la identificación del virus de la EA y hemos evaluado la utilidad de las mismas como marcadores de virulencia para la cepa RC/79 del virus de la pseudorrabia.
MATERIAL Y METODOS
Virus. La cepa viral RC/79 de la EA aislada por primera vez en la Argentina (Ambrogi y col., 1981) fue utilizada para la inoculación en conejos y sirvió como antígeno para las técnicas inmunohistoquímicas. El título del stock viral fue de 109 UFP/ml determinado sobre monocapas de células Vero por el método de placas de lisis (Dulbecco,1962).
Animales de experimentación. Se utilizaron 8 conejos hembras New Zealand blancos (Oryctolagus cuniculus) de 1.4 a 2.3 kg de peso y 1.5 a 2.5 meses de vida, provistos por el Bioterio Central de la Universidad Nacional de Río Cuarto.
Ensayos de patogenicidad. Para determinar la virulencia de la cepa RC/79 en conejos los mismos fueron inoculados con 1 ml de la suspensión viral en medio de mantenimiento (medio esencial mínimo de Eagle, suplementado con 2% de suero fetal bovino, 30 µg/ml de gentamicina y 1% de glutamina, pH 7.2-7.4) (MEM). La inoculación se realizó por vía subcutánea en el flanco dorsal inferior.
Para analizar la influencia de la dosis viral sobre la respuesta clínica, tres de los animales recibieron 102 UFP/ml, los cinco restantes fueron inoculados con 105 UFP. La observación de los síntomas se extendió todo el tiempo que el ensayo lo permitió, no superando las 120 postinoculación (p.i.) en promedio.
Todos los animales fueron mantenidos en las salas del bioterio a temperatura ambiente en jaulas individuales.
Cultivos celulares. Para las técnicas inmunohistoquímicas fue utilizada la línea celular Vero, pasaje 35, procedente del ABAC (Asociación Banco Argentino de Células, ciudad de Pergamino). Las monocapas celulares fueron desarrolladas con MEM suplementado con 8% de suero fetal bovino, en policubetas de 24 orificios sobre laminillas de vidrio y recibieron una dosis viral de 103 UFP/ml.
Antisueros. El suero específico antivirus Aujeszky cepa RC/79 fue obtenido de cerdos naturalmente infectados, provenientes de un establecimiento porcino con antecedentes de infección por dicha cepa y con alto título de anticuerpos neutralizantes, determinado por microseroneutralización (Hill y col., 1977).
Los anticuerpos secundarios empleados en las reacciones fueron adquiridos comercialmente. Se utilizó suero anti y globulina de cerdo marcada con peroxidasa, producido en cabra (Dako Corporation) y suero anti g globulina de cerdo, producido en conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (Dako Corporation).
Detección del antígeno viral. A las 4, 16, 24 y 36 horas luego de la inoculación de los cultivos celulares, los mismos fueron lavados con solución salina bufferada (PBS) fijados con acetona fría, secados al aire y cubiertos con suero antivirus Aujeszky diluido 1:20. Los cultivos fueron incubados en cámara húmeda a 37º C por 60 minutos, lavados con 3 cambios de PBS + 1% de albúmina sérica bovina por 15 minutos y luego tratados con el anticuerpo secundario.
Inmunoperoxidasa indirecta (IPI). Previo al desarrollo de la reacción las laminillas con células infectadas fueron tratadas con H2O2 al 1% en PBS durante 30 minutos a 37º C para remover la peroxidasa endógena celular.
El suero anti g globulina de cerdo marcado con peroxidasa se utilizó diluido 1:200. Luego de 60 minutos de incubación a 37º C, las laminillas fueron lavadas con PBS como se describió y se secaron. La actividad enzimática se demostró tratando los cultivos durante 10 minutos con una solución al 0.05% de 3.3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride (Fluka AG, Buchs SG) en buffer tris-HCl, 0.05 M (pH 7.6) conteniendo 0.01% de H2O2. Las laminillas fueron lavadas con agua destilada, deshidratadas y montadas con bálsamo de Canadá. Las observaciones morfológicas fueron realizadas en microscopio de luz. Los controles incluyeron cultivos celulares sin infectar tratados de idéntica manera, cultivos infectados tratados con suero normal de cerdo y cultivos infectados tratados solamente con la antiglobulina de cerdo marcada con peroxidasa.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Para esta reacción se siguieron pasos similares a los descritos en la técnica anterior, sólo que el anticuerpo secundario estuvo marcado con el fluorocromo indicado y la lectura se realizó montando las laminillas sobre portaobjetos con glicerina al 10% en PBS. Se empleó para la lectura un microscopio de luz U.V. (Carl Zeiss, Axiophot).
RESULTADOS
Infección experimental en conejos. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de las pruebas de inoculación en conejos. Los mismos fueron infectados con distintas concentraciones de virus, las que variaron de 102 a 105 UFP/ml, no registrándose modificaciones en la respuesta clínica en esos rangos ya que todos los animales murieron.
En cada uno de ellos se observaron períodos de excitación nerviosa, durante los cuales se movían violentamente dentro de las jaulas, seguidos de períodos de tranquilidad. También se observó en cada animal un marcado prurito en el sitio de inoculación que ocurrió entre las 6 y 24 horas previas a la muerte. Como consecuencia del prurito se mordisquearon salvajemente en la zona de inyección, llevando a una automutilación y haciendo que esa zona mostrara un contorno completamente depilado, con abrasión cutánea y con un exudado serosanguinolento (figura 1).
Figura 1. Conejo inoculado subcutáneamente con la cepa RC/79 del virus de pseudorrabia, que muestra depilación y abrasión de la piel en el sitio de la inoculación. White rabbit subcutaneously inoculated with pseudorabies virus RC/79 strain showing skin depilation and abrasion at the inoculation site.
Los conejos que recibieron menor dosis de virus tardaron en morir 120 horas p.i. en promedio, su tiempo medio de muerte fue de 1.9 veces mayor que los 5 animales que recibieron 105 UFP y que murieron entre las 54 y 66 horas p.i.
Técnicas inmunohistoquímicas indirectas. En la reacción de IPI, las monocapas teñidas 4 h p.i. no mostraron cambios cuando se las comparó con los cultivos controles. Después de 8 h, un depósito marrón difuso indicando la presencia del antígeno viral apareció en el núcleo de algunas células infectadas. En los estadios posteriores el número de esas células se incrementó considerablemente y a las 16 h p.i. la reacción positiva ocurrió también en el citoplasma (figura 2).
Figura 2. Cultivo celular infectado examinado a las 16 h p.i. El antígeno viral determinado por inmunoperoxidasa aparece en núcleo y en citoplasma (40 X). Tissue culture infected and examined 16 hours after infection. The viral antigen determined by immunoperoxidase assay appears in the nucleus and cytoplasm of infected cells. X 40.
A las 24 h p.i. el antígeno viral fue localizado principalmente en el citoplasma y muy pocas células mostraron el antígeno en núcleo (figura 3).
Figura 3. Cultivo celular infectado examinado 24 h p.i. El antígeno viral determinado por inmunoperoxidasa aparece principalmente en citoplasma (20 X). Tissue culture infected and examined 24 hours after inoculation. The viral antigen, determined by immunoperoxidase assay, appears mainly in the cytoplasm. X 20.
Los cultivos controles sin infectar no mostraron tinción de fondo inespecífica, indicando que la eliminación de la peroxidasa endógena fue efectiva (figura 4). Los controles de células infectadas tratadas con el suero normal de cerdo mostraron un fondo de tinción inespecífica que fue fácil de distinguir de lo observado en las células infectadas (figura 5).
Figura 4. Cultivo celular sin infectar. No se detectó producto de reacción (40 X). Uninfected cell culture. No reaction product is detected. X 40.
Figura 5. Cultivo celular infectado tratado con suero normal de cerdo. No se detectó producto de reacción (20 X). Infected cell culture treated with normal pig serum. No reaction product is detected. X 20.
Un análisis comparativo de los resultados logrados entre la IPI y la IFI permitió observar una fuerte correlación entre ambas técnicas. La figura 6A muestra la presencia del antígeno viral a las 16 h p.i.; la fluorescencia fue detectada tanto en núcleo como en citoplasma; en esa imagen es posible ver la presencia de células multinucleadas o sincitios con marcada tinción intranuclear. El examen de antígenos virales a las 24 h p.i. en los cultivos infectados, permitió detectarlos principalmente en citoplasma , como puede verse en la figura 6B.
Figura 6. A) Cultivo celular infectado examinado 16 h p.i. El antígeno viral, detectado por inmunofluorescencia, aparece en núcleo y en citoplasma (20 X). Nótese la presencia de células multinucleadas (sincitios). B) Cultivo celular infectado examinado 24 h p.i. El angíteno viral, detectado por inmunofluorescencia, aparece principalmente en citoplasma (20 X). A) Tissue culture infected and examined 16 hours after infection. The viral antigen detected by immunofluorescence assay appears in the nucleus and cytoplasm. X 20. Note syncytia, resulting from cell fusion. B) Tissue culture infected and examined 24 hours after infection. The viral antigen detected by immunofluorescence assay appears mainly in the cytoplasm. X 20.
Los cultivos controles sin infectar no dieron muestra de reacción específica. Idénticos resultados se lograron cuando los cultivos infectados fueron tratados con suero normal de cerdo.
DISCUSION
Pruebas de inoculación en conejos. Si se observa con precisión el proceso clínico de la enfermedad y las circunstancias enzoóticas, junto con el examen detallado de las lesiones anatómicas e histopatológicas, puede ya establecerse el diagnóstico de la EA en la mayoría de los casos. En los exámenes de rutina, la identificación histológica de los cuerpos de inclusión intranuclea-es patognomónicos insume demasiado tiempo, puesto que hace necesario la obtención de cortes por inclusión en parafina. La identificación directa del agente etiológico por medio de la inmunofluorescencia directa es también posible en la EA, pero exige un contenido vírico de aproximadamente 103-104 DI50/g de tejido (Albrecht y col., 1963; Sabó y Rajcani, 1970). Ante estas circunstancias, en el intento de diagnóstico en el menor tiempo posible, se utilizan como ideales las inoculaciones experimentales en conejos. Ciertamente la inyección de conejos por vóa subcutánea con una suspensión de tejido animal, sospechoso de contener virus Aujeszky, fue descrita por los primeros investigadores de esta enfermedad de una manera muy empírica (Aujeszky, 1902; Hutyra, 1910; Koves y Hirt, 1934; Shope, 1934), informándose la elevada receptividad de estos animales al virus de la EA, con manifestación de prurito característico y la aparición de una lesión rezumante en el flanco, tras la inoculación.
En un intento de caracterizar al virus de la pseudorrabia (VPR), Platt y col. (1979) trabajaron con 11 cepas americanas aisladas a campo y 2 cepas vacunales europeas, basando el análisis en la sensibilidad térmica de las mismas y en la virulencia en conejos. Las cepas virales fueron subsecuentemente categorizadas en uno de 3 grupos de acuerdo a su termoestabilidad (resistentes al calor, moderadamente resistentes al calor y termosensibles); y en 3 grupos de acuerdo a su habilidad para infectar clínicamente a conejos, su habilidad para producir prurito y el tiempo requerido para matarlos. En esta última categoría las cepas podían ser de tipo I cuando la tasa de infección clínica fue menor del 25%, de tipo II cuando no producían prurito y el tiempo medio de muerte (TMM) fue mayor de las 78 horas p.i. y de tipo III o fuertemente virulentas, cuando producían prurito y el TMM fue menor a las 66 horas p.i. Estos autores demostraron que la cinética de inactivación térmica y los parámetros usados para comparar VPR en conejos pueden ser usados para diferenciar efectivamente cepas atenuadas de aislados de VPR a campo, facilitando las investigaciones epidemiológicas. Entre los virus estudiados se encontraban las cepas atenuadas K y BUK, las que mostraron ser altamente resistentes al calor y en relación a su capacidad para infectar clínicamente a conejos, cayeron en las categorías I y II, respectivamente. Estos resultados fueron contrapuestos a los que lograron con la cepa virulenta Be (entre otras de las cepas virulentas estudiadas) que evidenció una tasa de 100% de mortalidad en conejos y mostró ser termosensible. De los ensayos de Platt y col. (1979) se desprende que cuando una cepa es fuertemente virulenta genera todos los síntomas clínicos descritos en los conejos y muestra a su vez ser sensible a la acción del calor.
En este estudio hemos mostrado que la cepa RC/79 generó el 100% de mortalidad en conejos confirmando su carácter de cepa virulenta, tal como fue considerada desde su primer aislamiento avalado por los antecedentes de haber generado el 80% de mortalidad en lechones (Ambrogi y col., 1981). El carácter virulento de la cepa RC/79 está apoyado a su vez por la ausencia de dosis respuesta cuando los animales fueron inoculados con 102 a 105 UFP, ya que trabajando con dosis menores de virus lo único que se modificó fue el tiempo medio de muerte, pero en todos los casos la letalidad en conejos fue del 100% (tabla 1).
El marcador "conejo" puede servir en estudios epidemiológicos facilitando el diagnóstico de la pseudorrabia, permitiendo distinguir cepas virulentas de atenuadas, constituyéndose en una herramienta útil para analizar aislados virales naturalmente atenuados que se puedan usar como agentes vacunales y/o para monitorear el grado de atenuación de cepas virales que sufran modificaciones de laboratorio.
Hay que destacar que ciertos autores (Gordon y Luke 1955; Christov y col., 1966) han descrito que puede haber cepas del virus de la EA que ocasionaron alta mortalidad a campo, pero que no producen prurito en conejos cuando son inoculados intracerebralmente o subcutáneamente a menos que hayan sufrido 2 ó3 pasajes. Esta aseveración reafirma el hecho de que la cepa RC/79, al generar los síntomas de prurito y muerte con sólo un pasaje subcutáneo en conejo y con dosis menores de virus (102 UFP), es fuertemente virulenta.
Con estas experiencias, además de caracterizar la cepa viral en cuestión, hemos puesto a punto una herramienta diagnóstica valiosa, disponible en nuestro laboratorio y posible de aplicar en un programa de control y/o erradicación de la EA. Se ha informado que los conejos no son más sensibles que los cultivos celulares a la presencia del virus (McFerran y Dow, 1962), pudiéndoselos usar para el aislamiento de cepas virales a campo, aunque por razones humanitarias debería ser restringido su uso para aquellos laboratorios carentes de las disponibilidades de los cultivos de células. Nuestro laboratorio por contar con esta infraestructura, en este mismo ensayo ha implementado técnicas diagnósticas inmunohistoquímicas.
Reacción de inmunoperoxidasa. Como se evidencia en los resultados mostrados, el método de inmunoperoxidasa indirecta muestra ser una reacción específica para la identificación de antígenos del virus de la EA en cultivos celulares. Los resultados obtenidos en este ensayo son similares a los logrados por Albrecht y col. (1963), Roszkowski y Bartoszcze (1978), cuando desarrollaron las técnicas de inmunoperoxidasa directa y la de anticuerpos fluorescentes, respectivamente. Sin embargo, el método de la inmunoperoxidasa indirecta da una reacción más fuerte en la demostración histoquímica de la enzima, por ser una reacción amplificada y facilita una localización más precisa del antígeno en las células infectadas cuando se la compara con el método directo. Por otra parte, nuestros resultados se condicen exactamente con los logrados por Bartoszcze y Roszkowski (1979), con la diferencia de que estos autores emplearon en sus ensayos una dilución 1:5 del anticuerpo secundario, mientras que en nuestras experiencias la dilución elegida fue de 1:200. Esto indicaría que si se aplica la técnica como herramienta diagnóstica para laboratorios de referencia, le significaría al mismo un mayor aprovechamiento de los reactivos y un menor costo por diagnóstico realizado.Hemos intentado analizar, por otra parte, la utilidad de las técnicas inmunohistoquímicas como indicadoras de virulencia para la cepa de VPR RC/79.
Desde un punto de vista práctico, para diferenciar cepas atenuadas de virulentas, el conocimiento de los marcadores genéticos de virulencia es muy importante. Sin embargo en relación a las cepas de VPR muchos de esos marcadores aún hoy no están muy bien definidos. Así por ejemplo, no se ha encontrado que exista relación entre la virulencia de las cepas con el tamaño de las placas de lisis o con la habilidad para reproducirse a altas temperaturas (Zuffa y Grigelov·, 1966). Es conocido, como se dijo, que las cepas virulentas causan prurito en la zona de inoculación en los conejos, seguido de muerte (Skoda y col., 1964; Petrovic, 1967) y que las mismas, puestas en cultivos celulares de variados orígenes, conducen a la formación de sincitios, esto es células mutinucleadas, a diferencia de las cepas atenuadas que sólo generan redondeamiento celular (Tokumaru, 1957; Bartha, 1961; Lomniczi, 1974). En relación a las técnicas inmunohistoquímicas (Zuffa y col., 1968) establecieron por inmunofluorescencia que en caso de cepas atenuadas el antígeno viral puede ser visto principalmente en el citoplasma de las células infectadas, mientras que las cepas virulentas muestran la fluorescencia a nivel nuclear. En nuestros resultados hemos mostrado que la presencia del antígeno viral se observa, dependiendo del tiempo p.i., tanto en núcleo como en citoplasma, y es posible ver la formación de sincitios con intensa marca fluorescente en la región nuclear (figura 6A). Esto indica una vez más que la cepa RC/79, según los criterios descritos, es fuertemente virulenta, permitiéndonos concluir que las técnicas empleadas se constituyen en herramientas útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky, así como para caracterizar biológicamente cualquier aislado viral a campo.
RESUMEN
En nuestro laboratorio hemos estandarizado los métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluores-cencia indirecta para la detección del virus de la enfermedad de Aujeszky en cultivos de células Vero, utilizando como modelo la cepa viral RC/79. Hubo una fuerte correlación entre los resultados logrados por ambas técnicas, las que evidenciaron ser altamente específicas para la identificación del virus y permitieron una precisa localización de los antígenos virales en las células infectadas. La aparición de células multinucleadas o sincitios con marcada reacción en la región nuclear a las 16 horas p.i. indicó que la cepa RC/79 es fuertemente virulenta. Esta aseveración fue corroborada por los ensayos de infección experimental en conejos. El carácter virulento de la cepa se evidenció por un intenso prurito en la zona de inoculación, con la aparición de una lesión rezumante serosanguinolenta entre las 6 y 24 horas previas a la muerte. La misma aconteció en tiempo promedio, a las 62 y 120 horas p.i., dependiendo de la dosis viral inyectada. En todos los casos la tasa de mortalidad fue del 100%, aun trabajando con cantidades menores de virus (102 UFP), indicando ausencia de dosis-respuesta.
Los métodos empleados fueron útiles como marcadores de virulencia para la cepa RC/79 y se constituyen en herramientas indispensables para el diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky, disponibles en nuestro laboratorio y posibles de contemplar por las autoridades nacionales cuando establezcan un plan sanitario para esta patología.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por subsidio otorgado por la Secretaría
de Ciencia y Técnica (SECyT) de la Universidad Nacional de Río
Cuarto, partida 477 y por CONICOR. Agradecemos tambien al coordinador general
del Bioterio Central de la Universidad Nacional de Río Cuarto, Sr. Víctor
Saldaño, por su generosa colaboración en el cuidado de los animales.
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Aceptado: 15.04.97.
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