Utilización de lectina Pisum sativum y yoduro de propidio para la evaluación rápida de integridad de acrosoma en espermatozoides caprinos

J.F. COX, M.V.; P. FERNANDEZ; F. SARAVIA; A. SANTA MARIA, M.V.

Lectins are used for studies in mammalian sperm surface and organelles because of their ability to specifically link sugar residua. Fluorescein labeled Pisum sativum (PSA) has been used successfully in several mammalian spermatozoa, as a marker of the inner acrosomal membrane but, because of interspecific variations in membrane constituents, its use requires a preliminary validation. This study compared the results obtained by staining goat spermatozoa with a combination of propidium ioide (PI) and PSA vs those of Bengal Red. Also the interpretation of the results achieved were compared with the results obtained by two external technicians.

In Experiment 1, goat spermatozoa collected by artificial vagina were washed once, immediately after collection, and stained with PI/PSA and Bengal Rose. Then, to prepare sperm groups with different proportions of live and dead sperm, spermatozoa were fractionated and one fraction was damaged by freezing at -196° C without cryoprotectans. In Experiment 2, semen from different males was frozen in a Tris-base d extender, and thawed either at 37° C for 30 sec or at 65° C for 5 sec, and then stained with PI/PSA. Two independent technicians assessed the results of both series of experiments. Percentage transformations, media comparison and correlation were obtained by using the Systat^® computing package.

The results showed that PI/PSA and Bengal Rose gave similar and positively correlated results and that both technicians gave similar interpretations (r = 0.98). It can be concluded that PI/PSA is a useful staining for fast assessment of goat spermatozoa.

Palabras claves: espermatozoides, lectinas, acrosoma, caprinos.

Key words: spermatozoa, lectins, acrosome, goats.

INTRODUCCION

El acrosoma es un organelo espermático que cumple una función esencial en el proceso de fecundación. Está revestido externamente por el plasmalema y la membrana acrosomal externa e internamente por la membrana acrosomal interna (Bedford, 1990). La importancia funcional del acrosoma se debe a su rol en la fijación y penetración espermática de la zona pelúcida y en la fusión entre gametos (Yanagimachi, 1988). Aun cuando la membrana acrosomal interna es bastante resistente, la doble membrana que constituye la pared acrosomal puede alterarse fácilmente por efectos fisiológicos (ej. reacción de acrosoma) o no fisiológicos (ej. degeneración, daño físicoquímico).

La evaluación de la integridad de acrosoma ha sido relevante, tanto desde un punto de vista clínico y tecnológico como desde la investigación de la biología espermática (Bavister, 1990;Cross y Meizel, 1989), por lo que en especies con un acrosoma relativamente poco notorio, como en rumiantes domésticos, se han desarrollado diversas técnicas para facilitar su identificación.

Teniendo presente las variaciones entre especies, los procedimientos tintoriales estándares han mostrado ser bastante útiles, pero a su vez son laboriosos, demandantes de tiempo y a veces sus resultados son algo ambiguos (Cross y Meizel, 1989).

Recientemente se ha incorporado la utilización de lectinas asociadas a fluoresceínas como marcadores de acrosoma y de modificaciones plasmáticas en espermios eyaculados (Cummins, 1995; Medeiros y Parrish, 1996). Las lectinas son glicoproteínas que se unen específicamente a terminales azúcares ubicados en las estructuras celulares y, por lo mismo, se han utilizado como marcadores específicos de glicoconjugados localizados, tanto en el acrosoma intacto como en la matriz acrosomal (Cross y col., 1986; Nolan y col., 1992; Way y col., 1995). La lectina Pisum sativum (PSA) permite reconocer terminales manosa, glucosa y glucosamina (Goldstein y Portez, 1986) de glicoconjugados localizados en la matriz acrosomal, por lo que asociada a una fluoresceína puede identificar espermatozoides con el acrosoma dañado o ausente (Nolan y col., 1992; Aitken y Brindle, 1993). El yoduro de propidio (PI) es una tinción nuclear y por lo mismo sirve como tinción espermática de contraste. En combinación, permiten una evaluación rápida, simple y sin ambigüedad de la presencia o ausencia del saco acrosomal.

En general, las pruebas espermáticas ideales deberían ser sencillas, rápidas de interpretar, confiables, repetibles y debieran aportar información relevante (Bavister, 1990). La gran utilidad del uso de lectinas en la evaluación funcional de espermatozoides es que cumplen la mayor parte de estos requisitos (Kawakami y col., 1993), por lo que se han utilizado crecientemente en estudios de la biología espermática.

Como marcador de la función acrosomal, la lectina PSA se ha utilizado exitosamente en toros (Nolan y col., 1992;Way y col., 1995), potros (Farlin y col., 1992; Casey y col., 1993) y perros (Kawakami y col., 1993; González-Chábarri y col., 1994), mientras que en muchas clínicas humanas se ha empezado a utilizar en conjunto con la lectina Arachis hipogea (PNA) como técnica de elección para la evaluación acrosomal (Kinger y Rajalakshmi, 1995). El presente trabajo tiene por función describir la utilización de la combinación de PI y PSA ajustada para la evaluación de integridad de acrosoma en caprinos.

MATERlAL Y METODOS

Procesamiento y congelacion del semen. Semen de 4 chivatos Anglo Nubian sexualmente maduros fue colectado por vagina artificial, suspendido en medio Talp sin calcio (con un 10% v/v de suero de cabra; Parrish y col, 1988) y lavado mediante la centrifugación a 200 g por 5 min y resuspensión de los espermatozoides en el mismo medio, y evaluado en función del movimiento progresivo en microscopia de contraste de fase.

La congelación de semen fue llevada a cabo de acuerdo a Evans y Maxwell (1987). En resumen, el semen fue diluido en un diluyente compuesto por Tris (4.543 g), glucosa (0.750 g), ácido cítrico (2,606 g), yema de huevo (3.0 ml), glicerol (6.0 ml), penicilina (100.000 U.I.), estreptomicina (100.0 mg) y agua destilada (hasta 100 ml) y permitido alcanzar temperatura de laboratorio (-20° C). La concentración espermática fue ajustada a 240 x 10⁶ espermatozoides/ml y el semen fue almacenado en pajuelas de 0.25 ml estériles (IMV, Francia). Posteriormente el semen fue enfriado hasta los 5° C a una tasa de 1° C/min y congelado, manteniéndolo en vapor de N₂ líquido por 10 min. Posteriormente el semen fue depositado directamente en N₂ líquido y almacenado en portapajuelas identificados.

Tinciones espermáticas. La tinción de acrosoma estándar para contrastar la utilización de lectina fue la tinción Rosa de Bengala (Talbot y Chacón, 1981), con algunos ajustes para espermatozoides de chivos, y de acuerdo a los criterios de manejo de semen descritos por Pintado y Pérez-Llano (1992). En resumen, los espermatozoides fueron fijados por 20 min a 37° C en glutaraldehído (2%) diluido en buffer cacodilato de sodio (0.1M, pH 7.4), luego lavados en agua deionizada 2 veces y, posteriormente, se prepararon 2 frotis que fueron secados al aire. Los frotis fueron teñidos por 15 min con Rosa de Bengala al 0.8% en buffer Tris (pH 5.3) y luego lavados con agua, deshidratados en una batería de alcoholes, clarificados con xilol, sellados con entellán y protegidos con cubreobjetos. La evaluación fue hecha en microscopia óptica con un objetivo de x 100. La tinción demarca con claridad el reborde acrosomal en presencia de acrosomas intactos, de manera que la ausencia de tal reborde fue evaluada como evidencia de un acrosoma ausente.

La lectina PSA conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC, 2.5 moles FITC/ mol de PSA) y el PI fueron preparados en una solución stock de 0.1 y 0.125 mg de lectina/ml de buffer fosfato (PBS) respectivamente y almacenados a -20° C, protegidos de la luz. Para evaluar la integridad de acrosoma, la concentración espermática fue ajustada a 50 x 10⁶ espermios/ml en una solución de fijación (5 cc de formalina al 40%/It solución de citrato de sodio al 2.9%) e incubada por 10 min a 39° C. Posteriormente, 0.2 ml de la suspensión de espermatozoides fue incubada al menos 30 min con 16 µl de PSA y 8 µl de PI, y luego 30 µl fueron depositados en un portaobjetos limpio y cubierto con un cubreobjetos para facilitar su evaluación. La evaluación fue realizada bajo un objetivo de x 40 utilizando un microscopio de epifluorescencia Nikon. El PI tiñe a todos los espermatozoides de color rojo gracias a la permeabilización de membranas llevada a cabo por el formaldehído, mientras que el PSA tiñe con un color verde-amarillento la región acrosomal sólo de los espermatozoides con acrosomas dañados o ausentes.

Los químicos y biológicos fueron obtenidos de Sigma Chemical Corp (St. Louis, MO, USA), a menos que se indique.

Experimento 1. Correlación entre la evaluación de integridad de acrosoma medida por lectina y por Rosa de Bengala. En la primera parte del experimento, semen proveniente de 4 chivos fue lavado, incubado y posteriormente la integridad de acrosoma fue directamente evaluada. En la segunda parte, semen previamente lavado de los mismos machos fue dividido en dos fracciones: la primera fue congelada sin crioprotectores, depositando el semen almacenado en crioviales directamente en N₂ líquido, mientras que la segunda, mantenida sin alteraciones, fue utilizada para en combinación con la anterior preparar 3 fracciones espermáticas a evaluar: una fracción normal, una parcialmente dañada (50% normal y 50% descongelada) y una fracción dañada (100% de espermatozoides descongelados) por el proceso de congelación. La integridad de acrosoma de al menos 200 espermatozoides fue evaluada por PI/PSA y Rosa de Bengala, la primera en duplicado para ser analizada por dos evaluadores no entrenados e independientes.

Experimento 2. Evaluación de integridad de acrosoma en respuestas a diferentes temperaturas de descongelación. Semen congelado almacenado en pajuelas francesas de 0.25 ml (IMV, L'Aigle, Francia) fue descongelado en baño maría de acuerdo a las siguientes temperaturas y tiempos: a) 65° C por 5 seg; y b) 36° C por 30 seg. Posteriormente, el semen fue fijado y teñido con PI/PSA y la integridad de acrosoma verificada en al menos 200 espermatozoides por dos evaluadores independientes.

Análisis estadístico. Los porcentajes fueron transformados por el método de Bliss y posteriormente se calcularon correlaciones y se compararon las medias por la prueba de t o de comparación múltiple de Tukey utilizando el programa estadístico Systat^®.

RESULTADOS

La combinación PI/PSA tiñe los acrosomas de acuerdo a la figura 1. El PI tiñe a los esperma-tozoides sin ambigüedades de un color rojo anaranjado que contrasta con el color verde amarillento de la lectina marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

El experimento 1 fue diseñado para verificar si los patrones de tinción obtenidos con PI/PSA eran equivalentes a la tinción estándar y si la interpretación de los resultados entre evaluadores independientes eran inequívocos. Los resultados del experimento se muestran en la tablas 1 y 2 para la primera y segunda parte, respectivamente. Los resultados de la primera y segunda parte del experimento 1 muestran que la información obtenida con la tinción PI/PSA es similar a la obtenida con Rosa de Bengala. Asimismo, la interpretación de los resultados por evaluadores independientes presenta una correlación positiva altamente significativa.

Tabla 2

Evaluación de la repetibilidad de la medición de la integridad de acrosoma usando PI/PSA
en poblaciones espermáticas tratadas con frío, de acuerdo a la comparación con la tinción
Rosa de Bengala y con distintos evaluadores.

En el experimento 2 se utilizó la tinción para evaluar el daño acrosomal producido por el método de descongelación del semen y se correlacionaron los resultados obtenidos por dos evaluadores independientes. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Los resultados muestran que no existe un efecto significativo del método de descongelación de semen en la integridad de acrosomas (p > 0.05). Asimismo, también en este experimento la interpretación de los resultados por evaluadores independientes presentó una correlación positiva altamente significativa.

DISCUSION

En el presente estudio la combinación PI/PSA demostró ser confiable, de acuerdo a la equivalencia de resultados con la tinción Rosa de Bengala, y demostró permitir interpretaciones inequívocas, de acuerdo a la correlación de los resultados obtenidos por evaluadores independientes. Utilizando formol citrato como fijador, no se observaron los problemas de aglutinación descri-tos para espermios de toros capacitados con heparina por Way y col. (1995), aunque la aglutinación fue manifiesta en espermios fijados con glutaraldehído (resultados no presentados). Los resultados expuestos sugieren que la combinación PI/PSA puede ser usada en la evaluación rápida de la integridad de acrosoma en espermatozoides caprinos.