Características histoquímicas y morfométricas del músculo Gluteus medius en equinos en preparación para competencias de salto. Estudio preliminar^*

A. ISLAS¹, M.V., M. Sc.; M. QUEZADA¹, M.V. Dr. Med. Vet.; A. BERNALES², M.V., M. Sc.; G. MORA¹, M.V.; J.L. LOPEZ-RIVERO³, M.V., Dr. Med. Vet..; V. MERINO¹, B.Q., M. Sc.; M. BRIONES¹, M.V., M. Sc.; C. ESCALONA¹; L. MARIN¹, T.M.

Biopsies were taken at depth of 3 and 6 cm in the Gluteus medius muscle of 7 inactive mares and 3 castrated male horses. Age of the animals ranged from 3 to 4 years and none of them had any specific training, 3 months prior to the experiment. The samples were analised with the mATPase miofibrillar technique, to determine the fibrillar composition, and with the NADH-TR technique to determine the oxidative capacity.

The fibrillar composition averages were 16.4%, 36.3%, 29.1% and 18.2% at 3 cm., and 26.9%, 36.1%, 24.7% and 12.3% at 6 cm., for the fibres type I, IIA, IIB oxidative and IIB non oxidative respectively. The fibrillar composition varied in relation to the depth of the biopsy. Type I and type IIB fibres presented significant percentage differences between 3 and 6 cm. Type IIA was similar in percentage at both depths. Horses, in the resting period, presented a higher proportion of type IIB fibres. Oxidative and non oxidative fibres type IIB were not different in percentage at both biopsy depths. The area of the muscle fibres was 2335, 3194 and 5166 um2 for the fibres type I, IIA and IIB respectively. Least diameter was 19, 23 and 28 for fibres type IIA and IIB.

These results indicate that the fibrillar composition of the Gluteus medius muscle in these horses was different to other breeds.

Palabras claves: músculo, histoquímica, caballo de salto.

Key words: muscle, histochemistry, jumping horse.

INTRODUCCION

Durante las últimas dos décadas se han realizado numerosas investigaciones sobre las características histoquímicas y bioquímicas de los músculos esqueléticos y en particular del músculo Gluteus medius por sus implicaciones locomotoras y su fácil acceso para la toma de muestras (Lindholm y Piehl, 1974).

Los estudios de la composición fibrilar del músculo Gluteus medius en equinos en condiciones de reposo como en entrenamiento han demostrado la importancia de la raza, la edad, el entrenamiento y la profundidad de la biopsia sobre la variación de ellas (Essén-Gustavsson y col., 1989; Ronéus y col., 1992; Islas y col., 1996, l997). La composición fibrilar se ha determinado usando la técnica de miosina ATPasa (mATPasa) (Brooke y Kaiser, 1970). Las fibras que principalmente se encuentran en los equinos adultos son del tipo I, IIA y IIB, las cuales varían en su frecuencia relativa, abastecimiento capilar y tamaño al aumentar la profundidad de la biopsia y el entrenamiento (Kline y col., 1987; López-Rivero y col., 1992). Investigaciones realizadas en diferentes razas han demostrado que las zonas más profundas del músculo Gluteus medius se caracterizan por tener un mayor porcentaje de fibras tipo I y un metabolismo aeróbico y que las regiones más superficiales tienen mayor porcentaje de fibras tipo II (Kline y col., 1987; López-Rivero y col., 1993a, Islas y col., 1996). Para tener una buena representación del músculo y minimizar los errores de muestreo es necesario realizar las biopsias a diferentes profundidades de muestreo y considerar en la muestra un mínimo de 150 fibras (Lexell y col., 1983).

La técnica de nicotinamida dinucleótido tetra-zolium reductasa (NADH-TR) (Dubowitz, 1985) permite clasificar las fibras en oxidativas y no oxidativas según la intensidad de la tinción. Las fibras tipo I y IIA presentan una alta capacidad oxidativa y las fibras tipo IIB una capacidad oxidativa variable, susceptible de ser modificada por efecto del entrenamiento (Essén-Gustavsson y col., 1984).

El objetivo de este trabajo es determinar la composición fibrilar, capacidad oxidativa, diámetro y área de las fibras del músculo Gluteus medius en equinos seleccionados para salto sin entrenamiento previo.

MATERIAL Y METODOS

En el estudio se emplearon 10 equinos mestizos para salto (7 yeguas y 3 machos castrados), 50% fina sangre inglés de carrera (FSI) y 50% Hackney, categoría debutantes, clínicamente sanos, de 4 años de edad, pertenecientes a la Escuela de Equitación "Oscar Cristi Gallo" de Carabineros de Chile (Santiago). Los caballos no habían realizado con anterioridad ningún programa específico de entrenamiento por 3 meses.

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvieron 2 biopsias musculares a 3 y 6 cm de profundidad a través de la misma incisión. Debido a la extrema variabilidad de las características histoquímicas y morfométricas del músculo Gluteus medius (Lindholm y Piehl, 1974), las biopsias fueron tomadas con una aguja percutánea de 6 mm de diámetro interno (Henckel, 1983), por la misma persona tomando las precauciones necesarias para estandarizar la localización y profundidad de la toma de muestras. El sitio exacto se precisó dorsocaudalmente, en un ángulo de 45°, a la tuberosidad coxal del íleon a una distancia que osciló entre 10 y 15 cm de ese punto dependiendo de la conformación de la grupa de cada caballo. La profundidad exacta de la biopsia se garantizó por medio de cánulas metálicas que sólo permitieron introducir la aguja de biopsia en la profundidad deseada (Mora y col., 1995).

Para la obtención de las muestras se rasuró una superficie de 2 cm², tras desinfectar completamente la zona, luego se infiltró el tejido subcutáneo con 2 a 3 ml de anestésico local (Lidocaína MR Lab. Chile). Posteriormente en la piel se hizo una incisión y se introdujo un trócar para obtener el tejido a tres y seis cm de profundidad.

Una vez obtenidas las muestras fueron colocadas sobre placas de poliestireno y luego bañadas en OCT "embedding compound" para congelación de tejidos (Tissue Tek, Miles Sci., USA). y se sumergieron durante 30 segundos en Isopentano (2-metilbutano Lab. Merck) enfriado previamente en nitrógeno líquido (Dubowitz, 1985). Las biopsias fueron almacenadas en tubos rotulados en un termo de nitrógeno a una temperatura de -196° C hasta su posterior procesamiento. Para disminuir la alteración que sufre el tamaño fibrilar debido a la contracción que experimentan las muestras obtenidas con aguja de biopsia, se dejaron transcurrir 2 a 3 minutos desde la obtención hasta su congelación (López-Rivero y col., 1993a).

Métodos histoquímicos. De cada muestra se obtuvieron cortes seriados en un criostato (Microm HM 500) a -20° C, de 10 µm de grosor, que fueron incubados para demostrar la actividad miosín adenosín trifosfatasa miofibrilar (mATPasa Enzyme Commission, E:C: 3.6.1.3.) a pH 9.4 tras preincubación ácida. La capacidad oxidativa de las fibras se evaluó en cortes seriados teñidos mediante nicotinamida adenina dinucleótido tetrazolium reductasa (NADH-TR 1.6.99.3), para cada profundidad de biopsia (Dubowitz, 1985).

Según los patrones de tinción de mATPasa las fibras fueron clasificadas como tipo I (contracción lenta) o tipo IIA y tipo IIB (contracción rápida) (Brooke y Kaiser, 1970). Las fibras tipo IIB de acuerdo a la intensidad de la tinción NADH-TR se clasificaron en oxidativas y IIB no oxidativas.

Composición fibrilar. Se determinó la proporción de cada tipo de fibra muscular en las dos profundidades de las biopsias. Un área representativa de cada biopsia conteniendo al menos 200 fibras fue examinada sistemáticamente en los cortes teñidos por mATPasa, para la determinación de los tipos de fibras y la capacidad oxidativa de ellas se evaluó con la tinción NADH-TR y para ello se obtuvieron microfotografías en blanco y negro (x100) de las dos tinciones.

Morfometría. Para obtener los porcentajes y tamaño fibrilar se examinó un área representativa de cada biopsia y se determinaron las frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB. Los tipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculados sobre las microfotografías mediante el cómputo de 200 fibras/biopsias.

El área transversal y el diámetro mínimo de los tipos de fibras se obtuvieron sobre microfotografías procesadas con un sistema de imagen computarizado equipado con una tarjeta digitalizadora (Data Translation 2851), en un programa morfométrico computacional (Imago, Grupo SIBA, Universidad de Córdoba, España). Sólo se midieron las fibras de las biopsias con bordes celulares nítidos y localizadas en la zona central de las muestras, no considerándose las fibras que habían sido seccionadas longitudinalmente. De cada muestra se midió un mínimo de 25 fibras de cada tipo. Cuando el porcentaje de un tipo de fibra fue menor al 5% no se consideró en los resultados. Para cada tipo de fibra se obtuvo el área y diámetro mínimo. El diámetro mínimo se define como la menor distancia que atraviesa una fibra pasando por su centro geométrico (Dubowitz, 1985).

Análisis estadístico. Los resultados se expresan en porcentaje y se aplicaron pruebas estadísticas convencionales para obtener la media y desviación estándar de cada variable. Las diferencias entre las profundidades de muestreo fueron valoradas por medio de una prueba "t" de Student para observaciones pareadas y un análisis de varianza.

RESULTADOS

El estudio histoquímico realizado en este trabajo permitió determinar la composición fibrilar del músculo Gluteus medius de los equinos de salto debutantes. Los tipos de fibras del músculo Gluteus medius en el equino de salto en función de la profundidad se presentan en la figura 1.

Figura 1. Microfotografías (x 100) de cortes del músculo Gluteus medius, a 3 y 6 cm de profundidad, actividad miosín adenosín trifosfatasa miofibrilar. Fibras tipo I (I), tipo IIA (IIA) y tipo IIB (IIB).

Microphotography (x 100) of Gluteus medius muscle cuts at 3 and 6 cm of depth, fibrillar miosine adenosine triphosphatase activity. Fibre type I (I), type IIA (IIA), and type IIB (IIB).

El porcentaje de fibras tipo I en equinos de salto en condiciones de reposo a la profundidad de 3 cm fue de 16.4%, aumentando a 26.9% a los 6 cm de profundidad, siendo esta variación esta-dísticamente significativa (p < 0.01) (cuadro 1).

Las fibras tipo IIA presentaron un promedio de 36.3% y 36.1% a 3 y 6 centímetros de profundidad, respectivamente, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) (cuadro l).

El porcentaje de fibras tipo IIB fue de 47.3% a la profundidad de 3 cm, disminuyendo a un 37% a los 6 cm de profundidad, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p < 0.01) (cuadro 1).

Al analizar la capacidad oxidativa de las biopsias musculares mediante la técnica NADH-TR (figura 2) se determinó que el porcentaje promedio de fibras tipo IIB oxidativas fue de 29.1% y 24.7% a 3 y 6 centímetros de profundidad, no existiendo variación significativa en los porcentajes según la profundidad de la biopsia (p > 0.05). Al expresar estos resultados como porcentaje del total de fibras tipo IIB, estas diferencias no tienen significancia estadística (p > 0.05) El porcentaje promedio de fibras IIB no oxidativas fue de 18.2% y 12.3% a 3 y 6 centímetros de profundidad, no existiendo variación significativa en los porcentajes (p > 0.05). Al expresar estos datos como porcentaje de las fibras IIB totales, no hay diferencia significativa (p > 0.05) (cuadro 2).

Figura 2. Microfotografías (x 100) de cortes del músculo Gluteus medius, a 3 y 6 cm de profundidad. Capacidad oxidativa evaluada por la reacción nicotina-mida adenina dinucleótido tetrazolium reductasa (OX: fibra oxidativa; NOX: fibra no oxidativa).

Microphotography (x 100) of Gluteus medius muscle cuts at 3 and 6 cm of depth. Oxidative capacity evaluated by nicotine amide dinucleotide tetrazolium reductasa (OX: oxidative; NOX: no oxidative).

El análisis morfométrico determinó que el diámetro mínimo promedio de las fibras tipo I, IIA y IIB fue de 19, 23, y 28 µm, existiendo diferencias significativas entre las fibras tipo IIB y las fibras tipo I y IIA (cuadro 3). El área promedio de las fibras tipo I, IIA y IIB fue de 2.335, 3.194 y 5.165 µm2, respectivamente, existiendo diferencias significativas en el tamaño entre las fibras IIB y las tipo I y IIA (cuadro 3).

DISCUSION

Para este estudio se obtuvieron biopsias del músculo Gluteus medius de equinos de salto debido a la importancia de éste en la propulsión del miembro pélvico (Lindholm y Piehl, 1974,), además este músculo es de gran tamaño, fácil acceso y ausente de estructuras vulnerables (Snow, 1983), lo que hace que este procedimiento tenga un riesgo mínimo para el animal.

Mediante el uso de técnicas histoquímicas en el músculo esquelético de los mamíferos, se ha logrado identificar dos poblaciones fibrilares: I y II. A su vez, el desarrollo de estas técnicas en equinos ha permitido identificar tres subtipos de fibras: IIA, IIB y IIC (Lindholm y Piehl, 1974; Essén-Gustavsson y col., 1980; Ronéus y col., 1991). El subtipo fibrilar IIC presenta una escasa frecuencia en animales adultos, siendo su proporción mayor en músculos juveniles y fetales (Essén-Gustavsson y col., 1980; Andrews y Spurgeon, 1986). Debido a que los equinos utilizados en este estudio eran adultos (4 años), la presencia de fibras IIC fue menor a un 2%, y se incluyeron en el porcentaje de fibras tipo IIB siguiendo las indicaciones mencionadas por Essén-Gustavsson y Lindholm (1985).

El sitio de muestreo tiene un importante efecto en la composición fibrilar. Se ha demostrado que existen pequeñas variaciones cuando las muestras han sido tomadas a partir del mismo sitio o de sitios contralaterales del mismo músculo, por lo tanto es muy importante estandarizar el lugar y la profundidad de muestreo (Snow y Guy, 1980; Henriksson-Larssén, 1985; Essén-Gustavsson y col., 1989). Por otra parte, está comprobado que una sola biopsia es una representación insuficiente del músculo completo, debido a la extensa variabilidad de las características histoquímicas dentro del músculo Gluteus medius de los equinos (Kai, 1984; Bruce y Turek, 1985; López-Rivero y col., 1992).

Cuadro 3

Area (µm²) and diameter (µm²) of Gluteus medius muscle fibres in horses presented as
average and standard deviation (DS).

El porcentaje de fibras tipo I es mayor que los indicados para la raza Standardbred sin entrenamiento (Henckel, 1983). Valores similares se describen para la raza Fina Sangre Inglés adultos sin entrenamiento (López-Rivero y col., 1989a) y menores al compararlo con equinos Andaluces, Arabes y Anglo-Arabes adultos sin entrenamiento (López-Rivero y col., 1989a, 1991). Las fibras tipo I se caracterizan por tener un perfil oxidativo. (Kai, 1984; Aguirre, 1995; López, 1995), característica que les otorga una mejor adaptación para funciones posturales y actividades dinámicas de bajo nivel y larga duración (López-Rivero y col., 1990, 1993a).

El porcentaje de fibras tipo IIA se mantiene sin variaciones en las dos profundidades estudiadas (cuadro 1), siendo su porcentaje menor al observado en equinos Anglo-Arabes y Fina Sangre Inglés adultos sin entrenamiento y Standardbred después de un período de entrenamiento (Henckel, 1983; López-Rivero y col., 1989a y b). Valores similares se encuentran al compararlos con las razas Andaluz, Arabe e Hispano-Bretón adultos sin entrenamiento (López-Rivero y col., 1989a, 1991, 1993c). Este tipo de fibra además de experimentar contracción rápida tiene una elevada capacidad oxidativa (Essén-Gustavsson y col., 1984; Ronéus y col., 1991).

El porcentaje de fibras tipo IIB disminuye en forma significativa con la profundidad de la biopsia (cuadro 1), observándose un mayor porcentaje a 3 centímetros de profundidad, lo que difiere de estudios realizados en otras razas en las que se ha determinado un aumento de este tipo fibrilar con la profundidad de la biopsia (Andrews y Spurgeon, 1986; Barlow y col., 1984; López-Rivero, 1995) y similares a los obtenidos en equinos Standardbred jóvenes sin entrenamiento (Henckel, 1983); esta diferencia podría deberse a que los equinos utilizados en esta investigación son producto de la cruza de las razas fina sangre inglés (50%) y Hackney (50%). Estas fibras poseen un perfil metabólico glucolítico y están invo-lucradas en la generación de fuerza propulsiva, rápida e intensa, de corta duración. (López-Rivero y col., 1993b).

Las fibras IIB oxidativas y no oxidativas presentaron una disminución de su proporción en relación con la profundidad (cuadro 2), esperándose cambios en los porcentajes de este tipo de fibra por efecto del entrenamiento. Otros autores han demostrado que un entrenamiento adecuado produce cambios en las fibras tipo II aumentando su capacidad oxidativa (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; López-Rivero y col., 1991).

El área y diámetro de las fibras son similares a los obtenidos para otras razas (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; López-Rivero y col., 1993a; Ronéus, 1992). Las fibras de menor tamaño y diámetro tienen un mejor abastecimiento de capilares, lo que permite una mejor irrigación y más difusión de oxígeno y sustratos a la célula y al mismo tiempo realizan una mejor eliminación de los productos del metabolismo de ellas (Essén -Gustavsson y col., 1989).

Los resultados obtenidos en esta investigación muestran que los equinos estudiados presentan una composición fibrilar del músculo Gluteus medius diferente a los equinos fina sangre de carrera, lo que se debería a que estos animales son el resultado de la cruza de equinos fina sangre y Hackney, por lo tanto se puede pensar que la composición fibrilar obtenida en estos equinos se debe al efecto de las cruza de las dos razas.

El estudio realizado permitió caracterizar la composición fibrilar y morfométrica del músculo Gluteus medius de equinos seleccionados para salto sin entrenamiento, resultados que pueden ser utilizados para estudiar posteriormente el efecto de diferentes modelos de entrenamiento sobre la composición fibrilar de este músculo.

RESUMEN

Se obtuvieron biopsias a 3 y 6 centímetros de profundidad del músculo de 7 yeguas y 3 machos castrados de 3 a 4 años de edad, los cuales no habían realizado con anterioridad ningún programa específico de entrenamiento por 3 meses. Las muestras fueron analizadas por las técnicas mATPasa miofibrilar, para determinar la composición fibrilar, y NADH-TR para determinar la capacidad oxidativa.

Los promedios obtenidos para la composición fibrilar fueron de 21.6%, 36.2%, 26.9% y 15.3% para las fibras tipo I, IIA, IIB oxidativas y IIB no oxidativas, respectivamente. La composición fibrilar varía en relación con la profundidad de la biopsia. Las fibras tipo I y IIB presentan diferencias significativas entre los 3 y 6 cm. Las fibras tipo IIB no varían con la profundidad de la biopsia.

Los equinos en período de descanso presentan una alta proporción de fibras tipo IIB. Las fibras tipo IIB oxidativas y no oxidativas no variaron su porcentaje entre las biopsias.

El área de las fibras musculares fueron 2.335, 3.194 y 5.166 µm² para las fibras tipo I, IIA y IIB respectivamente y el diámetro menor fue 19, 23 y 28 para las fibras tipo I, IIA y IIB.

Los resultados obtenidos indican que la composición fibrilar del músculo Gluteus medius en equinos de salto fue diferente a otras razas estudiadas.
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Aceptado: 08.01.98.
* Financiado por Proyecto 96.151.004-1.2, Dirección de Investigación Universidad de Concepción.

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