Composición fibrilar del músculo Gluteus medius en equinos con distinto historial en carreras de resistencia^*

J.L. LOPEZ-RIVERO¹, M.V., Ph.D.; A. SERRANO¹, M.V., Ph.D.

Biopsies from three different depths of the Gluteus medius muscle were obtained from 36 endurance horses, aged 8.42 ± 2.85 years and of both sexes. Twenty of the horses were considered excellent performers according to the mean speed of their three fastest records in endurance events, 2 or 3 years prior to the study. The other 16 horses were considered moderate performers. Significant differences in muscle fibre type composition were recorded. Excellent performers had a higher percentage of type I and type IIA fibres (high and low myosin adenosinetriphosphatase activity at pH 4.5, respectively. Also, they had and a lower percentage of type IIB fibres (moderate myosin adenosinetriphosphatase activity at pH 4.5), including both type IIB oxidative (moderate to high NADH-tetrazolium reductase activity) and IIB non-oxidative (low NADH-tetrazolium reductase activity). The differences in distribution of fibre types were more marked in the deeper parts when compared with the surface regions of muscle. The results show that fibre type proportions of the Gluteus medius muscle, are directly related to the athletic ability of the horse for endurance events.

Palabras claves: músculo esquelético, fibras musculares, histoquímica.

Key words: skeletal muscle, muscle fibres, histochemistry.

INTRODUCCION

Los resultados de numerosos estudios sobre la relación entre las características musculares y el rendimiento deportivo en equinos no siempre han sido coincidentes. En equinos fina sangre de carrera (Snow y Guy, 1981; Barlow y col., 1984) y cuarto de milla (Wood y col., 1988) se demostró una relación entre la aptitud atlética individual y los porcentajes fibrilares en ciertos músculos de los miembros, pero estos resultados no fueron confirmados por un reciente estudio en equinos trotadores (Ronéus y col., 1993). En equinos seleccionados para competiciones de resistencia, habitualmente denominadas raids, se encontró que los animales con mejor historial deportivo tenían una mayor proporción de fibras de contracción lenta y alta capacidad oxidativa (tipo I) y fibras de contracción rápida y alta capacidad oxidativa (tipo IIA) y un menor porcentaje de fibras de contracción rápida y baja capacidad oxidativa (tipo IIB) que los individuos con moderado o escaso rendimiento (Snow y col 1981; Hodgson y col., 1983). Estas conclusiones no fueron confirmadas en un trabajo posterior (Essén-Gustavsson y col., 1984).

Los trabajos antes señalados se basaron en el análisis de una sola biopsia del músculo Gluteus medius. Este músculo es elegido porque interviene en todas las intensidades de ejercicio (Lindholm y Piehl, 1974). Sin embargo, otros autores han comprobado variaciones significativas en la composición y tamaño fibrilares de ese músculo, en relación a la profundidad de la toma de las muestras (Kline y col., 1987; Kline y Bechtel, 1988; López-Rivero y col., 1992; Rivero y col., 1993b). Lexell y col. (1985) recomiendan examinar tres biopsias con más de 150 fibras cada una, tomadas a diferentes profundidades del músculo, para minimizar los errores de muestreo en la técnica de biopsia y aumentar la precisión al estimar los porcentajes fibrilares.

La hipótesis de trabajo es que las características musculares del caballo están relacionadas con su capacidad competitiva, al menos para pruebas de resistencia. El objetivo de este estudio fue examinar las posibles diferencias en la distribución de los tipos de fibras musculares en tres niveles de profundidad del músculo Gluteus medius de equinos entrenados para carreras de resistencia y con distintos resultados en la competición, y relacionar estas características musculares con el rendimiento deportivo individual de estos atletas.

MATERIAL Y METODOS

Animales. El estudio se realizó con equinos de distintas razas (Anglo-árabe, Arabe y Arabe cruzado), participantes habituales en carreras de resistencia organizadas bajo las directrices de la European Long Distance Rides Conference (ELDRIC), de acuerdo con las reglas de la Federación Ecuestre Internacional para carreras de resistencia. Se trabajó con un total de 36 animales, de los cuales 1 correspondió a un potro, 17 fueron caballos castrados y 18 yeguas, cuyas edades fluctuaron entre 4 y 17 años (media ± desviación típica, 8.42 ± 2.85 años). En general, los individuos tuvieron una conformación análoga y fueron mantenidos en similares condiciones ambientales en la misma región de España (Cataluña). Todos los animales recibieron un entrenamiento de resistencia convencional durante, al menos, los 2 años previos a este estudio y habían participado, durante 2 a 10 años, en pruebas de larga distancia de nivel nacional y/o internacional, según la edad de cada animal. El programa de entrenamiento habitual consistió en 60-120 minutos/día de carrera de baja intensidad (10 km/h) durante 5 ó 6 días/semana, aunque algunas diferencias interindividuales en su intensidad y duración no fueron cuantificadas.

Clasificación de los equinos. Los caballos fueron clasificados por edad y por categoría de rendimiento (cuadro 1). Según edad, los caballos se subdividieron en 2 grupos: 24 adultos entre 7 y 17 años de edad (9.84 ± 2.98 años) y 12 jóvenes, de 4 a 6 años de edad (5.35 ± 0.51 años). Según rendimiento, se establecieron otros 2 grupos: 20 caballos fueron catalogados de rendimiento excelente (Grupo CRE) y 16 como de rendimiento moderado (Grupo CRM). Los equinos adultos y jóvenes participaron en al menos 3 carreras de resistencia, de 80 a 180 km y de 40 a 60 km, respectivamente. Para catalogar el rendimiento de cada individuo se usaron las velocidades medias de las 3 mejores marcas logradas en los últimos 2 (para los equinos jóvenes y adultos de 7 y 8 años de edad) o 3 años (en los restantes adultos). Se consideraron de rendimiento excelente (Grupo CRE) a los equinos adultos (14 individuos), cuya velocidad media fue superior a 12.5 km/h en carreras de 120 a 180 km o mayor de 14 km/h en carreras de 80 a 120 km; y los jóvenes (6 caballos) con tres marcas superiores a 13.5 km/h en carreras de 40 a 60 km. Los restantes 16 caballos (10 adultos y 6 jóvenes), con marcas inferiores, fueron considerados de rendimiento moderado (Grupo CRM) (ver cuadro 1).

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvieron tres biopsias percutáneamente con una aguja de biopsia de 6 mm de diámetro interno tras rasurar, desinfectar y anestesiar localmente el área, siguiendo la técnica descrita en detalle por Lindholm y Piehl (1974). Las biopsias fueron del músculo Gluteus medius derecho a tres niveles de profundidad: 20 mm (región superficial), 40 mm (región media) y 60 mm (región profunda). Todas las muestras fueron tomadas por la misma persona, con experiencia en la extracción de biopsias musculares. La biopsia se realizó sobre la línea que une la tuberosidad coxal con el nacimiento de la cola, a una distancia que varió entre 100 y 150 mm desde la tuberosidad coxal, de acuerdo con la raza, edad y conformación de la grupa de cada animal (Lindholm y Piehl, 1974).

Para asegurar la profundidad exacta de cada muestra se emplearon cánulas metálicas de distintas longitudes diseñadas para que la ventana de la aguja se abra sólo a la profundidad deseada.

Para los análisis histoquímicos, los trozos de tejido muscular, de 75 a 100 mg de peso, fueron montados en corchos usando OCT embedding medium (Tissue-Tek II, Miles Laboratories, Naperville, IL, USA) y orientados para obtener cortes transversales de las fibras musculares. Estas muestras fueron congeladas por inmersión en isopentano (durante 30 segundos), y almacenadas a temperatura de su punto de congelación con nitrógeno líquido hasta su procesamiento histoquímico.

Métodos histoquímico-enzimáticos. De cada muestra se obtuvieron cortes seriados de 10 µm de grosor en un criostato a ?20° C que fueron incubados para demostrar su actividad adenosín trifosfatasa miofibrilar activada por calcio (mATPasa, Enzyme Commission, E.C., 3.6.1.3) a pH 9.4 después de tres preincubaciones a pH 10.3, 4.5 y 4.2. Para evaluar la capacidad oxidativa de los tipos de fibras se utilizó la técnica de NADH-tetrazolium reductasa (NADH-TR, E.C., 1.6.99.3). Para estimar cualitativamente el potencial glucolítico de las miofibras se empleó a-glicerofosfato deshidrogenasa unido a menadione (GPD, E. C., 1.1.99.5). Todos los métodos histoquímicos usados fueron los descritos por Dubowitz (1985).

Las fibras musculares fueron clasificadas como tipo I (contracción lenta) y tipos IIA, IIB y IIC (contracción rápida) de acuerdo a lo propuesto por Dubowitz (1985) según el patrón de tinción con la técnica de mATPasa. Las fibras intermedias tipo IIAB (White y Snow, 1985) fueron redistribuidas por partes iguales dentro de las poblaciones fibrilares IIA y IIB (Fry y col., 1994). Además, las fibras tipo IIC estuvieron ausentes o fueron muy escasas (<1-2%) y se incluyeron en el grupo de fibras tipo IIB (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985). Las fibras tipo IIB fueron nuevamente subdivididas en dos subgrupos según la intensidad de reacción con la técnica de NADH-TR: IIB oxidativas y IIB no oxidativas (López-Rivero y col., 1991). Se clasificaron como fibras con baja capacidad oxidativa las fibras no coloreadas en su parte periférica y con un color blanco-azulado uniforme en el centro.

De los cortes seriados teñidos por mATPasa tras preincubación a pH 4.5 y NADH-TR se obtuvieron fotomicrografías (x 200 aumentos) usando un microscopio óptico Leitz Wetzlar Dialux 20EB. Para obtener los datos del porcentaje fibrilar se examinó un área representativa de cada biopsia (rango 250000-500000 µm²). Las frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB y de los subtipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculadas sobre las fotomicrografías mediante el cómputo de un promedio de 400 fibras/biopsia.

Análisis estadístico. La variabilidad de la frecuencia relativa de los tipos de fibras fue expresada por la desviación típica. Los componentes de la varianza total de los porcentajes fibrilares, para cada caballo, fueron evaluados a cada profundidad por un análisis múltiple de varianza de tres factores (MANOVA) según el siguiente modelo (SAS Institute 1982):

Y_ijkl = µ + E_i + S_j + CR_k + CI + Error_l(ijk)

donde los factores fueron edad (E), sexo (S) y categoría de rendimiento (CR) y donde µ es la media poblacional del porcentaje un tipo de fibra en cada muestra biópsica. Debido a la influencia de la raza Arabe en todos los caballos de este estudio, la varianza ligada a la raza fue incluida en el coeficiente de error aleatorio (Error_l(ijk)). Los efectos de los factores examinados fueron considerados significativos con una probabilidad p<0.05. Las variaciones de las características musculares entre categorías de rendimiento fueron analizadas mediante un análisis de covarianza (ANCOVA) para corregir la influencia que la profundidad de la muestra ejerce sobre los porcentajes fibrilares. Para cada categoría de rendimiento se calcularon las ecuaciones de regresión lineal de los porcentajes fibrilares, frente a la profundidad de muestreo.

RESULTADOS

La influencia de la edad y el sexo en la proporción de los distintos tipos de fibras no fue significativa (p>0.05). Por ello, los resultados globales son presentados por categorías de rendimiento, sin considerar las edades ni el sexo.

La categoría de rendimiento influyó significa-tivamente (p<0.05, MANOVA de 3 factores) sobre los porcentajes fibrilares. Los porcentajes de los tipos de fibras fueron marcadamente distintos en ambos grupos de animales (cuadro 2). A una profundidad determinada del músculo, el Grupo CRE presentó mayor porcentaje de fibras tipo I y menor proporción de fibras tipo IIB, particularmente del subtipo IIB no oxidativas, que el Grupo CRM. Las fibras IIA fueron más numerosas en el Grupo CRE, pero esta diferencia fue significativa sólo a 40 mm de profundidad (p<0.05).

El ANCOVA aplicado al material en conjunto permitió diferenciar los efectos de la profundidad de la muestra y la categoría de rendimiento (cuadro 3). Los valores F asociados a la varianza provocada por la profundidad de la toma de muestras fueron mayores que los relacionados con el efecto de la categoría de rendimiento, especialmente para los porcentajes de fibras tipo I, IIB y IIB oxidativas.

En ambos grupos los porcentajes de todos los tipos de fibras cambiaron significativamente en función de la profundidad de muestreo, pero la tasa de cambio no fue idéntica (cuadro 4). Así, entre las profundidades a 20 mm y 60 mm, la proporción de fibras tipo I aumentó un 135% en el Grupo CRE y el 100% en el Grupo CRM (p<0.01 entre las pendientes de sus rectas de regresión), mientras que las fibras tipo IIB y IIB oxidativas disminuyeron el 95% y 93%, respectivamente, en el Grupo CRE y el 57% y 40%, respectivamente, en el Grupo CRM (p<0.05).

DISCUSION

Las principales observaciones del presente estudio indicaron que las fibras tipo I y IIA fueron más abundantes en los equinos del Grupo CRE que en los del Grupo CRM; las fibras tipo IIB, incluyendo los subtipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas, mostraron el patrón opuesto. Además, la tasa de cambio con la profundidad del porcentaje de las miofibras fue generalmente mayor en el Grupo CRE que en el Grupo CRM, especialmente para las fibras tipo I. En general, estos resultados coinciden con los de Snow y col. (1981) y Hodgson y col. (1983), pero difieren de los obtenidos por Essén-Gustavsson y col. (1984), quienes no observaron diferencias significativas entre caballos con diferentes resultados en la competición. Estos tres estudios estuvieron basados en el examen de una sola biopsia del músculo Gluteus medius, mientras que nuestro estudio proporciona mayor información sobre la proporción de los distintos tipos de fibras en muestras tomadas a distintas profundidades de dicho músculo.

En el presente estudio no se encontraron diferencias significativas entre sexos en la proporción de los tipos de fibras. Este hecho coincide con los resultados obtenidos en equinos fina sangre de carreras (Ronéus y col., 1991) y trotadores (Ronéus, 1993). Así, y aunque en nuestro estudio no hay equilibrio entre el número de machos y hembras incluidos en cada categoría (cuadro 1), este factor no debe haber influido significa-tivamente sobre los resultados. En equinos, durante el desarrollo postnatal y la maduración, la proporción de fibras de contracción lenta respecto a la de fibras rápidas es dinámica (y plástica) independientemente del efecto del entrenamiento, lo que parece estar relacionado con la necesidad de hacer frente a mayores demandas posturales y propulsivas (Rivero y col., 1993a). La mayoría de estudios longitudinales sobre el entrenamiento en equinos no han descrito una interconversión entre fibras de tipo I y II (Lindholm y Piehl, 1974; Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Hodgson y col., 1986; Hodgson y Rose, 1987; Essén-Gustavsson y col., 1989; Gottlieb y col., 1989; López-Rivero y col., 1991). Por el contrario, un incremento significativo (p<0.05) del porcentaje de fibras de tipo I con el entrenamiento sí fue descrito en otros casos (Henckel, 1983; Ronéus y col., 1987; Rivero y col., 1995).

En el presente estudio las diferencias en las características musculares observadas entre equinos jóvenes y adultos no fueron significativas. Aunque no se cuantificó, los equinos adultos habían sido entrenados durante un período de tiempo más prolongado que los jóvenes. Esto sugiere la posibilidad de que el entrenamiento no haya sido el principal causante de la alta proporción de fibras de tipo I observada en los equinos con excelente rendimiento y, por tanto, esta característica muscular puede ser más bien el resultado de la selección genética que del entrenamiento.

Klitgaard y col. (1990a, b), usando técnicas de electroforesis de las cadenas pesadas de miosina en fibras musculares individuales combinado con el método histoquímico de mATPasa, demostraron que este procedimiento histoquímico puede no ser adecuado para detectar modificaciones sutiles en la composición de las cadenas pesadas de miosina en el músculo de atletas humanos. Estos investigadores encontraron en atletas, que habían seguido un entrenamiento de resistencia, que el 95% de las fibras con coexpresión de cadenas pesadas tipo I y IIA contienen mayor proporción de cadenas pesadas tipo I y, por tanto, reaccionan histoquímicamente como tipo I. Se podría esperar que el entrenamiento de resistencia produzca una transformación gradual en el contenido de cadenas pesadas de las fibras desde tipo IIA a tipo I, el cual no sería detectado por la técnica histoquímica de mATPasa.

El mayor valor del ratio de fibras tipo IIA/IIB y el menor porcentaje de fibras tipo IIB no oxidativas encontrado en los equinos del Grupo CRE puede ser una consecuencia del entrenamiento, ya que con un entrenamiento suficiente los subtipos de fibras de contracción rápida (tipo II) pueden cambiar sus propiedades contráctiles y aumentar su capacidad oxidativa (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Hodgson y col., 1986; López-Rivero y col., 1991). Las fibras IIB oxidativas pueden considerarse homólogas a las fibras tipo IIAB (White y Snow, 1985; Rivero y col., 1996a, b) y ser un estado transitorio en la conversión IIB no oxidativas<->IIA (López-Rivero y col., 1991). El tamaño y abastecimiento capilar de estas fibras es intermedio entre el de las fibras IIB no oxidativas y IIA (Rivero y col., 1995, presentes resultados). Se podría esperar que su potencial oxidativo también debería ser intermedio.

Las mayores tasas de cambio con la profundidad de la proporción de todos los tipos de fibras, particularmente de los tipos I y IIB, en los caballos del Grupo CRE respecto al Grupo CRM pueden ser debidas a los distintos patrones de uso del músculo Gluteus medius equino durante la postura y el movimiento. Las regiones profundas del músculo, con una mayor proporción de fibras de tipo I, con un metabolismo predominantemente aeróbico, están mejor dotadas para el mantenimiento postural y actividades de baja intensidad y larga duración. Por el contrario, la mayor proporción de fibras IIB (especialmente no oxidativas) indica un patrón funcional distinto, al intervenir en la generación de fuerza propulsiva, rápida y de corta duración (López-Rivero y col., 1992). Es, por tanto, coherente el que las diferencias en los porcentajes de las fibras musculares entre caballos con distintas capacidades de resistencia fueran más pronunciadas en la parte profunda que en la región superficial del músculo. Esto también es avalado por el incremento significativo de la proporción de fibras tipo IIA a mayor profundidad en caballos sometidos a un entrenamiento de resistencia (presente estudio) pero no en caballos sedentarios (López-Rivero y col., 1992).

Aunque este y otros estudios previos en equinos de resistencia (Hodgson y col., 1983; Snow y col., 1981) han descrito una correlación significativa entre las características miofibrilares y el rendimiento deportivo, se ha manifestado que la proporción de los tipos de fibras determinada a partir de una pequeña muestra no es un indicador fiable de la capacidad atlética (Hodgson y col., 1983). Una explicación para esta valoración es que una sola biopsia no representa adecuadamente la totalidad del músculo como consecuencia de la gran variabilidad en las propiedades fibrilares (López-Rivero y col., 1992). Sin embargo, Lexell y col. (1985) concluyeron que se puede minimizar la varianza de este procedimiento de muestreo obteniendo varias biopsias a diferentes profundidades del músculo. Para el músculo Gluteus medius equino sugerimos examinar tres muestras biópsicas tomadas a profundidades de 20, 40 y 60 mm (regiones superficial, media y profunda, respectivamente), lo que permite conocer el perfil del músculo mediante el estudio de la regresión con la profundidad de los distintos parámetros musculares.

Los resultados del presente estudio demuestran la existencia de diferencias significativas en el perfil histoquímico del músculo Gluteus medius entre equinos con distinto historial en carreras de larga distancia. Los mejores equinos de resistencia tuvieron mayor proporción de las fibras tipo I y IIA, y menor porcentaje de fibras tipo IIB en el músculo que los individuos con resultados moderados en la competición. Las diferencias en la distribución de los tipos de fibras fueron más pronunciadas en la región profunda del músculo y probablemente obedecen a sus diferentes demandas funcionales. Dado que existe una buena correlación entre la distribución de los tipos de fibras en el músculo Gluteus medius y la aptitud atlética individual de caballos de resistencia, los presentes resultados indican la posibilidad de obtener un índice basado en el análisis de múltiples biopsias que permita estimar con fiabilidad las limitaciones atléticas de un determinado caballo.

RESUMEN

Se obtuvieron biopsias a tres profundidades distintas del músculo Gluteus medius en 36 equinos participantes en carreras de larga distancia de nivel nacional e internacional, de 8.42  ± 2.85 años de edad y ambos sexos. Veinte animales fueron considerados con un rendimiento excelente en la competición de acuerdo con la velocidad media de sus tres mejores registros en carreras de resistencia durante los dos o tres años previos al estudio, mientras que 16 tuvieron un rendimiento moderado. Los equinos con rendimiento excelente tuvieron un mayor porcentaje de fibras tipo I y IIA (alta y baja actividad adenosintrifosfatasa miofibrilar a pH 4.5, respectivamente) y un menor porcentaje de fibras IIB (moderada actividad adenosintrifosfatasa miofibrilar a pH 4.5), incluyendo ambos tipos de fibras IIB oxidativas (moderada a alta actividad NADH-tetrazolium reductasa) y IIB no oxidativas (baja actividad NADH-tetrazolium reductasa). Las diferencias en la distribución de los tipos de fibras fueron más acusadas en la parte profunda del músculo. Estos resultados indican que la distribución fibrilar del músculo Gluteus medius se relacionaría con la capacidad atlética de equinos para pruebas de resistencia.
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Aceptado: 16.01.1998.
* Estudio financiado por la Junta de Andalucía (Grupo 2001) y la Universidad de Córdoba.

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