G. Dasso, M. V.; M. S. Fernandez, M. Sc.;1 J. L. Arias, M.V.1
Due to limitations in the availability of autogeneic bone and to the inefficiency of the fresh allogeneic bone grafts, it has been necessary to evaluate the use of allogeneic processed bone. Therefore, the ability of three procedures -freezing, boiling and desproteinization of allogeneic bone- to repair experimentally created defects in rabbit tibia was tested.
Tibia, 2, 4 and 8 weeks after surgery were histologically analysed. Although there were no differences at 2 weeks, desproteinization was notoriously better at 4 and 8 weeks as compared with frozen or boiled bone allografts.
Palabras claves: reparación ósea, aloimplantes.
Key words: bone repair, allografts.
INTRODUCCION
El tejido óseo presenta una característica única, que es la de reparar sus soluciones de continuidad con un tejido igual al original (Behn, 1993), es decir, es capaz de regenerar (Caplan, 1990).
Este fenómeno se ha percibido desde hace tiempo, lo que ha llevado a intentar trasplantar el hueso a las extremidades que sufren patologías osteoarticulares debidas a problemas genéticos, fracturas, presencia de tumores o inflamaciones crónicas tan importantes tanto en animales domésticos como en el hombre (Pérez, 1993).
Cuando el defecto óseo por su extensión no es capaz de reparar en forma espontánea, es necesario recurrir a la técnica de los implantes biológicos. La obtención de tejidos es a partir de fuentes donantes, como lo es el mismo individuo o individuos de la misma o diferente especie (Pérez, 1993).
El hueso de origen autogénico (proveniente del mismo individuo) ha mostrado ser el mejor recurso biológico para la reparación y reconstrucción del sistema esquelético (Calvo, 1993), por carecer de un potencial rechazo inmunológico y su rápida revascularización (Perrot y col., 1992). Sin embargo, sus desventajas relacionadas con la morbilidad y riesgo de infección en la zona dadora, el incremento de las pérdidas sanguíneas, la anestesia y tiempo operatorio prolongado, la molestia postoperatoria, la necesidad de sacrificar estructuras normales de cualquier parte del organismo, la cantidad de tejido obtenible (Calvo, 1993) y la incapacidad de reconstruir segmentos grandes de hueso limitan su aplicación (Perrot y col., 1992), lo que ha hecho necesaria la exploración del uso de huesos y cartílagos de origen alogénico (proveniente de individuos de la misma especie) e incluso xenogénico (proveniente de individuos de otra especie) (Friedlaender y Goldberg, 1991).
Desgraciadamente los aloimplantes frescos han sido clínicamente insatisfactorios debido a la respuesta inmune que generan, la cual puede causar un número alto de fracasos en estos implantes y a la lentitud de su incorporación. Esto ha determinado el uso de aloimplantes preservados para disminuir la antigenicidad y para mejorar la incorporación (Friedlaender y Goldberg, 1991).
Los implantes óseos cumplen dos funciones principales: proveer un sustrato para la generación de nuevo hueso (osteogénesis) y servir de soporte mecánico (Friedlaender y Goldberg, 1991).
La incorporación de los implantes de hueso comienza con la inflamación, seguida por la revascularización, osteogénesis (Goldberg y Stevenson, 1987; Poussa y col, 1981) y remodelación, terminando en una estructura mecánicamente eficiente (Friedlaender y Goldberg, 1991).
METODOS DE CONSERVACION
Las técnicas de conservación están orientadas a mantener en el implante las propiedades mecánicas y la habilidad de estimular la osteogénesis mientras que disminuye la antigenicidad (Friedlaender y Goldberg, 1991), al tiempo que es mantenido en forma estéril. Esto es el banco de huesos (Pérez, 1993).
Existen numerosos métodos usados para la conservación de hueso por un período de tiempo largo. Los más utilizados son liofilización, congelación (nitrógeno líquido), desmineralización o combinaciones de estos métodos. Esto refleja que el hueso no necesita mantener su viabilidad celular para ser útil biológicamente (Friedlaender y Goldberg, 1991).
Liofilización: Debido a su costo, operación y a la fragilidad mecánica del hueso (Pérez, 1993) su utilización se limita preferentemente a implantes pequeños (Calvo, 1993). Esta técnica no es compatible con la conservación de cartílago (Friedlaender, 1987), rompe las membranas celulares y quizás altera la vía por la cual los antígenos de superficie son presentados al huésped, alterando así su inmunogenicidad (Friedlaender y col., 1976).
Congelación: La congelación es el principal método utilizado en el almacenaje de aloimplantes de hueso. La gama de temperaturas recomendadas varía entre -20° y -190° (Pérez, 1993). Se recomienda una temperatura de almacenaje de ?80°C o menos, por un máximo de 5 años. (Hansen y cols., 1994). El mecanismo de acción de esta técnica sería similar al de la liofilización (Friedlaender y col., 1976).
Desmineralización: El uso de hueso desmineralizado posee un alto potencial osteogénico pero una reducida resistencia estructural (Friedlaender, 1987).
Una manera de acercarse al problema es evaluar aloimplantes sometidos a diferentes métodos de conservación con respecto a su potencial osteogénico una vez que han sido implantados. Entre éstos el uso de hipoclorito de sodio no ha sido ensayado, y constituye el aspecto más original del presente estudio.
El objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de los aloimplantes de hueso esponjoso procesados en relación a su utilidad en la reparación de lesiones del sistema esquelético.
MATERIAL Y METODOS
Se utilizaron 27 conejos, raza Blanco Neo-zelandés, de 3 a 5 meses de edad y con un peso de 1.700 a 2.700 gramos. Se dividieron en tres grupos de 9 animales cada uno. Cada uno de estos grupos fue subdividido a su vez en tres series de tres conejos, quienes recibieron los diferentes aloimplantes tratados (desproteinizados, congelados o hervidos). Los animales fueron sacrificados a las 2, 4 y 8 semanas postcirugía.
PROCEDIMIENTO QUIRURGICO
Como preanestésicos se utilizaron sulfato de atropina 0.04 mg/kg de peso intramuscular (IM) y clorhidrato de clorpromazina 3 mg/kg de peso IM. La anestesia general se logró a través de tiopental sódico 30 mg/kg de peso intravenoso.
El abordaje quirúrgico se realizó a través de una incisión medial de 3 a 4 cm de longitud a nivel del tercio proximal de la tibia. Se desplazó el periostio y se realizó una lesión circular de 4 mm de diámetro hasta llegar a la cavidad medular con un taladro eléctrico de baja revolución y una broca de 4 mm. El aloimplante se ajustó a presión en el sitio de la lesión y se cubrió con el periostio desplazado previamente.
GRUPO CONTROL
Se utilizaron los miembros opuestos a los implantados, los que fueron sometidos a los mismos procedimientos que el grupo en estudio, excepto que éstos no recibieron implantes óseos.
Se utilizaron además como control cortes histológicos de implantes después de ser procesados, para determinar el tipo de tejido presente y así poder compararlo posteriormente con la muestra recuperada del animal una vez sacrificado.
OBTENCION DEL IMPLANTE
La totalidad de los implantes fueron recolectados de la región esponjosa del trocánter mayor del fémur de donantes de la misma especie de un peso similar entre ellos. Para esto se utilizó una sierra y un sacabocados de 4 mm de diámetro, obteniéndose implantes de forma cilíndrica que posteriormente fueron lavados con agua destilada.
Los implantes fueron sometidos a tres tratamientos:
1. Implantes congelados: Inmediatamente de obtenidos, los cilindros fueron colocados en nitrógeno líquido por 5 días. Luego fueron retirados del nitrógeno líquido y sometidos a temperaturas de ?70°C y ?20°C por 48 hrs en cada caso, manteniéndose posteriormente a ?12°C hasta su utilización. Previo uso fueron expuestos a temperatura ambiente por una hora bajo condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. La congelación rompe las membranas celulares y quizás altera la vía por la cual los antígenos de superficie son presentados al huésped alterando así la inmunogenicidad del implante (Friedlaender y col., 1976)
2. Implantes hervidos: Inmediatamente de obtenidos los cilindros fueron hervidos en agua destilada por una hora. Luego se lavaron en solución Tyrode, manteniéndose posteriormente a 4°C en esta solución hasta su utilización. Previo uso fueron expuestos a temperatura ambiente por una hora bajo condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. Con este tratamiento los implantes conservan sus componentes orgánicos aunque alterados, ya que se produce coagulación de las proteínas y parte del colágeno se transforma en gelatina, lo que produce una gran diferencia en sus propiedades físicas (Holmtrand, 1957).
3. Implantes desproteinizados: Inmediatamente de ser obtenidos los cilindros fueron colocados en hipoclorito de sodio al 10% por treinta minutos. Luego se lavaron en solución Tyrode, manteniéndose posteriormente a 4°C en esta solución hasta su utilización. Previo uso fueron expuestos a temperatura ambiente por una hora bajo condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. Con este tratamiento se conservan sólo los componentes inorgánicos del implante.
EVALUACION HISTOLOGICA
La descalcificación se realizó con una solución en base a ácido clorhídrico RDO (Apex Engineering Products Corporation) por 20 días. La tinción utilizada fue Mallory-Heindenhein.
A través de los cortes histológicos se evaluó:
- El tipo de tejido presente en el implante, comparado con el cilindro
antes de implantar.
- El grado de reparación en la zona con implante, comparado
con el control sin implante.
- El tipo de hueso formado temporal y espacialmente en la zona.
RESULTADOS
Grupos controles: Se evaluó en 27 conejos la reparación de la lesión provocada en el miembro que no recibió implante. Los animales se dividieron en tres series, sacrificados a diferentes tiempos postcirugía.
Serie A: Evaluación a las dos semanas post-cirugía. En esta serie la reparación de la lesión fue aproximadamente de un 30% con hueso neoformado de tipo trabecular con pequeñas espículas en el centro de la lesión y grandes zonas donde aún no había reparación (figuras 1a y 2a).
Serie B: Evaluación a las cuatro semanas post-cirugía. En esta serie la reparación del defecto alcanzó a un 50%, observándose hueso neoformado de tipo compacto inmaduro con espacios de tamaño mediano donde no se formó hueso y no se alcanzó el nivel del hueso adyacente (figura 3a).
Control group, 2 weeks. a: Estimated repair 30% with trabecular neoformed bone (T) and small spicules (E) formed from periosteum (P) to marrow cavity (M), together with large regions where bone has not been formed (*). (40X).
Experimental group, 2 weeks. b: Frozen graft. Note trabecular neoformed bone (T) associated to the marrow border (arrow). (40X). c: Bleach graft. Trabecular neoformed bone (T) around defect boundaries and graft trabecules (i). (40X) d: Boiled graft. Trabecular neoformed bone (T) at the defect extremes and between graft trabecules (i). (40X). Mallory- Heindenhein stainning.
Control group, 2 weeks. a: Note trabecular neoformed bone (t)
with osteoblast (o) on their surface (100X).
Experimental group, 2 weeks. b: Frozen graft. High magnification of the
insert on figure 1 picture b. Note graft trabecules (i) surrounded by indifferenciated
cells (c). (200X). c: Bleach graft: High magnification of the insert on figure
1 picture c. Neoformed bone (n) between graft trabecules (i) with large number
of osteoblast (o) on their surface is shown. Graft act as a base for neoformed
bone. (100X). d: Boiled graft. High magnification of the insert on figure
1 picture d. Two neoformed bone trabecules are shown (n) surrounded by osteoblast
(o). (200X). Mallory-Heindenhein stainning.
Serie C: Evaluación a las ocho semanas post-cirugía. En esta serie la reparación de la lesión fue de aproximadamente un 75% con hueso neoformado de tipo compacto con pequeños espacios donde no se formó hueso y no se alcanzó totalmente el nivel del hueso adyacente (figura 4a).
Grupos tratados: Se evaluó en 27 conejos la reparación de la lesión provocada en el miembro que recibió implante. Los animales se dividieron en tres series, sacrificados a diferentes tiempos postcirugía.
Serie A: Evaluación a las dos semanas post-cirugía. En esta serie la reparación de la lesión fue en base a hueso neoformado de tipo trabecular. El mayor grado de reparación del defecto fue en los grupos de conejos que recibieron los aloimplantes tratados con hipoclorito de sodio (figuras 1c y 2c) y ebullición (figuras 1d y 2d). En ambos grupos el hueso neoformado se presentó tanto en los bordes de la lesión como entre las trabéculas del implante. El menor grado de reparación se observó en el grupo de aloimplantes tratados por congelación (figuras 1b y 2b); en estos el hueso neoformado se ubicó sólo en los bordes laterales del defecto.
No se pudo determinar un porcentaje de reparación en esta serie, ya que en ésta se observó sólo en pequeños sectores del defecto; la mayor parte de la lesión fue ocupada por el implante, en cuya superficie se visualizaron células indiferenciadas. Las trabéculas del implante se presentaron discontinuas.
Serie B: Evaluación a las cuatro semanas post-cirugía. En esta serie la reparación de la lesión fue en base a hueso neoformado de tipo compacto inmaduro. El mayor grado de reparación se observó claramente en el grupo de conejos con aloimplantes tratados con hipoclorito de sodio (figura 3c), aproximadamente un 50%, seguido del grupo tratado por congelación (figura 3b); en ambos grupos el hueso neoformado se presentó tanto en los bordes como entre las trabéculas del implante. En el grupo de conejos con aloimplantes tratados con ebullición se observó el menor grado de reparación (figura 3d); en éstos el hueso neoformado se observó prácticamente sólo en los bordes laterales de la lesión. Los conejos con implantes tratados por congelación y ebullición presentaron un grado de reparación similar a la observada para estos tratamientos a las dos semanas post-cirugía.
En los tres tratamientos las trabéculas del implante se observaron discontinuas y en el grupo de conejos con aloimplantes tratados con hipoclorito de sodio éstas eran escasas. En la superficie de las trabéculas del implante se visualizaron osteoclastos.
Serie C: Evaluación a las ocho semanas post-cirugía. En esta serie la reparación de la lesión fue en base a hueso compacto, el que ocupó parte del defecto sin alcanzar el nivel del hueso adyacente. El mayor grado de reparación de la lesión se observó claramente en el grupo de aloimplantes tratados con hipoclorito de sodio (figura 4c) con aproximadamente un 90% de reparación con pequeños espacios donde no se formó neohueso. El grupo con aloimplantes tratados por congelación presentó aproximadamente un 50% de reparación (figura 4b). Por último el grupo de conejos en los que se utilizaron los implantes tratados con ebullición presentó sólo un 40% de reparación con grandes zonas donde no se formó hueso (figura 4d).
Se observaron escasas trabéculas del implante con osteoclastos en su superficie. En los grupos con implantes tratados con hipoclorito de sodio y ebullición no se observó el implante en la mayoría de los casos.
DISCUSION
De los tres tratamientos analizados en este estudio el hipoclorito de sodio fue el más eficiente, seguido de la congelación y en último lugar de la ebullición. Esto se debe a que el hipoclorito de sodio al oxidar y destruir los componentes orgánicos destruye también los elementos antigénicos presentes en el implante, disminuyendo de esta manera las posibilidades de rechazo por parte del huésped y facilitando la llegada de células indiferenciadas desde el periostio, endostio y médula ósea, las que se ubican entre las trabéculas del implante y se diferencian a osteoblastos formando así el neohueso. Esta eficiencia se refleja además por la gran actividad osteoclástica presente en las trabéculas del implante. De esta manera es posible concluir preliminarmente que, en las condiciones del diseño experimental empleado, el aloimplante sometido a desproteinización con hipoclorito de sodio se muestra con propiedades reparativas más ventajosas que los otros aloimplantes utilizados.
En segundo lugar de eficiencia osteogénica se ubica el método de congelación por las características antes descritas y en último lugar están los implantes tratados con ebullición, ya que la cocción produciría un cambio de la organización estructural del hueso junto con una coagulación de las proteínas (Holmtrand, 1957), lo que se traduce en una inefectividad de las proteínas osteoinductivas como la proteína morfogenética del hueso, la que modula el reclutamiento y diferenciación de las células mesenquimáticas a osteoblastos (Friedlaender y Goldberg, 1991).
El mayor grado de reparación observado en los grupos controles al compararlo con los grupos tratados, se explicaría por el tamaño de la lesión, la que al ser capaz de reparar por sí sola, en el grupo control comenzó inmediatamente la síntesis de hueso, a diferencia del grupo tratado en el cual en forma paralela a la síntesis de neohueso ocurre la reabsorción del implante, lo que evidentemente retarda la reparación, haciéndola más lenta que la observada en el grupo control. Si la lesión, hubiese sido lo suficientemente grande, para no reparar por sí sola, hubiese sido posible observar mayor reparación posiblemente en el grupo con implante tratado con hipoclorito de sodio que la observada en el grupo control. El diseño experimental de la lesión utilizada en el presente trabajo fue sensible para visualizar los principales cambios histológicos que ocurren durante la reparación espontánea o influenciada por aloimplantes sometidos a diversos tratamientos. No obstante lo anterior, el modelo no fue suficientemente sensible para verificar los cambios más finos que permitieran evaluar con mayor precisión la bondad práctica de los distintos tratamientos de los aloimplantes en su capacidad reparativa.
La reparación de las lesiones ocurrió a través de osificación directa, sin formación de cartílago intermediario. Esta situación se explica por el hecho de que no se realizó una fractura completa del hueso sino que sólo se realizó una lesión circular, por lo cual no hubo movimiento, comportándose por lo tanto como una fractura estable en la cual las células mesenquimáticas se diferencian a osteoblastos, los que sintetizan hueso sin formación de cartílago intermediario (Caplan y Boyan, 1994).
Como sabemos, la gran limitante de los autoimplantes es la baja disponibilidad de material. Los sustitutos óseos como la hidroxiapatita, cerámicas, titanio o combinaciones de materiales han sido utilizados con éxito variable (Beck y col., 1991), y los aloimplantes frescos han sido clínicamente insatisfactorios debido a la respuesta inmune que generan (Friedlaender y Goldberg, 1991). Con la instalación en el futuro de un banco de huesos alogénicos o incluso xenogénicos procesados se tendría una cantidad de material ilimitado, lo que permitiría realizar las cirugías y hacer los moldes de hueso según el tipo de patología osteoarticular que se presente. Con esto se obtendrían grandes progresos no sólo estéticos sino también funcionales, mejorando la calidad de vida de nuestros pacientes al salvar miembros destruidos o traumatizados por lesiones que no pueden reparar por sí solas.
Este estudio servirá como base para continuar la investigación en el área de los implantes óseos tan atractiva en la medicina ortopédica y en un futuro cercano hacer de esta técnica un procedimiento común en el tratamiento de nuestros pacientes cuando la lesión producida así lo indique. Se sugiere seguir los estudios extremando las condiciones experimentales, aumentando la superficie de la lesión y evaluando además otros tiempos de raparación con metodologías morfológicas, ultraestructurales, bioquímicas y biomecánicas más finas.
RESUMEN
Debido a las limitantes de los implantes de hueso de origen autogénico y a la ineficiencia de los implantes de hueso fresco de origen alogénico ha sido necesario incursionar en el área de los implantes de hueso alogénico procesados. Con este objetivo se utilizaron 27 conejos raza blanco neozelandés de 3 a 5 meses de edad, quienes recibieron los diferentes tipos de aloimplantes de hueso esponjoso (desproteinizados, congelados o hervidos) para evaluar el grado de reparación de una lesión previamente realizada en la tibia.
Los animales fueron sacrificados a las dos, cuatro y ocho semanas postcirugía y la evaluación se realizó a través de cortes histológicos. Determinándose que a las dos semanas post-cirugía no hubo mayor diferencia entre los distintos grupos analizados, pero sí lo hubo a las cuatro y ocho semanas post-cirugía, donde se observó claramente una mayor eficiencia de los implantes desproteinizados. Esto se debe a que el hipoclorito de sodio destruye los elementos antigénicos presentes en el implante, lo que disminuye las probabilidades de rechazo por parte del huésped y facilita la llegada de células indiferenciadas que se diferencian a osteoblastos formando así hueso neoformado, por lo tanto, esto se refleja en un mayor grado de reparación en comparación con los implantes tratados por congelación y más aún si lo comparamos con los aloimplantes tratados por ebullición.
Esta información puede ser de gran utilidad para la implementación
de un banco de huesos destinado a corregir lesiones del sistema esquelético.
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Aceptado: 05.5.98.
Parcialmente financiado por el Proyecto FONDECYT 1931136.
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