N.I. Montaña S.¹, Bact. M. Sc.; O.E. Rueda L.², Micr., M. Sc.; C.P. Calderon P.¹, Bact.; A. Ortega¹, Bact.; A .R. Puentes¹, Bact.; M.I. Gallego M.¹, M.V., M. Sc.;. O.C. Mariño J.², Micr. M. Sc. Ph.D.

In order to comparatively evaluate the type of immune response induced by purified structural Brucella abortus antigens as well as live vaccines, 14 criollo heifers, 19 months old, were randomly distributed in five experimental groups and immunised subcutaneously with: B. abortus purified outer membrane proteins (OMP-II), B. abortus OMP-II coupled to O-chain, viable B. abortus strain RB51, viable B. abortus strain 19 (C19). A sterile saline solution was used for the control group. Two months after vaccination the animals were challenged intramuscularly with reference virulent strain B. abortus 2308. 30 days after challenge the protection level was evaluated. The humoral immune response was evaluated using conventional Rose Bengal agglutination test, complement fixation test, radial immunodiffusion as well as ELISA, western blot and dot blot assays at days 0, 8, 15, 30, 60 and 90. Additionally, the specific IgG2 isotype response was determined by double sandwich ELISA. To evaluate cellular immune responses, lymphocyte proliferation was measured by timidine incorporation and expressed as stimulation index (S.I.), IFN-? activity by ELISA and CD4/CD8 ratio by fluorocitometry. Animals vaccinated with live strains presented 100% protection against challenge, while a 66% protection was observed in those vaccinated with purified antigens. The diagnostic advantage of B. abortus strain RB51 was evidenced by the lack of humoral immune responses against sLPS in all vaccinated groups except for the strain 19 group. No significant differences (p>0.05) were detected in any of the groups by lymphoproliferation when stimulated in vitro with purified OMP-II, O-chain or sLPS. When crude soluble RB51 protein was used, S.I. turned significant (p<0.05) and indicated a better response induced by the live vaccines. IFN-?-ELISA tests with stimulated tissue cultures performed better when measured 72 hour after antigen exposure. In reference to the experimental groups, higher levels were detected in the groups immunised with live vaccine, mainly strain 19. When CD4/CD8 ratio were considered the values were constant during the observation and no differences were observed. The results confirm that B. abortus strain RB51 induced level of protection similar to strain 19, and had the advantage of differential diagnosis. Purified antigens OMP-II and OMP-II-O-chain, induced a lower level of protection but they performed similar to replicating vaccines indicating the immunodominance of OMP-II, but suggesting the need of multiple doses to reach the same level of protection. It is proposed that the protection observed in animals vaccinated with B. abortus RB51 is the result of stimulation of both T CD4 Th1 and CD8 lymphocytes by the peptides of the outer membrane proteins.

Palabras claves: vacunas estructurales, isotipos IgG, CD4/CD8, INF-g, blastogénesis.

Key words: structural vaccines , IgG isotypes, CD4/CD8, INF-g, blastogenesis.

INTRODUCCION

Los mecanismos de respuesta celular a microorganismos de replicación intracelular como es el caso de la Brucella han sido estudiados ampliamente, sin llegar a un entendimiento completo de cómo se logra la protección; sin embargo, hasta el momento se ha establecido que para conseguirla se necesitan diversos tipos de reacción, entre otros: fagocitosis, en la cual se produce la muerte del microorganismo en macrófagos activados por la acción de citoquinas a su vez producidas por los linfocitos T, especialmente el INFg. Lisis de células infectadas por acción de los linfocitos T citotóxicos tipo CD 8+. A su vez, los linfocitos T gd podrían participar en este proceso a través de la producción de citoquinas y actividades citolíticas (Abbas, 1992; Paul, 1992). En bovinos las tres mayores subpoblaciones de linfocitos en periferia son las denominadas: BoCD 4+, las que comprenden entre el 20 y el 40%; BoCD 8+ entre el 20 y 30%. Las células T gd entre el 30 y el 50%; la elevada proporción de esta subpoblación sugiere que estas células podrían jugar un papel clave en protección (Havran, Boismenu, 1994; Hein, y col., 1991). Los trabajos en inmunización para la activación efectiva de estos mecanismos en brucelosis no han logrado vacunas capaces de inducir la protección total (Brooks y Splitter, 1992; Zhan y col, 1995; Zhan y col., 1993). Por lo tanto, la investigación en este campo se ha dirigido principalmente a la búsqueda de inmunógenos que superen estos inconvenientes y eliminen además la limitante diagnóstica de la cepa usada actualmente para vacunación, Brucella abortus cepa 19, la cual no permite diferenciar entre animal vacunado e infectado. En los últimos años se desarrolló una mutante natural de Brucella abortus denominada RB51, la cual es carente de la Cadena-O del LPS, que ha eliminado los problemas diagnósticos mencionados (Schurig y col., 1991); además, ha demostrado, en varios modelos experimentales, la inducción de buenos niveles de protección (Villamil y col., 1993; Zhan y col., 1993; Gómez y col., 1995; Cheville y col., 1996; Mariño y col., 1996). En este trabajo se buscó evaluar comparativamente el tipo de respuesta inmune humoral y celular inducido por antígenos estructurales purificados y las vacunas vivas de B. abortus cepa 19 y cepa RB51; además, medir diferentes parámetros de la respuesta celular involucrados en protección y comparar el nivel de protección relativo entre los diferentes inmunógenos.

MATERIAL Y METODOS

Cepas bacterianas: Cultivos de Brucella abortus cepa rugosa RB51 donada gentilmente por el Dr. G. Schurig¹  y cepa patógena de referencia Brucella abortus 2308, fueron replicadas y mantenidas en agar tripticasa soya (TSA), en atmósfera humidificada y con 5% de CO₂. Los cultivos resuspendidos en solución salina estéril al 0.85% fueron llevados a las concentraciones de trabajo; 2x10¹⁰ UFC/ml usada como dosis vacunal para la cepa RB51 y 1x10⁷ UFC/ml de cepa patógena 2308 para el desafío respectivamente.

FRACCIONES BACTERIANAS PURIFICADAS

Proteínas de membrana externa grupo II (OMP-II): Purificadas a partir de la cepa B. abortus RB51, por extracción secuencial con los detergentes sarcosil; swittergent y desoxicolato de sodio (Gómez y cols., 1995). La OMP-II tanto en forma purificada como acoplada a Cadena-O se utilizó para la inmunización de dos grupos experimentales. Este mismo antígeno fue empleado en pruebas de estimulación in vitro.

Cadena-O: 4.6-dideoxi-4-formamido-D-manosa: extracto obtenido a partir de la cepa 19 de B. abortus por extracción fenólica y precipitación con metanol, proporcionado por el Dr. Cherwonogrodzky² , se utilizó en pruebas de estimulación in vitro e in vivo acoplado a OMP-II, como antígeno inmunizante.

Lipopolisacárido (sLPS): el extracto purificado a partir de la cepa 19 fue preparado por el método estándar por tratamiento con acetona, extracción fenólica y digestiones enzimáticas y fue empleado en pruebas in vitro.

Extracto proteico soluble de B. abortus (BASA): Obtenido de cultivo de B. abortus cepa RB51, por tratamiento con acetona y lisozima (Schurig y col., 1989, 1991).

Recuperación bacteriológica: Al momento del sacrificio se tomaron muestras representativas de: bazo, ganglios mesentéricos, hígado y útero de los cuales se intentó el aislamiento de Brucella. Los tejidos fueron macerados en RPMI 1640; suspensiones concentrada y en dilución 1:10, fueron sembradas por triplicado en placas de TSA e incubadas a 37°C por 72 horas en atmósfera humidificada y con 5% de CO₂. Las UFC con características de crecimiento de Brucella fueron registradas y confirmadas por coloración de Gram y colony blot, empleando el anticuerpo monoclonal BRU-38 específico a Cadena-O (Schurig y col., 1984.)

Animales experimentales: Se utilizaron catorce bovinos hembras raza criolla de 19 meses de edad, con un peso promedio aproximado de 400 kg, provenientes de un hato no vacunado y libre de brucelosis. Los animales fueron desparasitados, vacunados contra fiebre aftosa y confirmados serológicamente como negativos para: leucosis bovina, Brucella abortus, Leptospira y rinotraqueítis infecciosa bovina (R|B). Los animales se distribuyeron en cinco grupos experimentales de tres animales y fueron inoculados vía subcutánea: para el grupo vacunado con cepa 19 se empleó la vacuna comercial distribuida por VECOL³, en dosis de 2x1010 bacterias; Grupo RB51, con 2x10¹⁰ UFC; Grupo OMP-II, con 1.000 µg emulsionado en adyuvante completo de Freund; Grupo OMP-II acoplada a Cadena O, con 1.000 µg emulsionado en adyuvante completo de Freund y el grupo control inoculado con solución salina estéril. El desafío se realizó vía intramuscular con 1x10⁷ UFC de B. abortus 2308 a los 60 días posvacunación.

Pruebas serológicas: Se emplearon las pruebas diagnósticas de: Rosa de Bengala (RB), Fijación de complemento (FC), Inmunodifusión radial (IDR); ELISA indirecta para sLPS (IAEA) y para antígeno soluble de Brucella abortus RB51 (BASA). Las pruebas fueron realizadas los días 0, 8, 15, 30, 60 y posdescarga día 90. Se determinó la subclase de inmunoglobulina IgG2 a través de la prueba de ELISA tipo doble sandwich, estandarizada en el laboratorio: para la sensibilización de las placas⁴ se utilizaron los antígenos sLPS y BASA en buffer carbonatos pH 9.6, en concentración de 100 y 745 ng/pocillo respectivamente, cada antígeno fue adsorbido durante 18 horas a 4°C, los sueros controles (positivo, moderado y negativo) y los sueros a probar se adicionaron en dilución 1:200 (para la prueba con sLPS) y 1:50 (para la prueba con antígeno soluble RB51), en PBS Tween pH 7.4 y se permitió la reacción durante una hora a 37°C, en agitación constante. Luego se adicionó el anticuerpo monoclonal anti IgG2 bovina, MAC 626⁵, en dilución título de 1:5000, se incubó una hora a 37°C en agitación constante y después de tres lavados con PBST se adicionó, como tercer anticuerpo, Ig de cabra antirratón conjugada con HRPO en dilución título 1:25000. Después de incubación de una hora a 37°C en agitación constante, y de tres lavados, se reveló la reacción empleando el sistema substrato cromógeno ABTS-H₂O₂ y a los 15 minutos a 37°C en agitación, la reacción se frenó con SDS en solución al 4%. La lectura de la placa se hizo utilizando el lector de ELISA Multiskan^® PLUS⁶  a 405 nm. Los resultados fueron evaluados en función del porcentaje de positividad con respecto al control positivo previamente validado (FAO/IAEA, 1996).

Proliferación celular: Medida por capacidad blastogénica de células mononucleares obtenidas de sangre periférica heparinizada (1 UI/ml) a partir de gradiente de Ficoll-Paque^® PLUS⁷ (Hudson y Hay, 1991; Villamil y col., 1993). Las mediciones se realizaron los días 0, 8, 15, 30 y 60 pos-immunización. Los antígenos empleados para medir estimulación in vitro fueron: a) Concanavalina A⁸, activador policlonal utilizado como control positivo en una concentración de 1.5 µg/pocillo (titulación previa); b) OMP-II: en concentraciones de 1, 3 y 5 µg/pocillo; c) sLPS: en concentraciones de 1, 2 y 3 µg/pocillo; d) cadena-O: en concentraciones de 1, 2 y 3 µg/pocillo; e) proteínas solubles de RB51: en concentración de 10 µg/pocillo; f) como control negativo se sirvieron pocillos con RPMI 1640 simple. Todos los antígenos se inocularon en 100 µl de RPMI y se hicieron dos réplicas por antígeno.

Las células mononucleares fueron inoculadas en una concentración previamente determinada de 4x10⁶ células/ml, en volúmenes de 100 µl, en placas Falcon⁹ de 96 pocillos fondo plano, previamente adicionadas con los antígenos de estimulación in vitro, en las concentraciones anteriormente descritas. Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO₂ durante 72 horas. Al cabo de este tiempo se adicionó la H3-Timidina marcada ([methyl-3 H] Thymidine actividad específica 2.96 TBq/mmol, 80 Ci/mmol), en una relación de 1.0 µCi/10µl por pocillo y se continuó el cultivo bajo las mismas condiciones durante 17 horas adicionales. Al cabo de este tiempo las placas se almacenaron a -70°C hasta el momento de su evaluación. Las células se recolectaron mediante un equipo automatizado, PHD cell harvester¹⁰, sobre membranas de fibra de vidrio¹¹. Después de secar las membranas durante 18 horas, se adicionaron a cada vial 3.0 ml de mezcla de centelleo (Minivial Beckman¹²), para determinar las cuentas por minuto (c.p.m.) en el contador modelo LS 500 TA,¹³ de Beckman^®. Los resultados se expresaron como el promedio de c.p.m. de las celdas duplicado y los resultados finales evaluados como índice de estimulación (I. E.) dado por la relación entre la lectura del control y la muestra.

Medición de interferón  gbovino: Se colectaron los sobrenadantes (100 µg/pocillo) de las células estimuladas en cultivo con las concentraciones de los siguientes antígenos por pocillo: OMP-II 3.0 µg; LPS 1.0 µg; Cadena-O 1.0 µg, tanto a las 24 como a las 72 horas de cultivo. Estos sobrenadantes fueron congelados a -70°C hasta la determinación del INF-g bovino, la cual se realizó empleando el Kit IDDEX^®, ELISA¹⁴ . Los resultados fueron expresados como el índice de estimulación (I.E.) por antígeno, empleando la siguiente fórmula: el cociente del promedio de la densidad óptica de los cultivos estimulados con los antígenos, dividido por el promedio de la densidad óptica de los respectivos controles no estimulados. Se consideró como estímulo antigénico significativo el correspondiente a un I.E igual o mayor que la media, más dos desviaciones estándar de los I.E encontrados para los animales control libres de brucelosis.

Determinación de subpoblaciones linfoides: Se determinó el porcentaje de células CD4+ y CD8+ en sangre periférica, mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonal (Mab) CACT 138 A¹⁵ (Harlam-Serotec) anti-CD4+; el Mab CACT 8020 con especificidad CD8-a y el Mab BAT 82²⁰ con especificidad CD8-?. Como segundo anticuerpo se utilizó anticuerpo policlonal de caballo anti-IgG (H y L)16 de ratón, marcado con fluoresceína. Las concentraciones utilizadas se eligieron según previa titulación.
Por cada animal se prepararon cuatro réplicas de células mononucleares, con una concentración de 1x10⁷ células/500 µl resuspendidas en medio RPMI 2X, en volúmenes de 70 µl/tubo de reacción así: a) Control de isotipo: células únicamente con segundo anticuerpo; b) CD4: células con monoclonal anti-CD4; dilución 1:500; c) CD8: células con monoclonal anti-CD8 a en dilución 1:1000; d) CD8: células con monoclonal anti-CD8 b en dilución 1:800. Por cada grupo/día se incluyó un quinto tubo control de células, con PBS y azida de sodio al 0.1%. La suspensión celular con el respectivo reactivo se incubó durante 45 minutos en agitación constante a temperatura ambiente y se lavó tres veces en PBS y azida de sodio al 0.1% a 590 xg durante cinco minutos. El botón celular final se resuspendió en 299 µl de PBS y azida de sodio al 1% y se adicionó 1.0 µl de conjugado antirratón-FITC, para obtener una dilución final de 1:300. El conjugado se incubó durante 45 minutos en oscuridad bajo las mismas condiciones anteriores. Luego de tres lavados con PBS y azida de sodio al 0.1%, el paquete celular final se resuspendió en 150 µl de solución fijadora de paraformaldehído al 1% en PBS y azida de sodio al 0.1%. La preparación se almacenó a 4°C en oscuridad, hasta su lectura en el citómetro de flujo FACSort modelo B 0392¹⁷, para la captura y el análisis de datos se utilizó el programa Cell QUEST^®18. Los resultados son expresados como porcentaje de eventos positivos (a razón de una fotoseñal por evento) y se analizaron por gráficas de puntos, substrayendo el ruido de fondo obtenido con el segundo anticuerpo.

RESULTADOS Y DISCUSION

El indicativo más directo de protección inducida por vacunas es la resistencia a descarga patógena (Adams, 1990). En los animales de los grupos vacunados con B. abortus cepa RB51 y cepa 19 no se aisló B. abortus 2308 de ningún órgano, confirmando la protección inducida por estas vacunas, mientras en los grupos vacunados con OMP-II y OMP-II-Cadena-O se hicieron aislamientos en uno de tres animales por grupo (tabla 1), mientras en todos los animales del grupo control se hicieron aislamientos positivos, con mayor número de UFC detectadas en el bazo.

Se hace evidente (tabla 1) la ventaja en diferenciación diagnóstica, observada en los grupos vacunados con cepa RB51 o sus antígenos purificados, en los cuales no se detectan anticuerpos a sLPS sino posteriormente a la descarga con cepa patógena. En contraste, se observa un alto índice de estos anticuerpos en el grupo cepa 19, a partir del día 8 posvacunación como fue originalmente reportado por Schurig y col. (1991), Cheville y col. (1996).

Al evaluar la respuesta de anticuerpos por subclase de inmunoglobulina G producida contra el sLPS (figuras 1 A y B) se observa a partir del día 15 en el grupo cepa 19 un mayor nivel de anticuerpos IgG1, mientras los correspondientes niveles de IgG2 son bajos. Es conocido que la alta producción de IgG1 se debe a estimulación policlonal de linfocitos B, sin participación de células T, ocasionada por el alto contenido de lipopolisacárido de la cepa 19 (Paul, 1992). Por otra parte, los mencionados isotipos ante extracto soluble de RB51 (esencialmente proteico sin cadena-O) (figuras 2 A y B) se manifiestan con valores considerados positivos en todos los grupos, sugiriendo la capacidad inmunógena de estas proteínas (Stevens M. y col. 1994; Cloeckaer y col., 1990; Lin J. y Ficht, 1995). Es importante resaltar los niveles significativamente bajos de anticuerpos IgG2 en el grupo cepa 19 en los días 60 y 90. En contraste, los grupos RB51 y OMP-II reconocen marcadamente el antígeno proteico por los dos isotipos, confirmando la identidad antigénica de las proteínas de membrana externa, tanto de la cepa RB51 como de los inmunógenos purificados, también presentes en la cepa de descarga empleada, manifestado por la elevada reacción o reconocimiento observada al día 90.

Lo anterior puede sugerir que las proteínas estructurales de RB51, presentes como antígenos purificados, inducen en el animal una respuesta favorable a la producción del isotipo IgG2, insinuando respuesta tipo Th1, lo cual se comprueba al observar la óptima memoria ante exposición a cepa patógena en estos grupos, mientras, como se anotó anteriormente, los animales estimulados con cepa 19 manifiestan muy baja respuesta anamnésica medida por IgG2, esperada de una estimulación policlonal poco relacionada con protección. En menor grado, el mismo efecto se observa en los animales del grupo OMP-II-cadena-O implicando a la cadena-O como responsable de un diferente tipo de presentación antigénica (Carrof y col., 1984; Aragón y col., 1996). Los mayores títulos de anticuerpos para el antígeno OMP-II permiten suponer la participación activa de este antígeno en la inducción de protección, a diferencia de la estimulada por la porción polisacárida de la bacteria (Winter y cols., 1983; Tabatabai y cols., 1984).

  Comportamiento serológico por pruebas convencionales en grupos de terneras vacunadas con 2x10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa RB51; 2 x 10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa 19, 1.000 µg de antígeno OMP-II; 1.000 µg de antígeno OMP-II acoplado a cadena-O y grupo control. Los animales fueron desafiados vía intramuscular al día 60, con B. abortus cepa 2308. Niveles de protección al día 30 posdesafío (día 90) medidos por u.f.c., de B. abortus cepa descarga 2308, aisladas de los diferentes órganos al día de sacrificio.

Serological evaluation by conventional tests in groups of heifers vaccinated with 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain RB51, 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain 19, 1000 µg of OMP-II antigen, 1000 µg of OMP-II-coupled to O-chain antigen and control group. The animals were challenged at day 60 with 1x107 c.f.u. of B. abortus strain 2308. Protection evaluated 30 days post challenge by c.f.u., of B. abortus pathogenic reference strain 2308, isolated from different organs.

Desde el punto de vista de evaluación de respuesta celular, la respuesta blastogénica frente a antígenos polisacáridos Cadena-O y sLPS es muy baja (figuras 3 A y B), lo que podría interpretarse como que sólo un pequeño porcentaje de la población linfoide presenta especificidad por este tipo de antígenos (Hoffman y col., 1990; Pugh y col., 1991). Ante estímulo por OMP se observa una tendencia de respuesta aumentada, especialmente con los animales vacunados con cepa RB51 y cepa 19 a pesar de la relativamente alta estimulación basal (figura 3 C). Frente al antígeno soluble crudo de Brucella abortus, los índices de estimulación se hicieron muy superiores, especialmente en los grupos RB51 y Cepa 19, los cuales presentan los mayores valores el día 60, lo cual sugiere que este antígeno sería el apropiado para evaluar linfoproliferación (figura 3 D). Debido a los bajos índices de estimulación obtenidos en general, sugerimos que la blastogénesis no es un método óptimo para evaluar activación celular en bovinos. Zhan y col. (1995) demostraron que los antígenos purificados de Brucella inducen una baja producción de receptores para IL-2, lo que explicaría la baja respuesta proliferativa hallada y plantean la necesidad de utilizar inmunoensayos donde se determine la producción específica de las citoquinas involucradas, IL-2 y/o IL-4.

Bajo condiciones de este experimento, se dedujo que la evaluación de producción de IFN-g bovino es más significativa a las 72 que a las 24 horas. Como se observa en la figura 4, no se detectó presencia de INF-g frente a ningún antígeno, en ningún grupo experimental durante los primeros 15 días. Sin embargo al día 60 los animales vacunados con la cepa 19 manifestaron altos niveles de IFN-g frente a los tres antígenos. El elevado valor de IFN-g en presencia de Cadena-O (figura 4B) es difícil de explicar y podría sugerir un estímulo hapteno específico de esta última en activación de células T, o que la Cadena-O altera la forma de presentación, induciendo una activación inespecífica a través de los receptores para sLPS y/o manosa presentes en los macrófagos (Splitter y col., 1989; Smith y col., 1990).

Figura 1. Respuesta de anticuerpos séricos frente al antígeno sLPS de B. abortus, en grupos de terneras vacunadas con 2x10¹⁰ u.f. c. de B. abortus cepa RB51, 2x10¹⁰ u.f. c. de B. abortus cepa 19, 1.000 µg de antígeno OMP-II, 1.000 µg de antígeno OMP-II-acoplado a cadena-O y grupo control, los animales fueron descargados al día 60 con B. abortus cepa 2308 (1x10⁷ u.f.c.) y sacrificados 30 días después, día 90 posvacunación. Niveles de anticuerpos medidos por las pruebas de A: ELISA indirecta isotipo IgG1 y B: ELISA doble sandwich isotipo IgG2.
Humoral immune response to B. abortus sLPS, in groups of heifers vaccinated with 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain RB51, 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain 19, 1000 µg of OMP-II antigen, 1000 µg of OMP-II-coupled to O-chain antigen and control group, the animals were challenged at day 60 with 1x10⁷ c.f.u. of B. abortus strain 2308 and sacrifized 30 days after, day 90 post vaccination. Antibody levels measured by A: indirect ELISA IgG1 isotype and B: doble sandwich ELISA IgG2 isotype.

Figura 3. Respuesta blastogénica de células monocíticas periféricas en grupos de terneras vacunadas con 2x10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa RB51, 2x10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa 19, 1.000 µg de antígeno OMP-II, 1.000 µg de antígeno OMP-II-acoplado a cadena-O y grupo control. Respuesta evaluada en índice de estimulación (SI) ante estímulo in vitro por A: 1 µg/100 µl de B. abortus sLPS. B: 1 µg/100 µl de Cadena-O. C: 3 µm/100 µl de OMP-II de B. abortus RB51. D: 10 µg/100 µl de extracto soluble crudo de B. abortus RB51, obtenido por diferencia en incorporación de 1 µCi/10 µl de Timidina [3H] con respecto al control.
Blastogenic response in PBM of groups of heifers vaccinated with 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain RB51, 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain 19, 1000 µg of OMP-II antigen, 1000 µg of OMP-II-coupled to O-chain antigen and control group. The response was evaluated by stimulation indexes after in vitro inoculation and exposure for 72 hours to: A: 1 µg/100 µl of B. abortus sLPS. B: 1 µg/100 µl of Cadena-O. C: 3 µg/100 µl de OMP-II of B. abortus RB51. D: 10 µg/100 µl soluble B. abortus RB51 antigen, and subsequent 18 hour pulse with [₃H] thymidine, 1 µCi/10 µl.

Figura 4. Seguimiento posvacunal de niveles de interferón gamma bovino, IFN-g, producido en células mononucleares periféricas de grupos de terneras vacunadas con 2x10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa RB51, 2x10¹⁰ u.f.c. de B. abortus cepa 19, 1.000 µg de antígeno OMP-II, 1000 µg de antígeno OMP-II-acoplado a cadena-O y grupo control. La respuesta fue medida por ELISA luego de estimulación in vitro durante 72 horas con: A: 3 µg/100 µl de OMP-II de B. abortus RB51. B: 1µg/100 µl de B. abortus Cadena-O. C: 1 µg/100 µl de sLPS de B. abortus y evaluada en índice de estimulación con respecto a controles.
Levels of bovine gamma interferon IFN-? in groups of heifers vaccinated with 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain RB51, 2x10¹⁰ c.f.u. of B. abortus strain 19, 1000 µg of OMP-II antigen, 1000 µg of OMP-II-coupled to O-chain antigen and control group. The response was evaluated after in vitro stimulation and exposure for 72 hours to: A: 3 µg/100 µl of B. abortus RB51 OMP-II. B: 1 µg/100 µl of B. abortus O-chain. C: 1 µg/100 µl of B. abortus sLPS. The IFN-? produced in supernatant was measured and results calculated by stimulation indexes (S.I.) against controls using the IDDEX^® ELISA kit.

El grupo vacunado con la cepa RB51 manifestó un nivel considerado positivo de INF-g sólo ante el antígeno OMP-II, apoyando la participación de este componente de la membrana externa en la activación específica de los linfocitos T e inducción de protección (tabla 1). Es de resaltar que en la medición al día 60 los valores positivos fueron obtenidos tan sólo en los grupos C19 y RB51, coincidiendo con lo observado en linfoproliferación con el antígeno proteico soluble crudo de RB51 (figura 3 D). Dadas las características de una infección intracelular, la determinación de niveles de INF-g podría considerarse un reflejo del estado de protección a la infección, siempre y cuando la producción de éste sea antígeno específico (Ferrick y col., 1995; Weynants y col., 1995; Oliveira y Splitter, 1996).

La evaluación de subpoblaciones linfoides, CD4 y CD8, permite considerar que los valores obtenidos, según características experimentales de homogeneidad en estado clínico y fisiológicas de los animales experimentales, coinciden con los valores reportados para la especie (Baldwin y col., 1986; Howard y col., 1991). Se evidencia la estimulación temprana de las dos subpoblaciones primando en porcentaje la población CD4+, con un pico de aumento para las dos subpoblaciones el día 15 de evaluación, que desciende progresivamente hasta el día 60 (figura 5). Esto sugiere que los antígenos empleados en este experimento estimulan simultáneamente las dos subpoblaciones y el proceso infeccioso inducido por las cepas vacunales vivas no causa modificación del patrón de expresión en poblaciones linfoides en circulación periférica.

Conociendo que la B. abortus 2308 cepa patógena, inhibe la fusión fagolisosoma y se localiza en retículo endoplásmico de células no fagocíticas infectadas, es posible que los antígenos experimenten presentación a través de moléculas de CMH clase I, lo cual implica la participación de los linfocitos T CD8+ en protección a brucelosis. Considerando como indicativo de respuesta Th1 los elevados valores de producción de INF-g, los niveles de IgG2 y la evaluación de las subpoblaciones en periferia, podemos decir que la protección observada en los animales vacunados con B. abortus RB51 ante descarga patógena es el resultado de la estimulación de los linfocitos T CD4+ subclon Th1 y de los linfocitos T CD8+, ante la presentación de péptidos de proteínas de membrana externa, con la participación activa de anticuerpos dirigidos contra estas mismas proteínas.

Además es importante resaltar que para protección a infección por microorganismos intracelulares se requiere la combinación de diferentes elementos del sistema inmune tales como las células NK y las células T gd, las cuales constituyen en los rumiantes un elevado porcentaje en la periferia (Hein y col., 1991; Havran y Boismenu, 1994).

Deben abordarse estudios que contemplen la evaluación de las citoquinas relacionadas con respuesta Th2 como la participación de células gd para definir el papel de éstas en la protección observada.

CONCLUSIONES

1. Los resultados de este trabajo confirman que la cepa de B. abortus RB51 induce protección a la descarga patógena en igual nivel que la vacuna convencional cepa 19, con la ventaja de no inducir producción de anticuerpos contra el lipopolisacárido, permitiendo una clara diferenciación entre animales vacunados y animales infectados.

2. Los anticuerpos contra proteínas de membrana externa contribuyen de forma significativa a la protección otorgada, observada por el "switching" de clase producido con un elevado nivel de IgG2 frente a proteínas, lo cual puede estar asociado con la maduración de la respuesta inmune, mientras que frente al sLPS se producen anticuerpos subclase IgG1.

3. Desde el punto de vista de evaluación de respuesta celular, se sugiere que la prueba de linfoproliferación es representativa de la situación in vivo al emplear el antígeno soluble crudo de B. abortus, ya que se observó correlación entre esta evaluación y la protección en los grupos inmunizados con vacunas vivas de B. abortus cepa RB51 y cepa 19.

4. De acuerdo a las condiciones experimentales y dadas las características de infección intracelular de la brucelosis, la determinación de producción de interferón-g antígeno-específico reflejaría directamente el estado de protección a la infección.

5. La evaluación cuantitativa de las subpoblaciones linfoides sugiere que los antígenos empleados estimulan simultáneamente las dos subpoblaciones, CD4/CD8, y el proceso infeccioso inducido por las cepas vacunales vivas no modifica el patrón de expresión de subpoblaciones linfoides en circulación periférica.

6. Se plantea que la protección observada en los animales vacunados con B. abortus RB51 ante descarga patógena es el resultado de la estimulación de linfocitos T CD4+ Th1 y linfocitos T CD8+ ante la presentación de péptidos de proteínas de membrana externa.

RESUMEN

Con el objeto de evaluar comparativamente el tipo de respuesta inmune inducido por los antígenos estructurales purificados y vacunas vivas de Brucella abortus, 14 bovinos criollos hembras de 19 meses de edad fueron distribuidos al azar, en cinco grupos experimentales e inmunizados vía subcutánea de la siguiente manera: OMP-II (proteínas de membrana externa), OMP-II-Cadena-O, OMP II acoplado a polisacárido-O, B. abortus cepa RB51, B. abortus cepa 19 (C19) y solución salina para el grupo control. Dos meses posinmunización, los animales fueron desafiados, vía intramuscular, con cepa patógena de referencia B. abortus 2308 y evaluados en su nivel de protección 30 días posdesafío. La respuesta inmune humoral específica fue determinada mediante las pruebas convencionales, de aglutinación Rosa de Bengala, fijación de complemento, inmunodifusión radial, ELISA indirecta, a los 8, 15, 30, 60 y 90 días posinmunización. Adicionalmente se determinó la subclase de IgG por ELISA tipo doble sandwich. La evaluación de respuesta celular fue determinada mediante linfoproliferación, expresada en índices de estimulación (IS), obtenidos por los niveles de incorporación de 3H timidina, medición de Interferón gamma (IFN-g), igualmente expresado como IS y cuantificación de subpoblaciones linfoides CD4+ y CD8+ por citofluorometría. Animales vacunados con cepas vivas demostraron protección total al reto, mientras se observó un 66% de protección en los vacunados con antígenos purificados. Se observó ausencia de anticuerpos a lipopolisacárido, sLPS, por las pruebas convencionales para B. abortus en todos los grupos inmunizados, excepto el vacunado con cepa 19, confirmando la ventaja diagnóstica de la utilización de la cepa RB51 o sus antígenos purificados. La linfoproliferación como una de las medidas de respuesta celular no demostró IS significativos (p>0.05) frente a los antígenos estructurales purificados, OMP-II, Cadena-O y sLPS en ninguno de los grupos experimentales. IS superiores se encontraron al emplear antígeno soluble crudo de B. abortus RB51, los cuales evidenciaron diferencias significativas (p<0.05) a favor de los grupos vacunados con los antígenos replicantes. Con respecto a los grupos experimentales se confirmaron niveles de producción de IFN-g más altos en los grupos vacunados con cepas vivas, especialmente en el grupo cepa 19. Al analizar la relación CD4/CD8, ésta se mantuvo estable durante todo el tiempo de observación y no se detectó predominio ni disminución de ninguna subpoblación linfoide. Los resultados anteriores, unidos al nivel de protección a descarga encontrado favorable a las cepas vivas, permiten, a su vez, concluir que la cepa B. abortus RB51 induce igual nivel de protección al de la cepa de vacuna tradicional C19, superando la limitante en diagnóstico diferencial. Los antígenos purificados de membrana externa, OMP-II y OMP-II-Cadena O, aunque presentan un nivel inferior de protección, en los parámetros inmunológicos medidos en este estudio, en general, se comportan en forma semejante a las cepas vivas, indicando que son antigénicos e inducen una memoria de corta duración probablemente necesitando administración de dosis repetidas para alcanzar niveles eficientes de protección. Se plantea que la protección observada en los animales vacunados con B. abortus RB51 ante desafío patógeno es el resultado de la estimulación de linfocitos T CD4+ Th1 y linfocitos T CD8+ ante la presentación de péptidos de proteínas de membrana externa.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo pudo ser realizado gracias al apoyo de la Comunidad Económica Europea, contrato CI1-CT93-0324, al soporte de la Universidad de las Naciones Unidas (UNU) programa UNU-BIOLAC y la red Latinoamericana de Brucelosis. Se agradece especialmente la colaboración desinteresada de la Compañía Colombiana de Productos Veterinarios VECOL.

La colaboración temporal de las doctoras Adriana Quevedo y Sandra Rozo es ampliamente apreciada.
______________________
Aceptado: 01.09.98.

¹ Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia - Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University Blacksburg, Virginia 24061-0342, USA.

² Department of National Defense, Defense Research Establishment, Suffield, Box 4000, Medicine Hat, Alberta, Canada T 1 A 8K6.

³ Empresa Colombiana de Productos Veterinarios.

⁴ Polisorb. Nunc Intermed. Postbox 280-DK 4000 Roskilde. Denmark.

⁵ MCA 626 Serotec, IgG de ratón anti IgG2 bovina.

⁶ Multiskan® PLUS MK II, Titertek

7 Ficoll-Paque® PLUS Endotoxin Tested Sterile Solution. Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden.

⁸ PHARMACIA AB, Laboratory Separation Division, Uppsala, Sweden.

⁹ Falcon , 2098 Bluemax, Becton Dickinson and Company, New Jersey 07035.

¹⁰ Cambridge Technology Inc., 2464 Massachusetts Avenue, Cambridge, Massachusetts 02140

¹¹ Cambridge Technology, Inc. 2464 Massachusetts Avenue, Cambridge, Massachusetts 02140.

¹² Beckman Ready Micro TM Liquid Scintillation Cocktail, Fullerton, California, 92634-3100.

¹³ Beckman Instruments. Nuclear System Operations. 2500 Harbor Blvd, Fullerton, California, 92634-3100.

¹⁴ IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook Marine 04092, USA.

¹⁵ VMRD, Inc. P.O. Box 502. Pulman, WA.99163 Monoclonal Antibody.

¹⁶ Vector Laboratories, Inc. 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, USA.

¹⁷ Beckton Dickinson Instruments, San Jose, USA.

¹⁸ Beckton Dickinson Instruments, San Jose, USA.

BIBLIOGRAFIA

ABBAS A., A. LICHTMAN., J. POBER. 1992. Cellular and Molecular Immunology 2nd ed. New York: Saunders Company: 323-327.

ADAMS, L.G. 1990. Development of live Brucella vaccines. En: Advances in Brucellosis. Ed. Texas A & M. University Press, p. 250-276.

ARAGON, V., R. DIAZ., E. MORENO., I. MORIYON. 1996. Characterization of Brucella abortus and Brucella mellitensis native haptens as outer membrane O-type polysaccharides independent from the smooth lipopolysaccharide, J. Bacteriol. 178: 1070-1079.

BALDWIN, C., A.J. TEATLE., J.G. NAESSENS, B.M. GOODEERIS, N.D. MacHUGH, W.I. MORRISON. 1986. Characterization of a subset of bovine T lymphocytes that express BoT4 by monoclonal antibodies and function: similarity to lymphocytes defined by human T4 and murine L3T4, J. Immun. 136: 4385-4391.

BROOKS, B. M., G.A. SPLITTER. 1992. Antigens of Brucella abortus S19 immunodominant for bovine lymphocytes as identified by one and two dimensional cellular immunoblotting, Infect. Immun. 60: 2459-2464.

CARROF M., D.R. BUNDLE., M.B. PERRY., J.M. CHERWONOGRODZKY., J.R. DUNCAN. 1984. Antigenic S-type Lipopolysaccharide of Brucella abortus 119-3, Infect. Immun. 46: 384-389.

CHEVILLE, N. F., S.C. OLSEN., A.E. JENSEN, M.G. STEVENS, M.V. PALMER. 1996. Effects of age at vaccination on efficacy of Brucella abortus strain RB51 to protect cattle against brucellosis, Am. J. Vet. Res. 57: 1153-1156.

CLOECKAERT, A., P. WENGIFOSSE., G. DUBRAY G., N. LIMET. 1990. Identification of seven surface-exposed Brucella outer membrane proteins by use of monoclonal antibodies: Immunogold labeling for electron microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay, Infect. Immun. 58: 3980-3987.

FERRICK D., M. SCHRENZEL, T. MULVANIA, B. HSIEH, W. FERLIN. 1995. Differential production of interferon-? and interleukin-4 in response to Th1 and Th2 stimulating pathogens by ?? T cells in vivo, Nature 255-257.

FAO/IAEA. 1996. Indirect enzyme immunoassay for detection of bovine antibody to Brucella abortus. Brucellosis ELISA kit. Bench Protocol. Version BRA 1.3.

GOMEZ, P.H., E. RUEDA, M.I. GALLEGO, M.L. VILLAMIL, O.C. MARIÑO. 1995. Mecanismos de protección inducidos por proteínas de membrana externa de Brucella abortus cepa RB51, Arch. Med. Vet. (extraordinario): 65-75.

HARVRAN, W.L., R. BOISMENU. 1994. Activation and function of gd T cells., Curr. Topics in Immun. 6: 442-446.

HEIN, W.R., C.R. MACKAY. 1991. Prominence of ?? T-cells in the ruminant immune system, Immunol. Today. 12: 30-34.

HOFFMANN, E.M., S.J. SHAPIRO, P. NICOLETTI. 1990. Evaluation of serologic and cellular immune responses of cattle to a nonlipopolysaccharide antigen from Brucella abortus, Am. J. Vet. Res. 51: 216-221.

HOWARD, C.J., W.I. MORRISON, A. BENSAID, W. DAVIS, L. ESKRA, J. GERDES, M. HADAM, D. HURLEY, W. LEIBOLD, J.J. LETESSON, N. MacHUGH, J. NESSENS, K. O'REILLY, K.R. PARSON, D. SCHOLTE, P. SOPP, G. SPLITTER, R. WILSON. 1991. Summary of worshop findings for leukocyte antigens of cattle, Vet. Immunol. Immunopathol. 27: 21-27.

HUDSON, L., F. HAY. 1991. Practical Immunology. 3rd. ed., Blackwell Scientific Publications. London.

LIN J., T. FICHT. 1995. Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection, Infect. Immun. 63: 1409-1414.

MARIÑO, O.C., M.I. Gallego, O.E. RUEDA, L. SEDANO, G.G. SCHURIG. 1996. Evaluation of potential vaccine Brucella abortus RB51, susceptibility and protection in guinea pigs. UNU Press. En prensa.
MARK G. S., S. OLSEN, N. CHEVILLE. 1994. Lymphocyte proliferation in response to immunodominant antigens of Brucella abortus 2308 and RB51 in strain 2308-Infected Cattle, Infect. Immun. 62: 4646-4649.

OLIVEIRA, S. C., G. SPLITTER. 1996. Recombinant Brucella abortus proteins that induce proliferation and gamma-interferon secretion by CD4+ T cells from Brucella-vaccinated mice and delayed-type hypersensitivity in sensitized guinea pigs, Cel. Immun. 172: 262-268.

PAUL, W., 1993. Fundamental Immunology. 3rd ed. New York: Raven Press, 769.

PUGH, J., W. GEORGE, L.B. TABATABAI. 1994. Alteration of protective and serologic responses in BALB/c mice vaccinated with chemically modified versus nonmodified proteins of Brucella abortus 19, Amer. Vet. J. 62: 5327-5334.

SCHURIG, G.G.C. HAMMERBERG, B.R. FINKER.  1984. Monoclonal antibodies to Brucella surface antigens associated with the smooth lipopolysaccharide. Amer. J. Vet. Res. 45: 967-971.

SCHURIG, G., S.S. PRINGLE, A.T, BREESE. 1989. Localization of Brucella antigens that elicit a humoral response in Brucella abortus infected cattle, Infect. Immun. 34: 1000-1007.

SCHURIG, G.G., R.M. ROOP II., T. BAGCHI, D. BUHRMAN, N. SRIRANGANATHAN. 1991. Biological properties of RB51, a stable rough strain of Brucella abortus, Vet. Mycrobiol. 28: 171-188.

SMITH, R. 1990. Bovine T-lymphocyte lines reactive with Brucella abortus, Am. J. Vet. Res. 51: 512-517.

SPLITTER, G.A., K.M. EVERLITH. 1989. Brucella abortus regulates bovine macrophages T-cell interactions by major histocompatibility complex class II and IL-1 expression, Infect. Immun. 57: 1151-1157.

STEVENS, M.G., S.C. OLSEN, N.F. CHEVILLE. 1994. Lymphocyte proliferation response to immunodominant antigens of Brucella abortus 2308 and RB51 in strain 2308 infected cattle, Infect. Immun. 62: 4646-4649.

TABATABAI, L.B., B. BEYONE. 1984. Biochemical and biological properties of soluble protein preparations from Brucella abortus, Dev. Biol. Stand. 56: 199- 211.

VILLAMIL, M., E. RUEDA., M.I. GALLEGO, O.C. MARIÑO. 1995. Respuesta inmune humoral y celular en cobayos inmunizados con proteínas de membrana externa de Brucella abortus Cepa RB51, Arch. Med. Vet. 27 (Extra): 77-84.

WEYNANTS, V., J. GODFROID, B. LIMBOURG, C. SAEGERMAN, J. LETESSON. 1995. Specific bovine brucellosis diagnosis based on in vitro antigen-specific gamma interferon production, J. Clin. Microbiol. 33: 706-712.

WINTER, A.J., D.R. VERSTREATE, C.E. HALL. 1983. Immune response to porin in cattle immunized with whole cell, outer membrane, and outer membrane protein antigens of Brucella abortus combined with trealose dimycolate and muramyl dipeptide adjuvants, Infect. Immun. 42: 1159 - 1167.

ZHAN, Y., A. KELSO, C. CHEERS. 1993. Cytokine production in the murine response to Brucella infection or immunization with antigenic extracts, Immunology 80: 458-464.

ZHAN, Y., A. KELSO, C. CHEERS. 1995. Differential activation of Brucella-Reactive CD4+ T cells by Brucella infection or immunization with antigenic extracts, Infect. Immun. 63: 969-975.