V. MERINO¹, B.Q., M.S.; A. ISLAS¹, M.V., M.S.; J. LOPEZ-RIVERO², M.V., Dr. med. vet.; G. MORA¹, M.V., MS; M. QUEZADA¹, M.V., Dr. med. vet., J. LOPEZ¹, M.V.; J. REYES¹, M.V.

To evaluate anaerobic and aerobic metabolism of the Gluteus medius muscle, biopsies of 16 clinically healthy draught horses of both sexes, were obtained at 3, 6 and 9 cm of depth. Creatinekinase (CK), lactic dehydrogenase (LDH) and citrate synthase (CS) activities in inactive and in working animals doing agricultural work was determined.

The muscle tissue was homogenised, sonicated and centrifuged. Then the enzymatic activities were determined in the supernatant.

The results obtained indicated that CK specific activity did not change according to depth of sampling, LDH specific activity was lower at a depth of 9 cm in inactive equines and CS specific activity increased. All enzymatic activities increased significantly in working horses compared to inactive individuals.

The draught horses doing agricultural work increased their muscular metabolism, principally their aerobic muscular metabolism, avoiding the glycogen storage and muscle fatigue.

Palabras claves: equinos, enzimas, músculo.

Key words: horses, enzymes, muscle.

INTRODUCCION

El músculo esquelético de los mamíferos está constituido por fibras con diferentes propiedades contráctiles y metabólicas que le permiten transformar la energía química en energía mecánica para utilizarla en la contracción, originando el movimiento muscular.

En el músculo esquelético del equino ocurren adaptaciones en respuesta a distintos programas de entrenamiento y a períodos de desentrenamiento (Essén-Gustavsson y col., 1989; Foreman y col., 1990); además, se ha comprobado que los músculos de equinos adultos de distintas razas se modifican en forma diferente frente a un mismo tipo de entrenamiento, produciéndose variaciones en la composición miofibrilar y bioquímica de ellos (Rivero y col., 1995; Serrano y col., 1996).

La determinación de la actividad de enzimas que regulan las vías metabólicas aeróbicas y anaeróbicas se ha utilizado para evaluar la capacidad metabólica y la adaptabilidad del músculo esquelético al ejercicio (Cutmore y col., 1985; Kline y Bechtel, 1988). Las actividades enzimáticas utilizadas como marcadores del metabolismo aeróbico son la citrato sintetasa y la 3-hidroxi-acil-CoA-deshidrogenasa y del metabolismo anaeróbico, la deshidrogenasa láctica y la creatinquinasa, preferentemente (Essén-Gustavsson y col., 1984). Estas actividades enzimáticas se correlacionan con el porcentaje y tamaño de las fibras musculares y son dependientes de la raza de los equinos (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Valberg y col., 1985; Serrano y col., 1996).

Se ha demostrado que durante una actividad física prolongada el metabolismo oxidativo juega un rol importante en la utilización de carbohidratos y lípidos, disminuyendo la utilización de glicógeno de los músculos para evitar su fatiga (Essén-Gustavsson y col., 1984; Hodgson y Rose, 1987; Hodgson y col., 1985, 1986).
El objetivo de este trabajo fue estudiar las características metabólicas del músculo Gluteus medius de equinos mestizos de tiro inactivos y después de tres meses de estar realizando trabajos agrícolas, determinando las actividades de citrato sintetasa, deshidrogenasa láctica y creatinquinasa a tres profundidades distintas del músculo.

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron 16 equinos mestizos (criollos chilenos cruzados con equinos de raza pesada) con aptitud de tiro (8 hembras y 8 machos castrados), clínicamente sanos, de 5 a 15 años de edad. Los animales, denominados inactivos, no habían realizado trabajos de tiro por un período mínimo de 3 meses previo a la toma de las biopsias; aquellos denominados en trabajo corresponde a los mismos animales, pero las muestras se tomaron al término de tres meses de haber realizado faenas de aradura en viñas de secano en jornadas de 4 horas, 2 veces al día durante 5 días consecutivos a la semana. La aptitud de tiro se determinó por la fórmula de Crevat y Baros (Leigh, 1985).

Se realizaron tres biopsias musculares en el mismo sitio, a profundidades de 3, 6 y 9 cm. Las muestras fueron tomadas por la misma persona con una aguja percutánea de 6 mm de diámetro interno (Henckel, 1983) estandarizando la localización y profundidad de las biopsias. El sitio exacto se precisó dorsocaudalmente a la tuberosidad coxal, en un ángulo de 45°, a una distancia de 15 cm. La profundidad de las biopsias se garantizó por medio de topes metálicos que permiteron introducir la aguja de biopsia a la profundidad deseada (Mora y col., 1995).

Para obtener las biopsias se depiló y desinfectó una superficie de 2 cm y se infiltró el subcutáneo con 2 a 3 ml de anestésico local (Lidocaína MR de Laboratorio Chile). Luego, se hizo una incisión en la piel con un bisturí (hoja Nº 9) y se introdujo el trocar para obtener el tejido. Las muestras musculares obtenidas se congelaron hasta su análisis en nitrógeno líquido (-196 °C) en un envase rotulado.

Preparación de las muestras musculares: Los trozos de músculo se descongelaron, se limpiaron de tejido conectivo y grasa en ambiente frío (4°C). Luego, 50 mg de tejido se colocaron en tampón fosfato salino (PBS) a pH 7.3 y se centrifugaron a 1.000 g por 10 minutos a 4°C en una centrífuga refrigerada Sorvall R-C-5B. Este procedimiento se realizó tres veces para eliminar la sangre. El sedimento obtenido se solubilizó en 5 ml de PBS (pH 7.3), se homogeneizó en un triturador Ultra-turrax T-25 a 8.000 rpm por 1 minuto, se sonicó en un sonicador Trassonic C-460 por 30 segundos y luego se centrifugó a 7.000 g durante una hora a 4°C. En el sobrenadante obtenido se determinaron las actividades de las enzimas deshidrogenasa láctica (LDH) (EC 1.1.1.28.), creatinquinasa (CK) (EC 2.7.3.2.) y citrato sintetasa (CS) (EC 4.1.3.7.).

Las actividades de las enzimas LDH y CK se determinaron midiendo la variación de absorbancia a 365 nm de NADH y NADPH por minuto, respectivamente, utilizando reactivos comerciales (Laboratorio Boehringer, Mannheim, kits Nº 1087592 y Nº 1087533). La actividad CS se detectó según el método descrito por Alp y col. (1976).

La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y col. (1951) usando seroalbúmina de bovino como estándar.

Todas las determinaciones espectrofotométricas se realizaron en un equipo Shimadzu UV-120-02, a 25°C.

Análisis estadístico: se obtuvo la media y la desviación estándar de cada variable. Las diferencias observadas entre las tres profundidades de muestreo y entre los animales "inactivos" y "en trabajo" fueron analizadas por la prueba de ANDEVA de una vía.

RESULTADOS

Los valores promedios de las actividades específicas de las enzimas en estudio se muestran en el cuadro 1. Se observa que en animales inactivos y en trabajo la profundidad del tejido no afecta la actividad de CK puesto que los valores promedios obtenidos a los 3, 6 y 9 cm de profundidad no presentan diferencias significativas entre ellos (p > 0.05). Al comparar los valores obtenidos en animales en trabajo con aquellos determinados para los animales inactivos se observa que con el ejercicio incrementó significativamente (p < 0.05) la actividad de esta enzima tanto en la parte superficial, como media y profunda del tejido muscular.

* p < 0.05 versus equinos inactivos.
*' p < 0.05 versus equinos inactivos.
+ p < 0.05 versus profundidad del tejido.

Respecto a la enzima LDH, en animales inactivos, la actividad específica a la profundidad de 9 cm es significativamente menor (p < 0.05) que a los 6 y 3 cm; sin embargo, en animales en trabajo los valores no presentaron diferencias significativas a las distintas profundidades (p > 0.05). Al comparar los valores de LDH de los caballos inactivos con aquellos en trabajo se observa que esta actividad aumenta significativamente (p < 0.05) con el ejercicio en las tres profundidades del tejido (cuadro 1).

En relación a la enzima CS (cuadro 1), a los 3 cm de profundidad esta actividad es significativamente menor (p < 0.05) que a los 6 y 9 cm en animales inactivos; en cambio, en los animales en trabajo esta actividad aumentó significativamente (p < 0.05) a los 6 y 9 cm de profundidad comparado con la de 3 cm; sin embargo, entre las profundidades de 6 y 9 cm no hay diferencias significativas (p > 0.05). Al comparar los valores obtenidos en los animales inactivos con los en trabajo se observa que el ejercicio provoca un aumento altamente significativo (p < 0.01) en las distintas profundidades del músculo.

DISCUSION

El estudio de las actividades enzimáticas del metabolismo aeróbico y anaeróbico de la fibra muscular es importante para conocer las características de las principales rutas metabólicas y las adaptaciones que ocurren en el músculo esquelético en períodos en los cuales los equinos permanecen inactivos o están realizando un trabajo. (Essén-Gustavsson y col., 1984, 1987; López- Rivero, 1995). En este estudio se utilizó el músculo Gluteus medius por su volumen y variabilidad de sus características histoquímicas y bioquímicas (López-Rivero y col., 1992; Islas y col., 1996).

Al analizar la actividad específica de las enzimas del metabolismo anaeróbico estudiadas, se observa que CK no muestra cambios significativos en las distintas profundidades del músculo Gluteus medius; sin embargo, el ejercicio produce un aumento de esta actividad, observándose un incremento promedio de 7.2 veces los valores obtenidos en animales inactivos en las tres profundidades del tejido. La actividad LDH en animales inactivos es significativamente menor a mayor profundidad del tejido muscular mientras que en animales en trabajo esta actividad no presenta cambios significativos por efecto de la profundidad; el ejercicio provoca un aumento promedio de 1.6 veces a las profundidades de 3 y 6 cm y un incremento de 3.4 veces a los 9 cm de profundidad.

Los resultados obtenidos en este estudio difieren de aquellos realizados en caballos de tiro pesados y trotadores; en los de tiro pesados las actividades CK y LDH no mostraron diferencias significativas después del entrenamiento (Cutmore y col., 1985; Hodgson y col., 1985 y 1986; Hodgson y Rose, 1987) y en los trotadores la actividad LDH disminuyó después de un período de entrenamiento (Essén-Gustavsson y col., 1989). Estos resultados permiten afirmar que la edad, la raza y el tipo de ejercicio que los equinos realizan son factores predominantes de sus características miofibrilares (Kline y Bechtel, 1990; Rivero y col., 1995), y son concordantes con la composición fibrilar presentada por el músculo Gluteus medius de estos animales, que se caracteriza por estar constituido mayoritariamente de fibras tipo IIA y IIB no oxidativas en las regiones más superficiales (Islas y col., 1996; Bachman, 1996).

La actividad específica de la enzima CS, indicadora del metabolismo aeróbico, aumenta a medida que la profundidad del tejido es mayor, tanto en animales inactivos como en trabajo. Se observa que en los animales que están realizando un trabajo agrícola, la actividad CS aumenta un promedio de 2.6 veces los valores obtenidos en los inactivos. Los resultados obtenidos para estos caballos en ejercicio son coincidentes con los de estudios realizados en caballos fina sangre y trotadores (Hodgson y col., 1985 y 1986; Cutmore y col., 1985; Hodgson y Rose, 1987; Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Essén-Gustavsson y col., 1989), los cuales aumentan su actividad CS después de una o más semanas de entrenamiento. Además son concordantes con las características histoquímicas del músculo de estos equinos, ya que se ha comprobado en investigaciones anteriores que a las profundidades de 6 y 9 cm existe mayor porcentaje de fibras tipo I que de fibras tipo IIB (Islas y col., 1996). Las fibras tipo I se caracterizan por su alto metabolismo oxidativo, que utiliza sustratos extracelulares, como glucosa y ácidos grasos plasmáticos para la obtención de energía. Además, las fibras tipo I están mejor adaptadas para mantener la postura y para realizar actividades de larga duración y baja intensidad (Lindholm y col., 1983; Snow y col., 1983; Bechtel y Kline, 1987), características que presentan los equinos de tiro analizados en este estudio, los cuales son capaces de realizar trabajos continuos a baja velocidad y poco requerimiento de energía durante faenas de aradura de 6-8 horas (Cabezas y col., 1994; Pérez y col., 1996). La mayor actividad CS podría regular el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas ocupadas durante ejercicios submáximos (larga duración y baja intensidad), permitiendo una utilización más eficiente de la energía dentro de las fibras musculares y evitando la fatiga por agotamiento de las reservas de glicógeno (Snow y col., 1981) que se producen cuando los animales realizan un trabajo intenso.
De los resultados obtenidos se puede concluir que en períodos de inactividad y en trabajo, el músculo Gluteus medius del equino de tiro utiliza principalmente las vías metabólicas aeróbicas, predominando la actividad de la enzima CS, evaluadora de la capacidad oxidativa, lo que indicaría que la energía la obtienen de manera preferencial del ciclo cítrico, sin agotar las reservas de glicógeno. En períodos de trabajo todas las actividades enzimáticas aumentan, debido al mayor requerimiento energético.

RESUMEN

De 16 equinos mestizos de tiro, de ambos sexos, clínicamente sanos, se obtuvieron biopsias del músculo Gluteus medius a 3, 6 y 9 cm de profundidad, con el objetivo de evaluar su metabolismo anaeróbico y aeróbico, determinando las actividades de las enzimas creatinquinasa (CK), deshidrogenasa láctica (LDH) y citrato sintetasa (CS) en animales inactivos y trabajando en faenas agrícolas.

El tejido muscular se homogeneizó, sonicó y centrifugó; posteriormente en el sobrenadante se determinaron las actividades enzimáticas en estudio.

Los resultados obtenidos indican que la profundidad del tejido no afectó la actividad específica de CK, la actividad de LDH fue menor a 9 cm de profundidad en los equinos inactivos y la actividad de CS aumentó a mayor profundidad del tejido. Las actividades enzimáticas aumentaron por efecto del trabajo realizado por los animales.

Estos resultados señalan que los equinos mestizos de tiro incrementan su metabolismo al realizar faenas agrícolas; sin embargo, utilizan preferentemente el metabolismo aeróbico, evitando el consumo de las reservas de glicógeno y la fatiga muscular.
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Aceptado: 08.09.98.

* Financiado por Proyecto FONDECYT Nº 194.1005.

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