S.M. ESTEIN, M.V.

Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. 7000. Tandil. Argentina.
FAX/TEL. 54.2293 422357/28485/26667, E-MAIL silmares@unicen.vet.edu.ar, Dirección postal: Pinto 399. 7000. Argentina

Brucella ovis is the aethiological agent of ram contagious epididymitis, an infectious disease causing reproductive failure in sheep. Control measures include elimination of rams found positive in serological tests and/or bacteriological culture of semen, and vaccination when the prevalence is high.

The principal vaccine used against ovine brucellosis is B. melitensis Rev. 1, a live attenuated strain of B. melitensis. However Rev. 1 evokes antibodies interfering with the interpretation of serological tests used to diagnose infection by B. ovis and B. melitensis.

B. ovis is a natural rough species so lacks O polisaccharide chain. The outer membrane proteins of B.ovis have been studied by several groups searching for antigens useful for diagnosis and protection. A hot saline extract fron B. ovis contains rough lipopolysaccharide and several proteins, including abundant group 3 outer membrane proteins

The most efficient and widely used tests for serodiagnosis of B. ovis infection are double gel diffusion, complement fixation test and ELISA. Hot saline extract has provided best diagnostic results in all tests. However some cross-reactivity in these tests can be seen with sera of sheep naturally infected with B. melitensis or after B. melitensis Rev. 1 vaccination. Less information is available on internal B. ovis antigens. Recently, an indirect ELISA using BP26 (periplasmic protein) has been developed for the differentiation of infected and vaccinated rams.

The identification of B. ovis antigens able to elicit a protective immune response is of great interest for the development of subcellular vaccines avoiding the drawbacks of living attenuated vaccine. In the mouse model, passive protection experiments with mixtures of anti-outer membrane proteins and rough lipopolysaccharide monoclonal antibodies have shown to protect against B. ovis infection.

Palabras claves: Brucella ovis. Epididimitis. Carnero. Antígenos. Diagnóstico. Vacunas.

Key words: Brucella ovis. Epididymitis. Ram. Antigens. Diagnosis. Vaccines.

INTRODUCCION

B. ovis es el agente etiológico de la epididimitis contagiosa de los carneros, enfermedad infectocontagiosa de distribución mundial que provoca un impacto negativo en aquellos países donde la cría de ovinos es una actividad económica importante. En estos países, la explotación ovina se ve afectada por bajos índices reproductivos, alto número de carneros descartados anualmente, acortamiento de la vida reproductiva de los machos, abortos, elevada mortalidad perinatal y la consecuente disminución en los rendimientos de carne y lana por hectárea (Robles y col., 1990). En el cono sur, la epididimitis contagiosa constituye un problema muy importante en Argentina, Uruguay, Chile, Perú y sur de Brasil, aunque no existen estudios de prevalencia a nivel nacional y no hay información disponible respecto de las pérdidas económicas que esta enfermedad ocasiona.

La infección por B. ovis se asienta básicamente en el aparato genital ocasionando en los carneros epididimitis y disminución de la calidad del semen, y en las hembras preñadas aborto y mortalidad perinatal (Alton y col., 1988). En el macho, la brucelosis ovina por B. ovis causa una inflamación intersticial crónica con formación de un granuloma espermático en epidídimo, vesícula seminal y/o ampolla ipsilateral (Paolicchi y col., 1992). En esta última, el infiltrado periluminal sugiere una respuesta a antígenos intraluminales, ya sea B. ovis, fluído seminal o espermatozoides (Foster y col., 1987). En caso que las lesiones se asienten en testículo ocasiona la formación de espermatoceles y esterilidad. Como consecuencia estos trastonos el semen disminuye su calidad debido a la presencia de células inflamatorias, detritos celulares, disminución del número y motilidad de los espermatozoides y anormalidades morfológicas (Kott y col., 1988; Blasco, 1990).

El desarrollo de la infección difiere sustancialmente en la oveja respecto del macho. En la hembra vacía, B. ovis produce vaginocervicitis y endometritis con la consecuente infertilidad temporaria (Homse y col., 1995). En la hembra gestante, B. ovis hace bacteriemia y reaparece en el tracto genital a partir de la segunda mitad de la gestación ocasionando placentitis y muerte fetal (Bosseray, 1987) o el nacimiento de corderos con bajo peso y afectados de una neumonía supurativa o con lesiones en riñón o hígado que impiden su supervivencia (Libal , 1990).

El control de la enfermedad se apoya en la eliminación de los machos con diagnóstico bacteriológico y/o serológico positivo, y en la vacunación en lugares con alta prevalencia (Blasco, 1990). Las técnicas más eficientes para el serodiagnóstico de la infección por B. ovis, son la fijación del complemento, la inmunodifusión doble bidimensional y ELISA que utilizan como antígeno el extracto salino obtenido por calentamiento (HS). Recientemente se ha desarrollado un ELISA indirecto utilizando una proteína periplásmica como antígeno con utilidad para el diagnóstico de la infección por B. ovis (Arese y col., 1997).

La vacunación es el medio más económico y práctico para controlar la infección por B. ovis en países con prevalencias altas. Si bien la mayor parte de las vacunas utilizadas hasta el presente han demostrado proteger contra la infección por B. ovis, la mayoría posee la desventaja de inducir anticuerpos indistinguibles de los producidos por la infección natural acarreando confusión en el diagnóstico serológico de la enfermedad (Blasco y col., 1987)). Por esta razón, es importante el desarrollo de vacunas subcelulares, mediante la identificación de los antígenos de B. ovis, que induzcan una respuesta inmunitaria protectora sin interferir en el serodiagnóstico.

MORFOLOGIA Y CARACTERISTICAS CULTURALES

B. ovis es un cocobacilo acapsulado que carece de flagelos y pili (Merchant y Packer, 1975). Es un microorganismo Gram negativo y que se tiñe de rojo con la coloración de Stamp (Ziehl Neelsen modificada) (Timoney y col., 1988) o de Macchiavello.

B. ovis crece en medios sólidos ordinarios como el agar tripticasa soya o agar Columbia, enriquecidos con suero normal equino, bovino u ovino en una concentración final del 5 al 10% (Alton y col., 1988) y en una atmósfera con 5-10 % de CO₂ (Corbel y Bringley-Morgan, 1984). Para un primer aislamiento a partir de semen, mucus cervical o muestras de necropsia se utilizan los medios de cultivo sólidos selectivos como el Thayer Martin modificado (Marín y col., 1996) o el agar Skirrow que permiten el crecimiento de B. ovis inhibiendo la presencia de otros microorganismos presentes en la flora normal de vagina o prepucio (Paolicchi y col., 1991; Terzolo y col., 1991).

Las colonias en medio sólido, visibles luego de un período de incubación de 3 a 5 días, son pequeñas, circulares, de borde entero, opacas, de superficie granular y con distintas tonalidades desde el blanco mate al marrón. Se caracterizan por formar agregados granulares al ser resuspendidas en solución fisiológica o en soluciones ácidas débiles. La morfología rugosa de B. ovis, puede ser observada en forma directa a través del método de transiluminación oblicua donde las colonias aparecen de color amarillo, con un aspecto seco, granular y opaco. La confirmación de la observación directa se realiza mediante el uso de acriflavina, colorante que autoaglutina las colonias rugosas, o por la tinción de las colonias de color rojo o púrpura con el cristal violeta (Alton y col., 1988).

Las colonias de B. ovis aglutinan en presencia de suero policlonal de conejo anti-R; no lo hacen con los sueros anti-M o anti-A, dirigidos contra los antígenos de Brucella en fase lisa. Recientemente, se ha desarrollado una prueba de coaglutinación con látex para identificación rápida de colonias rugosas de Brucella la cual podría tener resultados más netos y reproducibles que la prueba anterior (Bowden y col., 1997).

ESTRUCTURA ANTIGENICA

Los antígenos de B. ovis han sido estudiados por su interés tanto para el diagnóstico como para la inmunoprofilaxis. En cortes estudiados por microscopía electrónica, las especies del género Brucella presentan una envoltura celular trilaminar constituída por una membrana interna o citoplasmática, separada de la membrana externa (ME) por un espacio periplásmico rico en proteínas solubles y peptidoglicano (PG) (Dubray y Plommet, 1976).

En la ME se encuentran dos grupos de antígenos mayores : el lipopolisacárido rugoso (LPS-R) y las proteínas de membrana externa (PME). Ambos se encuentran expuestos en la superficie de la ME presentando epitopes accesibles a los anticuerpos monoclonales (Acm) ya que no existe el impedimento estérico de la cadena O del lipopolisacárido presente en las cepas lisas de Brucella. Esto ha sido comprobado mediante distintas técnicas tales como ELISA sobre células enteras, microscopía electrónica y citometría de flujo (Bowden y col., 1995a).

El LPS-R es una molécula compleja y de bajo peso molecular compuesta por el lípido A y un núcleo o "core" constituído por oligosacáridos de glucosa, manosa y el 2-ceto, 3-desoxioctonato (KDO). Este último se encuentra en mayor proporción en B. ovis con respecto del resto de las especies de Brucella (Afzal y col., 1984a). Aunque en el lípido A y en el "core" existen epitopes compartidos con cepas rugosas de otras brucelas, hay también epitopes específicos de B. ovis (Díaz y Bosseray, 1973; Moreno y col., 1984; Suárez y col., 1990) y otros comunes con especies de otros géneros pertenecientes a la subdivisión a-2 de la clase Proteobacteria (Moreno y col., 1990; Velasco y col., 1997).

La ME de B. ovis contiene dos grupos de PME que se clasifican en mayores y menores de acuerdo a su abundancia relativa, las cuales se hallan estrechamente unidas al LPS-R. Al primer grupo pertenecen las proteínas de 36-38 kDa (Omp2b) o llamadas grupo 2 que funcionalmente son porinas (Verstreate y col., 1982) y el grupo 3 compuesto de las proteínas de 25-27 kDa y 31-34 kDa, actualmente denominadas Omp25 y Omp31 respectivamente, las cuales se encuentran asociadas fuertemente al PG (Cloeckaert y col., 1992).

Los genes que codifican para las PME mayores se encuentran conservados en las distintas especies Brucella. En el caso del gen para la Omp 25 presenta en B. ovis una única deleción que permite a distinguirla de las otras especies del género. En B. ovis, esta proteína presenta un peso molecular menor y una conformación diferente, la cual permitiría la exposición de epitopes discontínuos específicos en superficie (Cloeckaert y col., 1996a). Por otro lado, el clonado y la secuenciación del omp25 reveló que esta proteína no pertenece a la familia OmpA presente en otras Gram negativas como se había sugerido anteriormente de acuerdo a la composición aminoacídica (Cloeckaert y col., 1996b).

La proporción de las PME varía en las distintas especies, en el caso de B. ovis, las PME del grupo 3 son predominantes (Santos y col., 1984) y abundan en las vesículas liberadas espontáneamente durante la fase de crecimiento exponencial (Gamazo y col., 1989).

Las PME menores son las proteínas de 10 kDa, 16,5 kDa, 19 kDa y 89 kDa (89-94 kDa o grupo 1) habiéndose encontrados marcadores específicos de B. ovis en las primeras tres proteínas, actualmente llamadas Omp10, Omp16, Omp19 respectivamente. Estudios realizados con las Omp10 y Omp19 mostraron que esta última proteína presenta en B. ovis una masa molecular aparente mayor que en el resto de las especies aunque queda por investigar si esta diferencia tiene origen genético (Tibor y col., 1996). También se encuentra presente en la ME, una lipoproteína de 8 kDa que posee determinantes antigénicos comunes con la lipoproteína Braun de E. coli, la que se encuentra unida en forma covalente al PG (Gómez-Miguel y col., 1986 y 1987).

Recientemente, se ha identificado en el espacio periplásmico, una proteína de 26 kDa (BP26) que ha sido caracterizada y clonada y que se presenta altamente conservada en el género Brucella. Por otro lado, en el citoplasma, se ha identificado y caracterizado una proteína de 18 kDa, específica del género Brucella, cuyo gen ha sido clonado (Goldbaum y col., 1993) y secuenciado (Hemmen y col., 1995).

RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL Y CELULAR

La respuesta inmunitaria humoral a B. ovis ha sido estudiada a través de las pruebas serológicas clásicas. Sin embargo, sólo a través del western blot se han podido identificar los antígenos individuales y su inmunodominancia en el curso de la respuesta humoral a B. ovis. Los estudios realizados en ovinos infectados natural y experimentalmente, indican que la respuesta inmunitaria humoral ha estado dirigida principalmente contra el LPS-R y las PME del grupo 3, ambos expuestos en la superficie de Brucella y presentes en el extracto salino obtenido por calentamiento (HS) (Riezu Boj y col, 1986 y 1990). En animales con epididímo-orquitis la respuesta fue más intensa y dirigida hacia un mayor número de proteínas que en aquellos sin síntomas debido, probablemente, a una mayor estimulación antigénica. En otros estudios se identificaron cinco antígenos inmunodominantes presentes en las fases aguda y crónica de la infección: el LPS-R, las PME de 17, 19 y 29 kDa (reconocidas por los Acm anti-Omp 16, anti-Omp 19 y anti-Omp 25, respectivamente) y una proteína del estrés térmico de 63 kDa (Kittelberger y col., 1995a). Estudios posteriores llevados a cabo por estos mismos autores confirman estos hallazgos (Kittelberger y col., 1995b, 1996, 1997, 1998). Recientemente, la investigación de un suero de carnero naturalmente infectado, fue estudiada mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en dos dimensiones (2-D PAGE) y western blot (Teixeira-Gomes y col., 1997). Los resultados obtenidos indicaron que si bien hay anticuerpos dirigidos hacia las PME (PME de 89 kDa), también se reconocen proteínas periplásmicas (BP26) y citoplasmáticas (DnaK, GroEL).

Entre los animales de laboratorio, el ratón ha sido elegido para estudiar la respuesta inmunitaria a B. ovis (Jiménez de Bagués y col., 1993). Una de las estrategias utilizadas para identificar antígenos protectores se ha basado en la inyección de Acm anti-PMEs y anti-LPS-R previa a la inoculación de B. ovis. Los resultados de estos ensayos de protección indicaron que las PME menores y Omp31, son blancos importantes de la inmunidad humoral con una importante participación del LPS-R en la protección (Bowden y col., 1995b; Estein y col., 1996). Si bien se desconocen cuáles son los mecanismos de protección participantes, algunos autores se refieren a la opsonización como facilitadora de la muerte intracelular de B. ovis, lo que sugiere un probable rol de los anticuerpos, en tanto que la muerte extracelular podría estar mediada por el complemento o por las células "natural killer" (Jiménez de Bagués y col., 1994a).

B. ovis es un parásito intracelular facultativo, capaz de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los macrófagos al abrigo de la acción de los anticuerpos y defensas innatas del huésped. Si bien la inmunidad celular no ha sido aún estudiada en el carnero, ensayos en el ratón permitieron establecer que la transferencia pasiva de suero anti-HS resultó en una mayor protección que la transferencia de células sensibilizadas a dicho antígeno (Jiménez de Bagués y col., 1994b). Por otro lado, el suero anti-B. abortus RB51(cepa vacunal rugosa) confirió mayor protección que las células inmunes en el control de la infección por B. ovis (Jiménez de Bagués y col., 1994b). Por lo anteriormente expuesto, la inmunidad humoral cumpliría un rol más importante que la celular en la protección, aunque se desconoce cuáles son las células implicadas en la respuesta. Por otro lado, el predominio de los isotipos IgG2a e IgG3 en ratón permitiría inferir que B. ovis induce la población de linfocitos T colaboradores del tipo 1 (LTh1) productores de interferón g (Jiménez de Bagués y col., 1994a).

EPIDEMIOLOGIA

B. ovis infecta en forma natural exclusivamente a la especie ovina, siendo el macho más susceptible a la infección que la hembra. Por otro lado, la raza Merino es más resistente a la infección que las razas británicas y sus cruzas, en condiciones de explotación similares. Aunque la resistencia genética sería importante, las diferencias de precocidad y actividad sexual entre estas razas podría ser el aspecto determinante de la diferencia en la susceptibilidad (Timoney y col., 1988).

La infección experimental de caprinos jóvenes y adultos demostró que estos son menos susceptibles que los carneros ya que la infección en esta especie es de carácter leve y de corta duración (García Carrillo y col., 1974). Por otro lado se desconoce si la infección se transmite del ovino al caprino en condiciones de campo. En el hombre se han hallado reacciones serológicas positivas (Meyer, 1982), pero no se ha citado la infección en esta especie.

B. ovis afecta principalmente el tracto reproductor del carnero y produce infertilidad ya que altera la calidad del semen (Kott y col., 1988; Bulgin y col., 1990a). Si bien transmisión venérea es la principal vía de contagio, en machos con experiencia sexual (Buddle y col., 1983; Radostits y col., 1994), el contagio de carneros vírgenes se produce frecuentemente en períodos de estabulación prolongada por el contacto con orina de animales infectados. En estas condiciones el germen ingresa al organismo a través de las mucosas nasal (olfateo), oral (lamido), conjuntival o por la vía percutánea a través de heridas o escoriaciones (Alton y col., 1988; Bulgin y col., 1990c). Asimismo, la conducta homosexual de los machos fuera de la época de servicio, favorecería la entrada del microoganismo a través de la mucosa rectal (sodomía) (Bulgin y Anderson, 1983; Bulgin, 1990d).

El carnero infectado con B. ovis constituye el principal reservorio en el rebaño, siendo el semen fundamental en la difusión del germen. La liberación de B. ovis en semen es intermitente y por períodos prolongados, habiéndose hallado cultivos positivos hasta 80 semanas post-infección experimental (Paolicchi y col., 1991; Radostits y col., 1994).

Aunque la oveja es relativamente resistente a la infección algunos autores sostienen que juega un rol importante en la difusión de la enfermedad (Homse y col., 1995). La hembra infectada transmite el germen a otros machos sanos si es montada por éstos dentro de un mismo ciclo estral y esto explica los brotes de brucelosis posteriores a la época del servicio. Raramente la hembra mantiene la infección por más de dos ciclos y siendo responsable de difundir la enfermedad de un año a otro (Bulgin y col., 1990b). Si bien B. ovis no afecta la concepción, puede provocar mortalidad embrionaria con infertilidad transitoria y en menor proporción abortos hacia el final la gestación (Homse y col., 1995) así como placentitis, la cual impide la nutrición fetal y ocasiona abortos o el nacimiento de corderos prematuros o débiles (Libal, 1990). Si no se presta adecuada asistencia en el momento del parto, el cordero infectado muere; si sobrevive éste puede ser un potencial portador pudiendo desarrollar la enfermedad al llegar a la pubertad. Aunque la oveja se recupera de la infección luego del parto, se ha comprobado que ésta excreta B. ovis a través de las secreciones vaginales y uterinas, placenta y loquios. Asimismo, si bien la leche es una potencial fuente de infección, no existe información de la transmisión por esta vía al cordero lactante.

DIAGNOSTICO

El diagnóstico de la epididimitis contagiosa del carnero se basa en la combinación del examen clínico y su confirmación mediante el aislamiento de B. ovis en el semen y/o resultados positivos en las pruebas serológicas (Alton y col., 1988). Por otro lado, se debe tener en cuenta la situación epidemiológica de la majada, datos reproductivos como vacunaciones y antecedentes previos de epididimitis.

El examen clínico consiste en la palpación minuciosa del contenido escrotal, aunque el 50% de los animales infectados no desarrollan una epididimitis palpable siendo portadores y transmisores de la enfermedad (Kott y col., 1988). Sin embargo el hallazgo de un animal con epididimitis es solo orientativo y se debe realizar el diagnóstico diferencial.

El semen, obtenido por electroeyaculación, es examinado al microscopio óptico para determinar la existencia de anormalidades en la motilidad de los espermatozoides o de tipo morfológico (desprendimiento de cabeza o cola, vacuolización del acrosoma, etc.). La coloración con Giemsa permite evaluar la presencia de células inflamatorias, aunque el hallazgo de las mismas no es un signo patognomónico de la enfermedad. La muestra de semen se colorea con la coloración de Stamp. Ante la presencia de microorganismos sospechosos, la muestra se siembra en medio selectivo y se incuba en una atmósfera de 5-10% de CO₂ debiendo ser examinada durante 10 días antes de dar un cultivo como negativo. Por otro lado, este resultado no descarta la presencia de B. ovis ya que la naturaleza crónica de la enfermedad lleva a que la liberación del germen sea intermitente o que no se excrete.

Diversas pruebas serológicas han sido desarrolladas a lo largo del tiempo para detectar anticuerpos contra B. ovis. Las pruebas de aglutinación no son adecuadas para el diagnóstico de esta especie debido a la naturaleza autoaglutinante de sus células en suspensión. La hemaglutinación indirecta usando un antígeno sonicado de B. ovis no tuvo aceptación debido al alto número de falsos negativos y las dificultades en su estandarización. Por otro lado, la inmunofluorescencia indirecta si bien es específica posee una sensibilidad menor que la fijación del complemento (Afzal y col., 1986).

El diagnóstico y descarte, basados en la fijación del complemento con el extracto HS, combinados con la palpación escrotal, han dado resultados satisfactorios en los programas de erradicación en Australia y Nueva Zelandia (Niilo, 1984). La temperatura en que se desarrolla la reacción de fijación del complemento es importante. Se ha observado que a bajas temperaturas (1-4ºC) los títulos obtenidos han sido mayores y se han hallado reacciones positivas en estadíos tempranos de la infección. Sin embargo la prueba a baja temperatura resulta más sensible pero menos específica que la reacción a 37ºC. Esta prueba presenta la desventaja de ser compleja ya que requiere una rigurosa estandarización y titulación de cada uno de los reactivos (Sanchis y Abadie, 1986), presenta fenómeno de prozona, tiene menor sensibilidad (Ris y Te Punga, 1984) y especificidad que el ELISA (Vigliocco y col., 1997) y la inmunodifusión (Myers, 1973). Además no es compatible con el uso de sueros hemolisados o anticomplementarios (Searson y col., 1982).

La inmunodifusión en gel, utilizando el mismo antígeno, es la prueba de referencia en países de América del Sur como Chile, Argentina, Brasil, Perú y Uruguay. Esta técnica se caracteriza por ser sencilla, de bajo costo, fácil interpretación (Myers y Siniuk, 1970) , aunque se trata de una prueba cualitativa y que aún no ha sido adecuadamente estandarizada.

La fijación del complemento, la inmunodifusión en gel y el ELISA utilizan como antígeno al extracto HS, obtenido a partir de la cepa de B. ovis REO 198. En un mismo estudio, la comparación de estas técnicas utilizando diferentes extractos antigénicos, resultó en la elección del extracto HS debido a su solubilidad en agua, fácil obtención y a que éste es rico en antígenos inmunodominantes (Gamazo y col., 1989; Marín y col., 1989b). El principal problema que se presenta al usar este antígeno es la reacción cruzada en áreas donde hay alta prevalencia de B. melitensis o existen animales vacunados con B. melitensis Rev. 1.

En los últimos años, se han estudiado ELISA indirecto utilizando diferentes extractos antigénicos y comparado con la inmunodifusión en gel y la fijación del complemento. Las preparaciones antigénicas utilizadas fueron: antígeno de B. ovis sonicado o autoclavado, extractos de la ME obtenidos con desoxicolato y LPS-R extraído con mezclas de éter de petróleo-fenol-cloroformo (Afzal y col., 1984a; Ficapal y col., 1995). Recientemente se ha descripto un ELISA con LPS-R purificado en columna como antígeno que combina alta especificidad y sensibilidad comparado con la fijación del complemento en frío, el cual podría ser una herramienta útil en los programas de erradicación de B. ovis (Vigliocco y col., 1997). En el estudio de los antígenos internos, un ELISA indirecto anti-BP26 ha permitido diferenciar ovinos sanos, infectados o vacunados con B. melitensis Rev 1 (Arese y col., 1997; Rossetti y col., 1996; Zygmunt y col., 1997).

La prueba de ELISA supera en sensibilidad y especificidad a las técnicas anteriores y permite el procesamiento de gran número de muestras simultáneamente; además la hemólisis o anticomplementariedad del suero no afectan la reacción. Por otro lado la desventaja que presenta que se requiere un espectofotómetro para la lectura de la placa, con un mayor costo inicial. Los mejores resultados se han obtenido por la combinación de la inmunodifusión en gel y ELISA resultando en una sensibilidad del 100%.

Otra alternativa interesante para el diagnóstico es la prueba alérgica, que utiliza como alergeno a la brucelina del INRA², y que permite detectar la presencia de infección en un rebaño (Kolar y col., 1984). Es una prueba de vigilancia epidemiológica muy específica para Brucella spp. y de rutina, recomendada en rebaños ovinos sin una adecuada identificación de sus animales (Fensterbank, 1982) la cual es interferida por la vacunación con B. melitensis Rev. 1 o por la infección con otras especies de Brucella. Por otra parte, aunque carece de importancia como prueba de diagnóstico individual, es de elección en países sin una adecuada infraestructura.

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL

La epididimitis contagiosa de los carneros producida por B. ovis, debe ser diferenciada de la "epididimitis de los corderos" ocasionada por Histophilus ovis, Haemophilus somnus y Actinobacillus spp. A diferencia de B. ovis, este grupo de microorganismos pequeños y pleomórficos infectan animales más jóvenes y sin experiencia sexual (Bulgin y col., 1990c).

La infección placentaria por B. ovis debe ser distinguida de la producida por B. melitensis. Otros agentes intracelulares, también responsables de placentitis en la oveja, como Coxiella burnetti y Chlamydia psittaci, son puestos de manifiesto mediante la coloración de Giménez (Carter y Cole, 1990).

TRATAMIENTO

La multiplicación y supervivencia de B. ovis dentro del macrófago dificulta la acción de la terapia antibiótica. Por esta razón es necesario mantener concentraciones bactericidas por períodos prolongados y utilizar antibióticos capaces de atravesar la membrana de las células fagocíticas. La combinación de aureomicina con sulfato de estreptomicina, o bien oxitetraciclina con dihidroestreptomicina ha dado resultados satisfactorios ya que curó la epididimitis y eliminó la excreción de B. ovis por semen (Marín y col., 1989a). No obstante esto, el tratamiento sólo es práctico desde el punto de vista económico en carneros de valor, y siempre y cuando sea instituído antes de que aparezcan lesiones epididimarias irreversibles (Radostits y col., 1994).

MEDIDAS DE CONTROL

Diagnóstico y sacrificio. Las medidas de control tienden a la identificación y eliminación de los animales seropositivos y/o con epididimitis clínica , evitando la introducción de animales infectados. Con esta finalidad, los machos deben ser palpados un mes antes del servicio y sangrados al menos una vez por año. Algunos autores recomiendan la implementación del cultivo bacteriológico del semen como complemento al examen clínico y realización de pruebas serológicas pre-servicio (Paolicchi y col., 1992). El control sanitario mediante el sacrificio de los animales infectados, se aplica en países con baja prevalencia como Australia, Canadá y Rumania (Fensterbank, 1986), siendo de difícil implementación pero efectivo. En algunos países se aplica el control mixto que combina el control sanitario con la protección de efectivos sanos mediante la vacunación.

Vacunación. La vacunación es la única medida de control disponible en países con gran incidencia de infección por B. ovis, ya que en estas áreas la erradicación por medio de pruebas serológicas y eliminación de animales es económicamente impracticable (Blasco, 1990).

Las bacterinas (B. ovis inactivadas con formol), aplicadas por vía subcutánea, han sido las únicas vacunas específicas utilizadas para el control de la enfermedad. Estas, combinadas con adyuvantes del tipo oleoso, sales de aluminio o vitamina E han tenido limitada eficacia (Afzal y col., 1984b). Aunque la administración simúltanea de la bacterina con la cepa 19 de B. abortus ha conferido una protección eficaz (70-90% de protección), ésta induce una respuesta serológica de larga duración y deja secuelas como la epifisitis, osteomielitis y epididimitis (Swift y Maki, 1968; West, 1978).

B. melitensis Rev. 1, cepa atenuada lisa, ha sido considerada la mejor vacuna disponible para el control de las brucelosis ovina y caprina (Alton y Elberg, 1967). Su utilización para proteger a los ovinos frente a la infección por B. ovis ha sido ampliamente estudiada en la República Sudafricana, país donde actualmente se aplica. Esta confiere una eficaz protección cruzada contra B. ovis (60-100%) pero induce la formación de anticuerpos anti-O lipopolisacárido que interfieren con el diagnóstico serológico (Blasco y col., 1987); por esta razón no se aconseja su administración en áreas libres de B. melitensis.

La dosis estándar de B. melitensis Rev. 1 es de 1-2x10⁹ UFC/ml aplicada por vía subcutánea en animales entre los 3-8 meses de edad. Su utilización en animales sexualmente maduros induce una respuesta persistente que interfiere con el diagnóstico serológico, y puede provocar aborto en las hembras gestantes (Elberg, 1981) con excreción de la cepa vacunal. Se han buscado distintas estrategias para disponer de una vacunación exitosa en animales adultos a través del uso de una dosis vacunal reducida (Sales Henriques y col., 1992) y/o utilizando la vía de administración conjuntival (Marín y col., 1990; Zundel y col., 1992) con el objeto de reducir la duración de la respuesta serológica y disminuir el riesgo de aborto en caso de ser aplicada en hembras preñadas. La vacunación con dosis reducida (1x10⁵ -1x10⁷ UFC/ml), vía subcutánea, ha ocasionado aborto en ovejas en el segundo o tercer mes de gestación. Por otro lado, la vacunación conjuntival con B. melitensis Rev. 1 en dosis estándar o utilizando 1x 10⁸ UFC/ml ha protegido provocando una respuesta serológica de menor duración, presentando la ventaja de tener una fácil y práctica aplicación, aunque no resultó totalmente inocua en ovejas preñadas (Zundel y col., 1992).

Otras vacunas heterólogas probadas han sido las cepas B. abortus RB51 y B. suis cepa 2, las cuales si bien protegieron frente al desafío con B. ovis en el ratón; no lo hicieron adecuadamente en el ovino (Blasco y col., 1993b; Jiménez de Bagués y col., 1995).

En carneros, se ha estudiado en un mismo ensayo, la eficacia en la protección de diferentes preparaciones antigénicas obtenidas de B. ovis y vacunas con cepas heterólogas. Las fracciones utilizadas fueron el HS, el PG unido a PME y las PMEs libres del LPS-R, B. abortus 45/20 (cepa rugosa muerta) y B. melitensis Rev. 1. La vacunación con el extracto HS confirió un nivel de protección semejante al obtenido con B. melitensis Rev. 1 frente a B. ovis virulenta (Blasco y col., 1993a).

RESUMEN

Brucella ovis es el agente etiológico de la epididimitis contagiosa de los carneros, enfermedad infectocontagiosa que ocasiona infertilidad en el carnero y ocasionalmente abortos en la oveja. El control de esta enfermedad se apoya en la eliminación de los machos con diagnóstico serológico y/o séminocultivo positivo, y en la vacunación de los animales sanos en lugares de alta prevalencia.

La mejor vacuna frente a la brucelosis ovina por B. ovis, es B. melitensis Rev. 1, una cepa atenuada de Brucella melitensis. Sin embargo ésta vacuna heteróloga induce una respuesta serológica que interfiere con la interpretación de las pruebas serológicas utilizadas.

B. ovis es una especie naturalmente rugosa; carece de la cadena O del lipopolisacárido. Las proteínas de la membrana externa han sido objeto de estudio de varios grupos de investigación por su utilidad como antígenos para el diagnóstico y en la pruebas de protección. Un extracto salino obtenido por calentamiento de B. ovis, posee el lipopolisacárido rugoso y varias proteínas, siendo más abundante el grupo 3 de las proteínas de la membrana externa.

Las técnicas más eficientes para el diagnóstico de la infección por B. ovis, son la inmunodifusión doble bidimensional en gel de agar, la fijación del complemento y ELISA. Como antígeno, el extracto salino ha dado los mejores resultados en las tres pruebas; sin embargo se ha observado reacción cruzada con sueros de animales infectados por B. melitensis o vacunados con B. melitensis Rev. 1. Existe menos información disponible respecto de los antígenos internos de B. ovis. Recientemente, se ha desarrollado un ELISA indirecto utilizando la proteína periplásmica BP26 con utilidad para el diagnóstico de la infección por B. ovis, ya que permite diferenciar los carneros infectados de los vacunados.

La identificación de los antígenos de B. ovis capaces de inducir una respuesta inmune protectora es de interés para el desarrollo de vacunas subcelulares que no presenten las desventajas de Rev. 1. Con ese objetivo se han desarrollado ensayos de inmunización pasiva con mezclas de anticuerpos monoclonales anti-proteínas de la membrana externa y anti-lipopolisacárido rugoso que han otorgado protección en el ratón contra B. ovis.

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Aceptado: 09.03.99
² Institut National de la Recherche Agronomique, France.

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