A study to evaluated the inmunohistochemistry techniques (IHC) as dignosis the E. coli fimbrial antigens in intestines of sucklings pigs with diarrhea, was carried out. Fifty suckling pigs, naturally infected, with diarrhoea were analyzed to microbiologically isolate and identify the antigen fimbrial in the small intestine with Inmunohistochemistry (Indirect Inmunofluorencence and Streptavidin-Biotin-Peroxidase) and aglutination test.

The most commonly diagnosed etiological agent in suckling pigs with diarrhea was E. coli (34% alone and 24% associated), followed by Salmonella sp, Rotavirus and Campylobacter sp. IHC identified antigen with the isolation of E. coli, in ten pigs, in one with Salmonella sp and in five without ethiological diagnosis.

The most frequent fimbrial antigen  found was F41 in eight pigs aged 1 to 35 days, followed by the association F4-F41 in five animals with ages ranging between 15 to 28 days and finally, F4 in three pigs between 8 and 35 days.

The results confirm the importance of fimbrial antigens as adhesion factor on enteropathogenic E. coli in the small intestine of suckling pigs, since the effectiveness of inmunohistochemistry for identity the fimbrial antigen in paraffin embedded intestines.

Palabras claves: E. coli enteropatógeno, fimbrias, inmunohistoquímica, cerdos lactantes.

Key words: Enteropathogenic E. Coli, fimbriae, inmunohistochemical, suckling pigs.

INTRODUCCION

La colibacilosis es una enfermedad digestiva o sistemática que en los cerdos lactantes y otros animales jóvenes es responsable de cuantiosas pérdidas económicas (Van Kruiningen, 1995). Las fimbrias son proteínas fibrilares de superficie, de 0.2µm de longitud y entre 2 y 7 mm de ancho, que permiten la adherencia bacteriana a las células epiteliales intestinales, constituyendo un importante factor de patogenicidad de E. coli enteropatógeno, siendo F4, F5, F6 y F41 las de mayor presentación en los cuadros de diarrea neonatal en porcinos (Mainil y col., 1995). Cepas de E. coli con F4 con capaces de adherirse y promover la colonización principalmente en intestino delgado anterior en cerdos neonatos mientras que fimbria F6, diagnosticada en colibacilosis de bovinos y porcinos, coloniza principalmente yeyuno posterior e íleon siendo difícil su demostración en cultivos in vitro (Fairbrother, 1994). La fimbria F5 es el principal factor de adherencia de cepas de E. coli enterotoxigénixicas en terneros (Acres, 1985). Sin embargo Evans y col. (1986) observaron alta presentación de F5 en cerdos provenientes de planteles con crianza mixta. La identificación de fimbrias de E. coli en cuadros de diarrea permitiría realizar un diagnóstico rápido de cepas enteropatógenas para instaurar tratamiento e inmunoprofilaxis, ya que las fimbrias son excelentes inmunógenos (Fairbrother, 1994; Nystrom, 1994). Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) son específicas, sensibles y fáciles de realizar, por lo que en el presente estudio las mismas se utilizaron con la finalidad de identificar estos antígenos en intestino delgado de cerdos lactantes que presentaron diarrea.

MATERIAL Y METODOS

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN: El material estuvo constituido por duodeno, yeyuno e íleon de 50 cerdos lactantes que cursaban con diarrea y procedían de 6 explotaciones porcinas de la zona central y 3 del área sur de Chile. Los animales se obtuvieron durante los meses de febrero a abril de 1997.

EDAD DE LOS ANIMALES: Todos los cerdos se registraron con la edad correspondiente, obteniéndose 19 cerdos de 1 a 7 días de edad, 13 de 8 a 15 días, 3 de 16 a 21 días, 9 de 22 a 28 días y finalmente 6 de 29 a 35 días. En los casos de diagnóstico de E. coli, la edad se relacionó con la presentación de los diferentes antígenos fimbriales.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO: Posterior a la necropsia de los cerdos, se recolectaron contenidos de duodeno, yeyuno e íleon de cada cerdo, remitiéndose refrigerados al Laboratorio de Microbiología¹ dentro de las 8 -12 horas. Las muestras fueron sembradas en Agar Eosina Azul de Metileno; cuando se observó desarrollo de un 80 % o más de colonias típicas de E. coli (Schudel,1985), se efectuó la prueba de Aglutinación (Fimbrex®)² para determinar el tipo de fimbria presente (F4, F5, F6 y F41). Para estudios virológicos (inmunofluorescencia para rotavirus y coronavirus) se tomó una muestra de íleon.

INMUNOHISTOQUÍMICA: La identificación de las diferentes fimbrias se realizó en base a Inmunofluorescencia Indirecta y Streptavidina-Biotina-Peroxidasa.

INMUNOFLURESCENCIA INDIRECTA (IFI): En la totalidad de los cerdos se realizó IFI de acuerdo a la técnica de Sternberger (1986) en improntas y en cortes de duodeno, yeyuno e íleon en crióstato. Se realizaron 5 improntas y cortes de íleon donde se probaron los 4 antisueros primarios en cada cerdo; en los casos en que se observó inmunorreactividad con uno de los antisueros, el mismo se incubó en duodeno y yeyuno.

Sueros Utilizados: Como sueros primarios se utilizaron antisueros policlonales adsorbidos (F4, F5, F6 y F41), obtenidos en conejos y preparados en el National Animal Disease Center³. La dilución óptima fue de 1:500, la cual se realizó en buffer TRIS 0.05 M, pH 7.6 más 0.7% de Carrageenan (Sigma). Como anticuerpo secundario se utilizó Inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG ,wole molecule, Sigma), en dilución de 1:40 en buffer fosfato salino 0.01M, pH 7.6 (PBS).

Como controles positivos se utilizaron cortes en crióstato de íleon de cerdos inmunorreactivos a F4, F5, F6 y F41. Como controles negativos se incubaron improntas y cortes de íleon con suero normal de conejo o buffer.

Control Negativo. Los antisueros primarios fueron reemplazados por suero no inmune de conejo o por buffer en improntas y secciones de íleon de cada cerdo.

Técnica Utilizada: Las improntas y cortes de duodeno, yeyuno e íleon realizados en crióstato fueron lavados con PBS,  siendo posteriormente incubados con el antisuero correspondiente en cámara húmeda, a 20ºC durante 1 hora. Posterior a dos lavados de 10 minutos cada uno en PBS pH 7.6, los preparados se incubaron con el anticuerpo secundario en cámara húmera, a 20ºC durante 1 hora, se realizaron dos lavados en PBS de 10 minutos cada uno y se montaron en glicerol y PBS (9:1). La observación se realizó en microscopio de fluorescencia marca Zeiss.

Interpretación de la reacción: Se consideró inmunorreactividad cuando, en las improntas se observaron más de 10 bacterias con bordes fluorescentes por campo de 40X y cuando en cortes de intestino con crióstato se apreciaron bacterias adheridas al ápex y bordes laterales de las vellosidades (Francis, 1983).

STREPTAVIDINA - BIOTINA PEROXIDASA ("Labelled Streptavidin-Biotin") (LSAB⁴): Esta técnica se realizó siguiendo el procedimiento de Sternberger (1986) en muestras de duodeno, yeyuno e íleon de la totalidad de los cerdos, fijadas en formol tamponado al 10%. Posteriormente, las muestras se deshidrataron mediante pasajes en alcoholes ascendentes y se aclararon en xilol. Luego de dos pasajes en parafina a 60ºC, se incluyeron y cortaron en micrótomo de rotación con un espesor de 5 µm para , posteriormente, montarlos en portaobjetos previamente impregnados en Poly-L-lysina.

Antisueros Primarios: Los antisueros primarios utilizados corresponden a los descritos en la Técnica de IFI. Se realizaron diluciones de 1:1000 para F4, F5 y F6 y de 1:1500 para F41 en Buffer TRIS 0.05M, pH 7.6 más Carrageenan 0.7% (Sigma).

Técnica Utilizada: Se usó LSAB, de acuerdo a lo especificado por Naish (1989). Los cortes de tejido incluídos en parafina fueron desparafinados y lavados en buffer TRIS. Luego se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos para anular la acción de la peroxidasa endógena, se lavaron en agua destilada y se colocan en solución buffer TRIS. Se extrajo el exceso de buffer, se incuban con el agente bloqueante y luego, con el anticuerpo primario correspondiente y con el antisuero usado como control negativo, en cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 2 horas. Posterior a dos lavados en buffer de 10 minutos cada uno se cubrieronn las muestras con el agente biotinilado (segundo anticuerpo), manteniéndose en incubación en cámara húmeda, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego de dos lavados en buffer de 10 minutos cada uno, los cortes se cubrieron con streptavidina-peroxidasa y se incuban durante 30 minutos; posterior a dos lavados en buffer, se cubrieron con la solución substrato-cromógeno (3-amino-9-ethilcarbazol AEC) y se incubaron durante 10 minutos. Se realizó la tinción de contraste con Hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y se montaron en glicerina Jelly (Luna,1968). Los controles utilizados fueron similares a los de IFI.

Interpretación de la Reacción: Se consideró inmunorreactividad cuando se observaba precipitado de color rojo en los sitios de reacción antígeno-anticuerpo (ápex y bordes de las vellosidades intestinales).

Registro de información: Los datos obtenidos fueron ingresados en una planilla electrónica (Microsoft Excel 5.0), la que permitió el análisis de resultados y generación de tablas.

RESULTADOS

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO E IDENTIFICACIÓN DE FIMBRIAS. De los 50 cerdos lactantes con cuadro diarréico, se identificaron antígenos fimbriales en intestino delgado mediante IHQ en 16 (32%) de ellos. De éstos, en 10 casos se observó aislamiento de E. coli solo o asociado a otros agentes biológicos; en los 6 restantes, 5 no presentaron desarrollo bacteriano en medio de cultivo y en un caso se aisló Salmonella sp.

Los antígenos fimbriales de E. coli identificados en el presente estudio mediante IHQ correspondieron a antígeno F4 (3 cerditos); F41 (8 animales) y una asociación de ambos F4 y F41 (5 casos), no apreciéndose diferencias en cuanto a la sensibilidad de las técnicas utilizadas. No se observó inmunorreacción a fimbrias F5 y F6 de E. coli en el intestino delgado de la totalidad de los animales en estudio.

En cuanto a la prueba de Aglutinación, ésta permitió identificar fimbriales en 3 cerditos, lo cual muestra un menor grado de sensibilidad al reconocimiento de fimbrias que mediante las ténicas de IHQ (cuadro 1). La adhesión y colonización de E. coli en duodeno, yeyuno e íleon de los cerdos lactantes con diarrea, se evidenció mediante la inmunorreactividad de los diferentes tipos de fiambrias en los enterocitos de la mucosa intestinal (cuadro 2).

Cepas de E. coli F4 se adhirieron y colonizaron los tres segmentos intestinales estudiados, en cambio, las cepas con fimbria F41 presentaron inmunorreactividad principalmente en yeyuno e íleon . Similar respuesta se observó con los antígenos fimbriales F4-F41 asociados cuando se identificaron en un mismo animal.

Edad cerdos (días)		Nº de cerdos con antígenos fimbriales			Total de cerdos con antígenos fiambriales
		F4	F41	F4-F41
1 - 7	(n=19)	-	3	-	3
8 - 14	(n=13)	1	2	-	3
15 - 21	(n=3)	-	1	2	3
22 - 28	(n=9)	1	1	3	5
29 - 35	(n=6)	1	1	-	2
Total		3	8	5	16

De los 29 cerdos con aislamiento de E. coli solo o asociado a otros agentes biológicos, en 10 se identificaron antígenos fimbriales mediante IHQ. A este respecto, Fairbrother (1993) hace mención a la existencia de diferentes factores de patogenicidad (enterotoxinas, verotoxinas, hemolisinas o factores de colonización de cepas enteropatógenas) que serían responsables de cuadros de diarrea en los que no están presentes antígenos fimbriales. Por otra parte, Ojeniyi y col. (1994), mediante pruebas genéticas en 191 cepas de E. coli en cerdos neonatos con diarrea, concluyeron que es posible la existencia de otros factores de adherencia diferentes a los antígenos fimbriales (F4, F5, F6 y F41) como la fimbria F107 y genes para toxinas STa, LT y VT. Pot otra parte, Zambrano (1995) en un estudio en 239 cepas de E. coli aisladas de cerdos entre 1 y 28 días de edad observó que el 13,80% no expresaban antígeno fimbrial F4, F5, F6 y F41, sin embargo dichas cepas presentaban adherencia a las microvellosidades de los enterocitos en pruebas de enterocitoadherencia in vitro, demostrando así la existencia de antígenos de adherencia diferentes.

En 8 casos no hubo aislamiento bacteriológico, sin embargo, en 5 de ellos se identificaron fimbrias mediante IHQ (cuadro 1). El aislamiento negativo se atribuye al escaso desarrollo de E. coli en medios de cultivo, considerándose positivo cuando había como mínimo, un 80% de colonias típicas, según el procedimiento descrito por Schudel (1985). Por otra parte, es posible que tratamientos con antibióticos previamente instaurados en los cerdos con signos de diarrea, hubiesen enmascarado el desarrollo bacteriano en medios de cultivo.

El antígeno fimbrial más frecuentemente identificado mediante IHQ en cerdos lactantes con diarrea fue F41, seguido de la asociación F4-F41 y de F4 (cuadro 1). Al respecto, el F41 no ha sido informado anteriormente en Chile. Estos resultados son concordantes con los comunicados por Zambrano (1995) en México; sin embargo, contrastan con los encontrados por Wilson y Francis (1986) en Estados Unidos, que observaron mayor frecuencia de F4, antígeno reconocido como el de mayor patogenicidad en cuadros de colibacilosis en lechones. De igual forma, Morris y col. (1982) mencionan al antígeno F4 como la adhesina mas frecuente, sin embargo proponen que los antígenos F5 y F6 también deben ser considerados como responsables de cuadros diarreicos en lechones durante las primeras semanas de vida.

En la presente investigación no se identificaron las fimbrias F5 y F6. Estos resultados en general son concordantes con los obtenidos por Pinochet y col. (1985) en cerdos lactantes con diarrea y con los estudios efectuados por Zamora y col. (1996) a nivel nacional, quienes identificaron sólo una cepa de E. coli F6 y F5, respectivamente. De igual forma, Zambrano (1995) no logró identificar antígeno F6; sin embargo encontró un alto porcentaje de F5. Las diferencias con este último autor, en relación a la fimbria F5, podrían relacionarse a los sistemas de manejo mixtos entre cerdos y bovinos, dado que la fimbria F5 es el principal factor de adherencia de cepas de E. coli enterotóxicas en terneros (Acres, 1985). Al respecto, Evans y col. (1986) observaron una alta presentación de antígeno fimbrial F5 en cerdos que provenían de planteles con crianza mixta.

Con respecto a la edad de los cerdos y la presentación cepas de E. coli con fimbrias, se evidenció antígeno F41 en cerdos de entre 1 y 35 días de edad, lo que es concordante con lo descrito por Söderlind y col. (1988) quienes observaron dicho antígeno en cerdos entre 1 y 6 semanas, no así en mayores. De igual forma, Zambrano (1995) detectó F41 en las 4 primeras semanas de vida. Por otra parte, el antígeno F4 fue identificado en cerdos de 2, 4 y 5 semanas, similar a lo observado por Söderlind y col. (1988) y Fairbrother (1994) quienes hacen mención a que este antígeno se puede encontrar en cerdos de diferentes edades y que su presentación aumenta con la edad (cuadro 3).

Las fimbrias F4, F5, F6 y F41 además de constituir un importante factor de virulencia de E. coli, poseen excelentes propiedades inmunogénicas, es por eso que Fairbrother (1994) y Nystrom (1994) recomiendan el control de la colibacilosis mediante el uso de vacunas en base a antígenos fimbriales, en tanto Cortes y col. (1996), las utilizan en la elaboración de anticuerpos, vacunas e inmunosondas. Para implementar dicha medida de control, es imprescindible conocer los diferentes factores de patogenicidad presente en E. coli. El diagnóstico mediante IHQ es un método efectivo y rápido que además podría implementarse en improntas de fecas de cerdos con diarrea y sanos, con el fin de detectar posibles portadores de antígenos fimbriales; sin embargo, la presencia de cepas no portadoras de F4, F5, F6 y F41 hace necesario el estudio de otros factores de adhesión.

Finalmente, cabe destacar la importancia de razas resistentes a antígenos fimbriales, ya que muchas de ellas han perdido o no poseen los receptores específicos para la adhesión bacteriana, por lo que la caracterización de los mismos podría facilitar la elaboración de compuestos análogos que prevengan la adhesión fimbria-receptor (Nystrom, 1994).

RESUMEN

El presente trabajo se realizó con el propósito de considerar a las técnicas inmunohistoquímicas como método de diagnóstico seguro y rápido para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli en intestino delgado de cerdos lactantes con cuadro diarreico. Se realizó aislamiento microbiológico e inmunohistoquímica en duodeno, yeyuno e íleon de 50 cerdos lactantes infectados naturalmente.

E. coli sola (34%) así como asociada (24%) a otros microorganismos fue el agente etiológico mas frecuentemente diagnosticado en cerdos lactantes con diarrea, seguido de Salmonella sp., Rotavirus y Campylobacter sp. Mediante IHQ se identificó antígenos fimbriales en 10 cerdos con aislamiento de E. coli, en 1 con Salmonella sp. y en 5 sin diagnóstico etiológico. El antígeno fimbrial más frecuentemente encontrado fue F41 en 8 cerdos entre 1 y 35 días de edad, seguido de la asociación de F4-F41 en 5 animales de 15 a 28 días y, finalmente, F4 en 3 cerdos entre 8 y 35 días. E. coli F4 fue identificado en los tres segmentos intestinales, mientras que E. coli F41 colonizó principalmente íleon y yeyuno.

Los resultados de la presente investigación confirman la importancia de E. coli en los cuadros de diarrea en cerdos lactantes, así como la efectividad de las técnicas IHQ para la identificación de antígenos fimbriales en cortes de intestino embebidos en parafina. Sin embargo, se debe resaltar la posible presentación de otros factores de adhesión de E. coli a los enterocitos, lo que permite proyectar futuras investigaciones .

AGRADECIMIENTO

A la Dra. Evelyn Nistrom, del National Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Ames, Iowa, por su contribución con los antisueros primarios.
_______________________________________________
Aceptado: 01.12.98

*Proyecto FONDECYT 1951150

1 Instituto de Microbiología, Fac. de Cs., Universidad
Austral de Chile.

2 Antisueros y Aglutinantes Fimbrex F4, F5, F6 y F41, Central
Veterinary Laboratory, Weybridge, Inglaterra.

3 National Animal Disease Center, Agriculture Research
Service, United States Department of Agriculture, Ames,
Iowa. USA.

4 Universal DAKO LSAB® Kit, Peroxidase (DAKO
LDAB® Kit HRP).

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