A study to evaluate two Inmunohistochemistry (IHC) techniques (Indirect Immunoflourescense IFI and Streptavidina-Biotine-Peroxidase LSAB) to identify the antigen fimbrial of different enteropathogenic strains of E. coli was done, correlating the results with the Aglutination test.

Newborn piglets without calostrum were innoculated with enteropathogenic strains of E. coli which contained F4, F5, F6 and F41. Piglets were analysed to microbiologically isolate and identify the antigen fimbrial in the small intestine with IHC and Aglutination test.

The IHC techniques , identified F4 fimbriae was in the three intestinal segments ; However, the Ag F5, F6 and F41 were found in the ileon and jejunum with lesser frequency than in the duodenum. The aglutination test identified antigen F4 and F5 but was not able to identify F6 and F41.

These results suggest that IFI in cryostat-microtome sections and LSAB in paraffin embedded tissues, are effective and may be useful for a rapid analysis and for epidemiological studies of suckling pigs with diahrroea for E. coli .

Palabras claves: E. coli enteropatógeno, fimbrias, inmunohistoquímica, inoculación experimental, lechones.

Key words: Enteropathogenic E. coli, fimbriae, inmunohistochemical, experimental inoculation, suckling pigs.

INTRODUCCION

En la actualidad se considera a E. coli como el agente etiológico de mayor importancia en la presentación de cuadros diarreicos en cerdos lactantes. Entre los factores de virulencia que son los responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad, se encuentran las fimbrias o pili, necesarios para permitir la adhesión y colonización de cepas enteropatógenas (EPEC) y enterotoxigénicas (ETEC) de E. coli a las células epiteliales del intestino delgado del huésped, con posterior elaboración de toxinas en caso de ETEC, las que estimulan la secreción de fluídos con producción de diarrea (Fairbrother, 1994).

Las fimbrias corresponden a apéndices proteinaceos no flagelares, fibrilares, de 0,2 µm de largo por 2 - 7 nm de ancho, distribuidos en la superficie de la bacteria, pudiendo variar su número desde unos pocos a varios cientos. E. coli produce una o varias adhesinas fimbriales: I, CFAI, CFAII, K88, K99, 987P, Att 25 o FY, F41, F107, esta variedad de nomenclatura ha creado confusión, por lo que en la actualidad se denomina F1, F2, F3, F4, F5, F6, F17, F41, F107, respectivamente (Arp, 1988; Fairbrother, 1993; Nystrom, 1994), encontrándose en cuadros de diarrea neonatal en porcinos asociados con (ETEC), los antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 (Mainil y col. 1995).

Entre los método más utilizados para realizar el diagnóstico de colibacilosis en cerdos lactantes, se encuentra el aislamiento bacteriológico de E. coli con posterior identificación de fimbrias y toxinas presentes, metodología que requiere de cierto período de tiempo para su realización y está sujeto además a las condiciones de cultivo. Sin embargo, en la actualidad, el diagnóstico se ha facilitado mediante la implementación de exámenes inmunohistoquímicos (IHQ), los que son rápidos, seguros y simples.

Dada la importancia que tienen las fimbrias como factor de virulencia de E. coli en la presentación de diarrea en cerdos lactantes, se realizó el presente estudio con el objetivo de implementar dos técnicas IHQ para la identificación y localización de fimbrias en los diferentes segmentos del intestino delgado, en cerdos neonatos que no recibieron calostro y quie fueron inoculados experimentalmente con diferentes cepas de E. coli. Además se compararon dichas técnicas con el Test de aglutinación, que se realizó con las cepas de E. coli que se aislaron por cultivo bacteriológico.

MATERIAL Y METODOS

Animales de Experimentación: se utilizaron 25 lechoes neonatos separados de sus madres inmediatamente después del parto a fin de evitar la ingestión de calostro, contacto con la cerda y con el medio ambiente.

Cepas de E. coli Utilizadas: las cepas bacterianas utilizadas en la presente investigación (E. coli F4, F5, F6 y F41) forman parte del cepario del Instituto de Microbiología de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Austral de Chile. Dichas cepas se desarrollaron en medio agar CFA (Colonization Factor Antigen) con el propósito de favorecer y estimular la producción de fimbrias siguiendo el procedimiento descrito por Evans y col. (1979).

Una vez comprobada la presencia de fimbrias en las cepas aisladas, por el método de aglutinación, se prepararon inóculos suspendiendo la cepa de E. coli en un tubo con solución buffer (10⁸ - 10⁹ bacterias/ml), de acuerdo al procedimiento descrito por McFarland's (Mac Faddin, 1980).

Grupos Experimentales: se constituyeron cinco grupos de 5 cerdos cada uno (cuadro 1), los cuales fueron mantenidos a 25-30ºC, durante 24 horas, alimentados con Glucosa al 5%¹ vía ora, siendo posteriormente eutanasiados con sobre dosis de pentobarbital sódico² vía intracardíaca. En los Grupos IV y V se descartaron dos cerditos, uno de cada grupo, por presentar marcada debilidad al momento de la inoculación.

Grupo	Cepa de E. coli administrada (vía oral)	Nº de cerdos
I	Solución fisiológica (Control) (5 ml)	5
II	E. coli F4 (108 - 109 bacterias en 4 ml solución fisiológica)	5
III	E. coli F5 (108 - 109 bacterias en 4 ml solución fisiológica)	5
IV	E. coli F6 (108 - 109 bacterias en 4 ml solución fisiológica)	4
V	E. coli F41 (108 - 109 bacterias en 4 ml solución fisiológica)	4

Análisis Microbiológico: posterior a la eutanasia,de cada cerditos se obtuvo contenido de duodeno, yeyuno e íleon que se dispuso en bolsas plásticas estériles, rotuladas, conservadas a 4ºC y enviadas al Instituto de Microbiología³ para la realización de cultivo bacteriológico e identificación de fimbrias mediante el Test de Aglutinación (Fimbrex^®)⁴ (figura 1).

Inmunohistoquímica (IHQ): la identificación y distribución de antígenos fimbriales se realizó mediante dos técnicas de IHQ, empleándose para ello la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y la Técnica de Streptavidina - Biotina Peroxidasa (LSAB).

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): en la totalidad de los cerdos inoculados experimentalmente, se realizó IFI de acuerdo a la técnica de Sternberger (1986) en improntas y cortes en crióstato de duodeno, yeyuno e íleon.

Improntas: de cada cerdo se obtuvo una porción de duodeno, yeyuno y 5 de íleon para realizar improntas, las cuales se secaron y fijaron en Acetona durante 5 minutos, manteniéndose en refrigeradas hasta su procesamiento mediante IFI.

De las muestras obtenidas, se incubaron 4 secciones de íleon, cada una con un anticuerpo primario diferente a fin de descartar reacciones cruzadas entre ellos; el quinto corte se utilizó como control negativo. Los cortes de duodeno y yeyuno se incubaron con el anticuerpo correspondiente a la inoculación, siguiendo el procedimiento descrito por Thorns y col. (1987) para la determinación de fimbrias en cortes de intestino.

Anticuerpos: como anticuerpos primarios se utilizaron antisueros policlonales de conejo adsorbidos (F4, F5, F6 y F41), preparados en el National Animal Disease Center⁵. La dilución óptima para improntas y sección de tejido fue de 1:500, la cual se realizó en buffer TRIS 0.05 M, pH 7.6 más 0.7% de Carrageenan (Sigma). Como anticuerpo secundario se utilizó Inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG ,whole molecule, Sigma), en dilución de 1:40 en buffer fosfato salino 0.01M, pH 7.6 (PBS).

Técnica : las improntas y cortes de duodeno, yeyuno e íleon realizados en crióstato fueron lavados con PBS, pH 7.6; siendo posteriormente incubados con el antisuero correspondiente en cámara húmeda, a 20ºC durante 1 hora. Posterior a dos lavados de 10 minutos cada uno en PBS pH 7.6, los preparados se incubaron con el anticuerpo secundario en cámara húmera, a 20ºC durante 1 hora, para finalmente realizar dos lavados en PBS pH 7.6 de 10 minutos cada uno y montarse en glicerol y PBS (9:1). Los tejidos fueron observados en microscopio de fluorescencia marca Zeiss.

Control Negativo: los anticuerpos primarios fueron reemplazados por suero no inmune de conejo o por buffer en improntas y secciones de íleon de cada cerdo. Por otra parte, se incubaron cortes de duodeno, yeyuno e íleon de cerdos del Grupo 1 (Control Negativo) con anticuerpos primarios F4, F5, F6 y F41, siendo procesados en forma idéntica a los inoculados con las diferentes cepas de E. coli.

Interpretación de la Reacción: se consideró inmunorreactividad cuando, en las improntas se observaron más de 10 bacterias con bordes fluorescentes por campo de 40X y cuando en cortes de intestino con crióstato se apreciaron bacterias adheridas al ápex y bordes laterales de las vellosidades (Francis, 1983).

Streptavidina - Biotina Peroxidasa ("Labelled Streptavidin-Biotin") (LSAB): esta técnica se realizó siguiendo el procedimiento de Sternberger (1986) en muestras de duodeno, yeyuno e íleon en la totalidad de los cerditos inoculados experimentalmente.

Fijación de los tejidos: con el fin de evaluar el grado de preservación antigénica de las fimbrias y determinar posteriormente el fijador más adecuado en las etapas posteriores, los tejidos obtenidos fueron fijados en formol tamponado al 10% y en metanol a 4ºC de acuerdo a la técnica de Saint Marie modificada (Rogers, 1985), durante 20-22 horas. Posteriormente las muestras se deshidrataron en cuatro pasajes de alcoholes ascendentes y se aclararon en dos pases en xilol. Luego de dos pasajes en parafina a 60ºC, los tejidos fueron incluidos y cortados en micrótomo de rotación (Jung AG) a 5 µm, montándose en portaobjetos previamente pasados por poly-L-lysina.

Antisueros Primarios: los anticuerpos primarios utilizados corresponden a los descritos en la técnica de IFI. Se realizaron diluciones de 1:1000 para F4, F5 y F6 y de 1:1500 para F41 en Buffer TRIS 0.05M, pH 7.6 más Carrageenan 0.7% (Sigma). Se incluyeron los mismos controles que los utilizados en IFI.

Técnica Utilizada: Streptavidina - Biotina Peroxidasa (LSAB)⁶, de acuerdo a lo especificado por Naish (1989). Los cortes de tejido incluidos en parafina son desparafinados y lavados en buffer TRIS 0.05M, pH 7.6 (Trizma-HCL, Sigma Chemical Co.). Posteriormente, la actividad de la peroxidasa endógena se anuló incubando los tejidos peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos, lavados en agua destilada y colocados en solución buffer TRIS 0.05M, pH 7.6. Se extrajo el exceso de buffer, se incubó con el agente bloqueador de proteínas inespecíficas⁶ por 5 minutos y luego con el anticuerpo primario correspondiente o con el antisuero usado como control negativo, en cámara húmeda y temperatura ambiente durante 2 horas. Posterior a dos lavados en buffer TRIS por 10 minutos, se cubrieron las muestras con el anticuerpo secundario biotinilado, manteniéndose en incubación en cámara húmeda, a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego de dos lavados en buffer TRIS de 10 minutos cada uno, los cortes se cubrieron con streptavidina-peroxidasa y se incubaron durante 30 minutos; posterior a dos lavados en buffer TRIS, se cubrieron con la solución sustrato-cromógeno (3-amino-9-ethilcarbazol AEC) y se incubaron durante 10 minutos. Se realizó tínción de contraste con Hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y se montaron en glicerina Jelly (Luna,1968).

Interpretación de la Reacción: se consideró inmunorreactividad cuando se observaba precipitado de color rojo en los sitios de reacción antígeno-anticuerpo, ápex y bordes de las vellosidades intestinales.

RESULTADOS

Análisis Microbiológico: se realizó aislamiento bacteriológico de E. coli en la totalidad de cerdos inoculados. La identificación de fimbrias mediante Test de Aglutinación se evidenció parcialmente sólo en 3 grupos (cuadro 2).

Grupos Experimentales	Nº de Cerdos	Post-Inoculación
		Aislamiento E.coli	Identificación de Fimbrias*
I	5	5	0
II	5	5	3
III	5	5	3
IV	4	4	0
V	4	4	1
Total	23	23	7

Técnica IHQ Utilizada	Grupos Experimentales					Total de Cerdos con Ag Fimbriales
	I	II	III	IV	V
	(n=5)	(n=5)	(n=5)	(n=4)	(n=4)
IFI impronta	0	3	2	3	3	11
IFI corte crióstato	0	3	3	3	3	12
LSAB formol 10%	0	3	3	3	3	12
LSAB metanol	0	3	3	3	3	12

Segmento Intestinal	Antígenos Fimbriales				Total de Segmentos Intestinales Inmunorreactivos
	F4	F5	F6	F41
Duodeno	3/5	2/5	2/4	1/4	8/18
Yeyuno	3/5	2/5	3/4	3/4	11/18
Ileon	3/5	3/5	3/4	3/4	12/18

De acuercon con el cuadro 5, el Test de Aglutinación no identificó antígenos fimbriales en 5 de los 12 cerdos que se visualizaron mediante IHQ; de dichos animales, 3 correspondieron a cerdos inoculados con cepa de E. coli F6 y 2 con E. coli F41.

En todos los cerdos inoculados con cepas de E. coli se realizó aislamiento bacteriológico del mismo, sin embargo, en algunos de los animales no se identificaron antígenos fimbriales. Al respecto, Evans y col. (1986) y Gyles (1993) hacen mención al hecho que una de las razones por la cual los cerdos inoculados con E. coli no enferman, se debe a la falta de receptores específicos en los enterocitos para las fimbrias o adhesinas colibacilares, las cuales son necesarias para permitir la adhesión, colonización y proliferación de la bacteria. Por otra parte, Isaacson y col. (1977), Duchet-Suchaux y col. (1991) y Seignole y col. (1991) han demostrado que existe resistencia a la colibacilosis en algunas líneas genéticas de cerdos. Los cerditos utilizados en la inoculación experimental provenían de razas híbridas, de tal modo que no es posible obtener conclusiones al respecto.

La IHQ constituye en la actualidad una técnica de gran importancia en biología y es utilizada para realizar diagnósticos rápidos de neoplasias, enfermedades autoinmunes e infecciosas en animales y en el hombre, dado que permite la identificación de antígenos específicos en cortes de tejidos, cultivos celulares e improntas (Roitt y col., 1993).

En el presente estudio, mediante IFI y LSAB se demostraron antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 en duodeno, yeyuno e íleon. La identificación por técnicas IHQ de los antígenos fimbriales mediante IFI ha sido reportada por Morris y col. (1982), Francis (1983) y Fairbrother (1994) y la técnica Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) por Morris y col. (1985) y Rogers (1985). Este último autor ha identificado antígeno F5 en cortes de íleon fijados en metanol e incluidos en parafina (método de Saint Marie modificado), sin embargo, utilizando formol al 10% no identificó dicho antígeno. Este último resultado contrasta con lo obtenido en la presente investigación, en la cual se observó reactividad a antígeno F5 en tejidos fijados en formol al 10% o en metanol por 20-22 horas y embebidos en parafina. Thorns  y Roedor (1988), mencionan que el antígeno F41 es difícil de identificar en cortes de intestino fijados en formol e incluídos en parafina, no así en cortes obtenidos en crióstato, donde sí se ha evidenciado mediante IFI, resultado que también contrasta con lo encontrado en la presente investigación. Al respecto, Sternberger (1986) sugiere que a pesar que el formol tiene un marcado efecto enmascarador de antígenos, el mismo puede ser compensado por el uso de un método IHQ altamente sensible, por lo que se debe considerar la localización del antígeno a fin de evitar posibles problemas.

El método LSAB posee una alta sensibilidad en comparación con el método de Peroxidasa-Antiperoxidasa, siendo de particular aplicación en la localización de antígenos presentes en escasa cantidad y en especial en aquellos tejidos donde la fijación puede reducir la antigenicidad (Elías, 1990). El uso de esta técnica no ha sido comunicada anteriormente en la identificación de antígenos fimbriales de E. coli en el intestino, los resultados obtenidos señalan que el método LSAB es altamente sensible y de gran utilidad.

La IHQ permitió demostrar la presencia de antígeno F4 en los tres segmentos intestinales, en cambio antígenos F5, F6 y F41 se identificaron principalmente en yeyuno e íleon y con menor frecuencia en el duodeno. Idénticas observaciones han sido realizadas por Evans y col. (1986) y Fairbrother (1994) quienes demostraron que E. coli F4 coloniza la totalidad del intestino delgado, mientras que cepas con expresión F5, F6 y F41 colonizan principalmente el segmento posterior del yeyuno e íleon.

El Test de Aglutinación permitió en las cepas de E. coli aisladas, identificar fimbrias F4 y F5 con idéntica sensibilidad que la IHQ, sin embargo, en escasa cantidad al antígeno F41 y no fue posible la observación de F6. Al respecto, Moon y col. (1980) detectaron antígeno fimbrial F6 mediante IFI en íleon de cerdos infectados, no así por aglutinación. Francis (1983) y Evans y col. (1986) compararon el Test de Aglutinación con IFI, observando una menor sensibilidad en el primero, atribuyendo dicha diferencia a que ciertas cepas de E. coli son son incapaces de producir o sintetizar fimbrias bajo determinadas condiciones de cultivo, por otra parte, cuando estas se expresan, pueden ser bloqueadas por excesivo material capsular. Estos mismos autores indican que una ventaja del Test de Aglutinación es que puede emplearse en cultivos de tejidos o material fecal. De igual forma Fairbrother (1994), en un estudio de identificación de factores de virulencia en cepas de E. coli, utilizó IFI para pesquisar el antígeno F6 dado que es de difícil crecimiento en medios de cultivo, necesitando para su desarrollo de condiciones especiales, a diferencia de los antígenos F4 y F5 que se detectan fácilmente mediante aglutinación.

De acuerdo a lo obtenido en el presente estudio, se concluye que el método LSAB en tejidos embebidos en parafina así como la IFI en secciones obtenidas en crióstato, son efectivas para identificar antígenos fimbriales de E. coli, siendo posible su utilización como un método rápido de diagnóstico en cerdos lactantes con cuadro de colibacilosis y en estudios epidemiológicos de diarreas neonatales.

RESUMEN

Con el propósito de evaluar dos técnicas inmunohistoquímicas (IHQ), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (LSAB) para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli y su correlación con el Test de Aglutinación, se realizó una inoculación experimental con cepas enteropatógenas de E. coli que expresaban antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 en cerdos neonatos, los cuales no ingierieron calostro y se mantuvieron aislados de sus madres.

El antígeno F4 se distribuyó en duodeno, yeyuno e íleon, en cambio los antígenos F5, F6 y F41 se visualizaron en íleon y con menor frecuencia en yeyuno y duodeno. El Test de Aglutinación fue eficaz en la identificación de antígenos F4 y F5, no así para F6 y F41.

Los resultados del presente estudio demuestran que tanto LSAB en tejidos embebidos en parafina como IFI en secciones obtenidas en crióstato, son igualmente efectivas para identificar antígenos fimbriales de E. coli y pueden ser utilizadas como un método rápido de diagnóstico en cerdos lactantes con cuadro de colibacilosis y en estudios epidemiológicos de diarreas neonatales.

AGRADECIMIENTO

A la Dra. Evelyn Nistrom, del National Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Ames, Iowa, por colaboración con los anticuerpos primarios utilizados en el presente estudio.
__________________________________________
Aceptado: 05.01.99

* Proyecto FONDECYT 1951150

1 Laboratorio Sanderson S.A, Chile.

2 Laboratorio Chile, Chile.

3 Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias,
Universidad Austral de Chile.

4 Anticuerpos Aglutinantes Fimbrex F4, F5, F6 y F41,
Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Inglaterra.

5 National Animal Disease Center, Agriculture Research
Service, United States Department of Agriculture, Ames,
Iowa.

6 Universal DAKOLSAB, Kit, Peroxidase (DAKOLSAB,
Kit HRP).

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