A study to evaluate the degrees of lesions caused by different enteropathogenic strains of E. coli was carried out. Newborn piglets without calostrum were innoculated with enteropathogenic strains of E. coli which contained F4, F5, F6 and F41 fimbriae in order to characterize the macro and microscopic lesions to the duodenum, jejunum and ilium.

The pigs experimentally innoculated with the four enteropathegenic strains of E. coli presented watery, yellowish diarrhea four hours p.i. The macroscopic lesions were characterized by congestion and abundant liquid content; only the intensity of the lesions among the different innoculated groups was different. Microscopically, the íleon was the most affected segment, presenting congestion, bacteria adhesion, epitelial vacuolization of the intestinal villus, athrophy, neutrophilic infiltration and linfoid necrosis in the Payer plaques, being E. coli F4 that caused the most severe lesions.

These results confirm the importance of antigens fimbrial as adhesion factors on enteropathogenic E. coli in the small intestine of pigs and the actions of another pathogenic factors. Thus, it opens projections for future methologies which, using the antigenic properties of the fimbriae in the elaboration of immunogenes will contribute to control colibacillosis, avoiding the adhesion of enteropathogenic E. coli.

Palabras claves: E. coli , fimbrias, lesiones, cerdos

Key words: E. coli, fimbriae, lesions, pigs.

INTRODUCCION

La colibacilosis de los lechones originada por Escherichia coli se caracteriza por afectar principalmente a cerditos lactantes con una presentación digestiva conocida como Enterotóxica (ETEC) y otra generalizada denominada Septicémica. La virulencia de ETEC está dada por factores de adhesión denominados fimbrias y en parte por la producción de toxinas que estimulan la secreción de electrolitos y agua por la mucosa intestinal (Gyles, 1993). En la cuadro 1 se exponen los serogrupos y factores de virulencia de E coli (ETEC) en diarrea en neonatos y lechones

Fairbrother (1993) y Gyles (1993) mencionan que las fimbrias F4, F5, F6 y F41 juegan un papel fundamental en la adhesión de ETEC a la superficie de la célula epitelial del intestino delgado de cerdos lactantes, con posterior formación de microcolonias ; la asociación ha sido demostrada por numerosos autores ( Arbukle, 1976 ; Francis, 1983 ) así como los segmentos afectados (Fairbrother, 1993) ; sin embargo no han sido evaluado los cambios histológicos producido por cepas de E. coli que presentan diferentes tipos de fimbrias. Al respecto, Hornich y col. (1975), han descripto cambios degenerativos , inflamatorios y necróticos en lámina propia y células epiteliales en intestino de cerditos inoculados con la cepa O101, así como Faubert y Drolet (1992) describen gastroenteritis hemorrágica en lechones y pos-destete con identificación de fimbria F4.

Con la finalidad de mejorar el conocimiento de la patogenia de la colibacilosis en cerdos lactantes, se realizó una inoculación experimental de E. coli F4, F5, F6 y F41 en cerdos neonatos que no ingirieron calostro, evaluándose los aspectos clínicos, daños en la mucosa, respuesta inflamatoria mediada por infiltración leucocitaria y atrofia de vellosidades en el duodeno, yeyuno e ileon. A fin de descartar posibles lesiones de virus patógenos para cerdos lactantes (rota y coronavirus) se remitieron segmentos intestinales al laboratorio de virología para su estudio.

MATERIAL Y METODOS

Animales de experimentación: El material de la presente investigación estuvo constituído por el duodeno, yeyuno e íleon de 25 cerditos, separados de sus madres inmediatamente post nacimiento, evitando la ingestión de calostro y todo contacto con la cerda y medio ambiente.

Cepas de E. coli utilizadas: Las cepas de E. coli F4, F5, F6 y F41 utilizadas forman parte del cepario del Instituto de Microbiología de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Austral de Chile. Dichas cepas se desarrollaron en medio agar CFA (Colonization Factor Antigen) con el propósito de favorecer y estimular la producción de fimbrias siguiendo el procedimiento descrito por Evans y col. (1979).

Los inóculos utilizados se prepararon colocando el cultivo de cada cepa de E. coli en un tubo con medio líquido fresco (10⁸ - 10⁹ bacterias por mililitro), siguiendo el procedimiento descrito por Mc Farland's (Faddin, 1980). Posteriormente, se realizó el Test de Aglutinación con el fin de confirmar la presencia de fimbrias en las cepas de E. coli de cada uno de los inóculos.

Grupos experimentales: Como parte del diseño experimental, se constituyeron cinco grupos de 5 cerdos cada uno, los que se identificaron y colocaron en cajas aisladas (cuadro 2), administrándosele el inóculo a las 6 horas de nacidos. 

Experimental groups of pigs and strains of E. coli used.

Lesiones macroscópicas: Entre las 24 y 36 h.p.i. se realizó eutanasia a la totalidad de los cerditos mediante 1 ml de Tiopental Sódico (Lab. Astorga S.A.) intracardíaco. Con posterioridad, se procedió a efectuar la necropsia según la técnica de Paredes y Cubillos (1995). Las alteraciones macroscópicas observadas en duodeno, yeyuno e íleon fueron protocolizadas evaluándose los siguientes aspectos: grado de grosor de la pared intestinal, presencia de trastornos circulatorios en la mucosa (congestión, hemorragias...) y alteraciones del contenido intestinal, como consistencia (acuosa, mucosa, espumosa), coloración (amarilla, verde, blanco, café...) y cantidad de gas.

Con el propósito de evaluar en mejor forma los grados lesionales macro y microscópicos a nivel intestinal, se utilizó la siguiente pauta (Thrusfield, 1990): 0: asencia de lesiones, 1: lesión leve, 2: lesión moderada, 3: lesión severa.

Estudio histopatológico: Se tomaron secciones de duodeno, yeyuno e íleon de 2.0 a 3.0 cm de longitud, las que fueron fijadas en formalina tamponada al 10 % durante 22 a 24 horas. Los tejidos, se procesaron en autotécnico y se incluyeron en parafina a 60*C. Las muestras se cortaron a 5 micras con micrótomo de rotación y se tiñieron con Hematoxilina - Eosina (Luna, 1968).

De cada segmento intestinal, se realizó descripción de los cambios histológicos presentes en la mucosa, submucosa, muscular y serosa .La determinación de la relación entre la altura de la vellosidad y la profundidad de la cripta se realizó mediante la utilización de un ocular de medición (Carl-Zeiss C8X), registrándose para ello un promedio de 3 mediciones por segmento, según el procedimiento descrito por Hornich y col. (1975). La atrofia se evaluó como leve (Grado 1) cuando la relación Vellosidad:Cripta (V:C) era de 4:1, moderada (Grado 2) cuando la relación era 3:1 y finalmente, como severa (Grado 3) cuando la relación fue de 2:1 o 1:1.Para el análisis de las variables macro y microscópicas se utilizó el método de escalamiento Likert, de acuerdo a Hernández y col. (1993).

Estudio virológico : Se tomó una sección de 10 cm de íleon de cada cerdo y en forma refrigerada se remitieron, en un plazo de 8 hs. al Instituto de Microbiología para diagnóstico de Rota y Coronavirus por técnica de Inmunofluorescencia Indirecta.

RESULTADOS

Cuadro clínico. Grupo I (Control): Los cerdos no presentaron diarrea, manteniéndose activos durante 24 h.p.i.
Grupo II. Tres cerditos, evidenciaron diarrea con heces líquidas y amarillas a partir de las 6 h.p.i., acompañada de debilidad y deshidratación, apreciándose más severa alrededor de las 18 horas. Dos de los animales afectados, fueron sacrificados a las 20 h.p.i. dado su mala condición general, los restantes a las 24 horas.

Grupo III. Tres cerditos, presentaron cuadro diarreico a las 8 h.p.i., con heces líquidas y amarillas. En general, los cerdos inoculados se mostraron activos y con leve deshidratación, sin embargo, a las 24 horas, uno evidenció severa deshidratación y debilidad extrema.

Grupo IV. Tres cerditos cursaron con diarrea a las 6 h.p.i. Los cerditos se mantuvieron activos hasta las 18-20 horas, posteriormente evidenciaron marcada deshidratación y debilidad.

Grupo V. Tres cerditos presentaron diarrea leve a las 10 h.p.i., aumentando en severidad alrededor de las 18 horas. Las heces se observaron de aspecto líquido y color amarillo, al igual que el Grupo IV.

Lesiones macroscópicas : La observación macroscópica de duodeno, yeyuno permitió visualizar en general, alteraciones de caracter leve, apreciándose que las afecciones estaban focalizadas principalmente en mucosa y lumen intestinal. En mucosa se observó congestión, apreciándose diferencias entre los segmentos intestinales, como igualmente, entre los grupos experimentales. El contenido acuoso y amarillo de las heces se apreció como la característica más sobresaliente en todos los grupos y segmentos intestinales. Las lesiones mas significativas se observaron en general en el grupo II. El yeyuno, en los grupos III, IV y V presentó valores superiores en comparación con el duodeno e íleon de los mismos grupo (cuadro 3).

Cuadro 3

Lesiones macroscópicas en duodeno, yeyuno e íleon de cerdos controles e inoculados con cepas de E. coli.

Lesiones  Macroscópicas	Duodeno de Grupos  Experimentales					Yeyuno de Grupos   Experimentales					Ileon de Grupos   Experimentales
	I	II	III	IV	V	I	II	III	IV	V	I	II	III	IV	V
MUCOSA
Congestiva	0,2*	2,0	1,0	1,3	0,8	0,0	1,6	1,2	1,3	0,5	0,2	2,0	1,0	1,3	0,8
CONTENIDO-COLOR
Acuoso	1,0	2,2	1,8	1,5	2,5	1,0	2,0	1,8	2,0	2,5	1,2	2,2	1,8	1,5	2,5
Mucoso	0,6	1,2	0,8	1,3	0,5	0,4	1,2	0,6	1,3	0,8	0,0	1,2	0,8	1,3	0,5
Amarillo	1,4	2,6	1,6	2,0	2,8	1,4	1,8	1,4	2,3	2,8	1,6	2,6	1,6	2,0	2,8
Presencia de gas	0,0	0,0	0,0	0,3	0,0	0,4	0,2	0,4	0,0	0,8	0,0	0,0	0,0	0,3	0,0
SUMA DE PROMEDIOS	3,2	8,0	5,2	6,4	6,6	3,2	6,8	5,4	6,9	7,4	3,0	8,0	5,2	6,4	6,6
PUNTAJE MAXIMO  POSIBLE	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0

*: Promedio de los grados de lesión por afección (0-3).

Lesiones microscópicas : En la cuadro 4, se presentan las lesiones microscópicas observadas en duodeno, yeyuno e íleon, basados en el promedio de los grados de lesión asignados por patología (0-3), para cada grupo.

Lesiones histopatológicas en duodeno, yeyuno e íleon de cerdos controles e inoculados con cepas de E. coli.

Finalmente, del análisis de las lesiones microscópicas, la atrofia constituyó una de las patologías más importantes evidenciada por la alteración en la relación altura de la vellosidad - profundidad de la cripta (V:C), como se puede apreciar en los Gráficos 1, 2 y 3. La misma se observó de forma severa en el duodeno de cerdos del grupo II y más frecuente en el íleon de cerdos de todos los grupos inoculados con cepas de E. coli (gráfico 1, 2 y 3).

DISCUSION

El análisis de los resultados de la inoculación experimental muestra que cepas de E. coli enteropatógenas portadoras de antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 originan en cerdos no inmunes, deshidratación, debilidad y diarrea acuosa de color amarillo entre las 4-6 h.p.i., apreciándose mayor severidad a las 18 ó 20 horas, los cerditos más afectados fueron los inoculados con E. coli F4. Estos resultados son concordantes con los hallazgos efectuados por Hornich y col. (1975) quienes observaron diarrea amarillenta, anorexia y aletargamiento en cerditos inoculados con E. coli O147 F4 y O101 a las 4-6 h.p.i., explicando que la presencia de enterotoxinas producidas por un gran número de cepas de E. coli ocasionan un aumento de la actividad de la adenilciclasa y consecuentemente alteración en el transporte de iones en la membrana de las células epiteliales con secreción de cloruros y sodio, seguida de agua hacia la luz intestinal. De igual forma, Morris y col. (1982) apreciaron diarrea en cerditos sin calostrar infectados experimentalmente con dos cepas de E. coli que expresaban antígenos fimbriales F5 y F6 . En cuanto a las características clínicas presentes en los cerdos en estudio, no se observaron diferencias entre ellas.

La congestión de la mucosa intestinal fue la lesión macroscópica mas significativa, principalmente en el yeyuno e íleon de los cerdos del grupo II, esto debido a que la cepa inoculada presentaba, además de la fimbria F4, un segundo factor de virulencia, la hemolisina. Estos resultados están en concordancia con los hallazgos efectuados por Faubert y Drolet (1992) que describen la congestión de la pared intestinal (principalmente del yeyuno e íleon) en cerditos de 1 a 7 días infectados con cepa O149:K91:F4. De igual forma, Wilson y Francis (1986) observaron una estrecha relación entre los serogrupos O157 y O149 y la producción de hemolisinas.

La presencia de contenido acuoso, amarillo y en algunos casos con gas a nivel intestinal, se observó en grado leve en los cerdos controles; en cambio, en los grupos inoculados fue abundante. Según Wilson y Francis. (1986) y Gyles (1993), la presencia de diferentes toxinas, principalmente STa en cepas de E. coli F4 y LT o LT/STb en E. coli F5, F6 y F41 favorecerían posterior a la adhesión, la secreción de electrolitos y agua, con la consecuente diarrea, al igual que otras toxinas y factores de patogenicidad de cepas enteropatógenas. Cambios similares han sido descritos por Barker y Van Dreumel (1991), Gómez y col. (1994a) y por Fairbrother (1993) en cerdos lactantes con cuadro de colibacilosis.

El examen microscópico de los diferentes segmentos del intestino delgado en los cerdos inoculados experimentalmente no reveló lesiones patognomónicas. Sin embargo, éstas variaron en relación a las cepas de E. coli inoculadas y los segmentos intestinales afectados, observándose lesiones más severas por E. coli F4 y F5 y leves por F6 y F41. E. coli F4 causó congestión, principalmente en el yeyuno e íleon debido a factores propios de patogenicidad que originan la respuesta inflamatoria en la mucosa, a diferencia de lo observado con otras cepas que son responsables de cuadros de congestión leve. Similares observaciones han realizado Kenworthy y Mitchell (1976) con la cepa "Abbotstown", describiendo congestión y marginación neutrofílica en la lámina propia y vellosidades de la mucosa intestinal.

Las presencia de bacterias adheridas a las vellosidades intestinales se observó solo en cerdos inoculados con E. coli. El íleon fue el segmento intestinal en que se apreció el mayor grado de adhesión bacteriana. Estos resultados permiten concluir que como procedimiento en la identificación de E. coli a nivel intestinal, el análisis histológico es un buen método diagnóstico a pesar de las limitaciones propias de ésta técnica, que no permite la identificación del agente, aspecto que puede ser subsanado usando una técnica inmunohistoquímica (Canal, 1997). A este respecto, Acres (1985), también hace mención a la importancia de la histología en el diagnóstico de la colibacilosis enterotóxica.

Otras lesiones microscópicas en los tres segmentos intestinales, fueron la necrosis de las células del ápex de las vellosidades, la presencia de vacuolas intracitoplasmáticas y el infiltrado leucocitario en las vellosidades y lámina propia. A este respecto, Hornich y col. (1975) también describen cambios degenerativos y necróticos en las células epiteliales, además de infiltrado inflamatorio en la lámina propia del intestino de cerditos inoculados con la cepa O101. Si bien es cierto, las lesiones observadas a nivel intestinal fueron de carácter leve, la presencia de necrosis con inflamación y cambios degenerativos vacuolares, son significativos dado que estas alteraciones en su conjunto afectan seriamente los procesos normales de absorción y excreción de agua y electrolitos. El patrón lesional observado es concordante con el visualizado en otras especies animales provocadas por este mismo agente (Acres, 1985).

Las lesiones mas severas en los cerdos inoculados fueron originadas por E. coli F4, las cuales son coincidentes con las descritas por Faubert y Drolet (1992) en lechones con gastroenteritis hemorrágica, quienes apreciaron necrosis de las vellosidades, adhesión bacteriana, congestión, trombosis e infiltrados en la lámina propia. Estos autores señalan, que cepas de E. coli con adhesina F4 y hemolisina serían responsables del daño intestinal debido a la presencia de lipopolisacáridos capsulares que aumentarían la toxicidad de la bacteria. La concordancia de resultados entre la presente investigación y los mencionados por Faubert y Drolet (1992) llevan a concluir que el tipo de respuesta por parte del tracto digestivo en cuadros originados por E. coli es similar entre diferentes cepas, existiendo variaciones en el grado lesional y no en el tipo de respuesta presente.

La atrofia de las vellosidades intestinales se determinó basándose en la relación V:C . Al respecto, Barker y Van Dreumel (1991) señalan que las vellosidades de los cerdos menores de 5 días de edad poseen una altura de 700 a 1200 m m. y una relación V:C entre 7:1 y 9:1. Los cerdos del grupo control tuvieron una relación V:C entre 5:1 y 8:1, por lo que se consideró a relaciones menores de 5:1 como atrofia, las diferencias presentes entre esta investigación y otras es posible que se relacione con diferencias propias entre razas.

La atrofia de las vellosidades se evidenció en los tres segmentos intestinales en cerdos inoculados con E. coli, siendo leve en el íleon y severa en el duodeno de los grupos II y III. Al respecto, Hornich y col. (1975) observaron marcada atrofia principalmente en el íleon y en menor grado en el duodeno y yeyuno de cerdos inoculados con cepa O101 a las 20 h.p.i. y alteraciones leves con la cepa O147:K91:F4. De manera similar, Vijtiuk y col. (1995) describen moderada a severa atrofia en yeyuno e íleon en cerdos de 2 semanas de edad infectados naturalmente con cepa de E. coli 0149:K91:F4. Estos resultados no son totalmente concordantes, con los visualizados en la presente investigación, respecto al segmento afectado ; sin embargo, cabe destacar la importancia de la atrofia en los cerdos del presente estudio, debido a que no solo afecta los mecanismos normales de absorción, sino que se desarrolla en ausencia de rotavirus y coronavirus, importantes agentes responsables de la misma (Johnson y col., 1992 ; Gomez y col., 1994b) . Por otra parte, Barker y Van Dreumel (1991), mencionan que cepas de E. coli enterotóxicas no causan atrofia significativa de las vellosidades y que cuando esta se produce en lechones recién nacidos, está asociada con E. coli enteroinvasiva. De igual forma, esta patología ha sido descrita en terneros con colibacilosis enterotóxica por Acres (1985), quien hace mención a la atrofia de las vellosidades en íleon y yeyuno.

La necrosis leve de las placas de Peyer en el íleon de los cerdos inoculados con E coli no ha sido reportada a la fecha en inoculaciones experimentales con cepas enterotóxicas. Sin embargo, Penrith y col. (1995) en cerdos inoculados con E. coli con factor citotóxico necrotizante (CNF) (identificado mediante pruebas de DNA) evidenciaron necrosis focal de la mucosa y del tejido linfoide del íleon, acompañado de un cuadro septicémico. Por otra parte, en terneros afectados de colibacilosis, Wray y Thomlinson (1974) observaron depleción linfocitaria. La presencia de toxinas de origen proteico en algunas cepas de E. coli aisladas de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y de niños con diarrea aguda han sido relacionadas con el daño presente en el intestino delgado (Pohl y col., 1993).

Las fimbrias F4, F5, F6 y F41 constituyen un importante factor de virulencia de E. coli, ya que permiten la adhesión y colonización de la bacteria a los enterocitos. Sin embargo, las lesiones observadas en la mucosa así como en las placas de Peyer hacen necesario investigar otros factores de patogenicidad como la producción de CNF por parte de cepas enteropatógenas mediante inoculación en cultivos celulares.

Por otra parte, Vijtiuk y col. (1995) en una inoculación experimental de cerdos con una cepa de E. coli no toxigénica lograda por ingeniería genética con plásmido recombinante que codifica antígeno F4, observaron que la misma no ocasionaba daño en la mucosa del intestino delgado, concluyendo que debería ser estudiada en el futuro como una potencial vacuna oral contra la colibacilosis.  

RESUMEN

La presente investigación se realizó con el propósito de evaluar los efectos patológicos de cepas enteropatógenas de E. coli que expresan antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41, administradas oralmente a cerdos neonatos que no ingirieron calostro.

Los cerdos inoculados experimentalmente con las cuatro cepas enteropatógenas de E. coli presentaron diarrea acuosa y de color amarilla a las 4 h.p.i. Las lesiones macroscópicas se caracterizaron por congestión y abundante contenido acuoso, apreciándose diferencias solo en la intensidad lesional entre los diferentes grupos inoculados. Microscópicamente, el íleon fue el segmento más afectado, observándose congestión, adherencia bacteriana, vacuolización epitelial de las vellosidades intestinales, atrofia, infiltrados de neutrófilos y necrosis linfoide en placas de Peyer, siendo la cepa E. coli F4 responsable de las lesiones de mayor severidad.

Los resultados de la presente investigación confirman la importancia de los antígenos fimbriales como factor de adhesión de cepas enteropatógenas de E. coli al intestino delgado de cerdos lactantes y permite proyectar a futuro metodologías que utilicen las propiedades antigénicas de las fimbrias no solo como métodos de diagnóstico sino también en la elaboración de inmunógenos los cuales evitarían la adhesión bacteriana y la presentación de cuadros de colibacilosis, enfermedad responsable de cuantiosas pérdidas económicas en la explotación porcina en la actualidad.
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Aceptado: 13.04.99

* Proyecto FONDECYT 1951150

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de la Dra. Evelyn Nystrom del National Animal Diseases Center, Agricultural Research Service USDA, Ames, USA, por la donación de los anticuerpos fimbriales utilizados en el presente estudio.

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