Instituto de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile, casilla 167, Valdivia, Chile.

SUMMARY

Ninety-three diarrheic fecal samples were obtained from under 20 days-old suckling pigs, and examined by indirect immunofluorescence (IFI) and immunoperoxidase (IPO) using pooled antibodies against F4, F5, F6 and F41 fimbrias from E. coli.

A total of 26 (27,9%) samples were found positives; of these, 12 (12,9%) were positive by IFI, 8 (8, 6 %) by IPO and 6 (6,5%) by both techniquess. The methods employed are easy to carry out with the advantage of a quick and specific diagnosis.

Palabras claves: Cerditos, Diarrea neonatal, Immunoflurescencia, Immunoperoxidasa

Keys words: Piglets, Neonatal diarrhea, Immunoflurescence, Immunoperoxidase.

INTRODUCCION

Escherichia coli enterotóxica (ETEC) requiere de adhesinas, más frecuentemente de las fimbrias F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) y F41, para adherirse a los enterocitos a través de receptores celulares que interactúan en forma específica con ellas, lo que le permite multiplicarse in situ logrando la colonización de la mucosa del intestino delgado (Moon y col., 1980;Wilson y Francis, 1986; Fairbrother, 1993, 1994). Una vez establecida, secreta otros factores de virulencia, generalmente las enterotoxinas ST (termoestable), LT (termolábil) o las verotóxicas (VT), toxinas que tienen diversos mecanismos patogénicos para producir diarrea (Thorns y Roeder, 1988; Takahashi y col., 1990; Shin y col., 1994; Ojeniyi y col., 1994; Mainil y col., 1995). De ahí, que las diarreas neonatales provocadas por ETEC, sean más comunmente confirmadas por la identificación de fimbrias específicas presentes en la superficie de la bacteria (Thorns y col., 1989).

Teniendo presente que la génesis del cuadro diarreico va a depender de la presencia en las fecas de E. coli que exprese estas fimbrias, se consideró de interés detectarlas mediante tinciones inmunoquímicas en muestras fecales.

Se examinaron 93 muestras de fecas correspondientes al total de cerditos lactantes con diarrea de hasta 20 días de edad, provenientes de distintas explotaciones porcinas.

Para la detección directa de cepas de E. coli fimbriada en las muestras fecales, se utilizaron las técnicas de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) e Inmunoperoxidasa (IPO). Para tal efecto, se realizaron frotis con las muestras que se fijaron con acetona en el caso del IFI y con metanol para IPO, en ambos casos durante 10 minutos y se procedió como ha sido descrito anteriormente en el diagnóstico inmunoquímico de otras infecciones (Zamora y col., 1995). En breve, los frotis para IFI se tiñeron de acuerdo a Brandtzaeg (1982), así,después de fijados se hicieron reaccionar las preparaciones microscópicas durante 30 minutos en cámara húmeda con un pool, hecho en nuestro Instituto mezclando en partes iguales anticuerpos monoclonales para F4, F5, F6 y F41 del Central Veterinary Laboratopry, Weybridge, Inglaterra. Después de los lavados con PBS y agua destilada se aplicó IgG antimurino conjugada con isotiocianato de fluoresceína por 30 minutos a temperatura ambiente y en cámara húmeda, para posteriormente leer los frotis con microscopio de inmunofluorescencia. Para las preparaciones IPO se actuó según Taylor (1978). Con este objeto, se hicieron reaccionar previamente con peróxido de hidrógeno al 10% y luego se cubrieron con el mismo pool de antisuero como para IFI en condiciones de humedad y se incubaron a 28ºC por 30 minutos. A continuación se lavó con PBS y se aplicó el substrato preparado con 5 mg de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB), 10 ml de PBS y 100 ml d e H₂O₂ al 10%, incubando los frotis a 28ºC por 30 minutos en cámara húmeda. Después de los lavados, se leyeron los frotis en microscopio de campo claro observando que las cepas positivas estaban rodeadas de un color café. Tanto para IFI como para IPO se prepararon controles positivos y negativos con cultivos de cepas productoras de las 4 fimbrias y otras que no expresaban ninguna de estas adhesinas. Con la finalidad de determinar la eventual existencia de diferencia estadísticamente significativa, entre ambas técnicas, se empleó dócima X².

RESULTADOS

Se pesquisaron 26 (27,9%) muestra fecales positivas a E. coli con fimbrias, tal como se resume en el cuadro 1.

Las muestras que reaccionaron en un porcentaje menor correspondieron a animales de hasta una semana de edad, lo que se resume en el cuadro 2.

La prueba de contraste de Z indica que ambas técnicas no muestran diferencias significativas a la detección de muestras positivas.

En 26 (27,9%) muestras de fecas diarreicas se pudo constatar cepas de E. coli con fimbrias, siendo superior IFI respecto de IPO, ya que la primera detectó18 (19,4%) muestras con cepas productoras de algún tipo de fimbrias (F4, F5, F6 y/o F41), mientras que con IPO sólo se pesquisaron en 14 (15,1%) muestras (cuadro 1), pero sin diferencia estadísticamente significativa. No obstante, en virtud que en solo 6 muestras hubo coincidencia en los dos métodos, se concluye que es conveniente emplear ambas técnicas para tener una mayor seguridad cuando se pretende diagnosticar una colibacteriosis intestinal.

Evans y col. (1986) emplearon la técnica IFI contra las fimbrias F4, F5 y F6 en cortes histológicos de la mucosa intestinal del íleon de cerditos neonatos muertos con cuadros diarreicos y concluyeron que la técnica usada fue un método rápido y efectivo para el diagnóstico de la enfermedad intestinal causada por E. coli fimbriadas en cerdo. Más aun, sostienen que la tinción inmunoquímica es superior a los diagnósticos serológicos de las cepas aisladas, aseveración con la cual se condice en virtud que no todas las cepas de E. coli son capaces de expresar la síntesis de fimbrias en medios de cultivos artificiales, a lo que se debe sumar que a veces no se replica la colonia que realmente es la causa de la enfermedad, en cambio la histología detecta las cepas adheridas a los enterocitos. A una conclusión semejante llega Francis (1983), quien incluso pesquisa las cepas con fimbrias no sólo en cortes histológicos sino que también en improntes de la mucosa del íleon. En cuanto a la IPO, cabe mencionar que Morris y col. (1985), logran excelentes resultados con anticuerpo monoclonal F5, situación que confirma Canal (1997) con esa y los otros tipos clásicos de fimbrias, tanto con el empleo de IPO como de IFI.

En algunas ocasiones surgen discrepancias entre el diagnóstico logrado con IFI o IPO y el resultado de los cultivos microbianos en cuanto al tipo de fimbrias que poseen las cepas infectantes. Esto se puede deber a diversos factores, como por ej. que las fimbrias se expresan mejor in vivo que in vitro dependiendo de los medios de cultivo y de las condiciones de incubación que pueden optimizar o dificultar la producción de fimbrias, sin olvidar que la eventual presencia de cápsulas en algunas cepas puede obstaculizar la detección de estas adhesinas en las pruebas de aglutinación. A su vez, los cambios intestinales postmorten pueden afectar la detección por tinción inmunoquímica de improntes, a lo que se debe añadir que la síntesis de más de un tipo de fimbria en una misma célula bacteria puede afectar tanto estas tinciones como a las pruebas serológicas (Wilson y Francis,1986).

En el presente estudio se trabajó con animales vivos y las técnicas inmunoquímicas se aplicaron directamente con las fecas logrando detectar cepas de E. coli con fimbrias, lo que permite llegar a la misma conclusión que los autores anteriormente mencionados, aunque es posible que la cantidad de microorganismos liberados en las fecas sea inferior al que se pesquisa en cortes histológicos o improntes de la mucosa intestinal. Con todo constituye una ventaja en cuanto a la rapidez del diagnóstico, lo que permite conocer el problema oportunamente.

En atención a que se trabajó con un pool de antisueros no se pudo precisar el tipo exacto de fimbrias en las cepas, lo que no se puede solucionar teniendo presente la edad de los lechones, a pesar que Francis (1982) menciona que la F4 afecta más frecuentemente a los animales destetados. No obstante, Gajecki (1990) informan que cepas de E. coli F4 están adheridas a enterocitos en cerditos de hasta 3 días de edad y también a partir de la tercera semana de vida hasta los 4 meses de edad, en cambio las cepas F6 las encuentran en lechones desde de los 7 días en adelante y más frecuentemente en la tercera y cuarta semana de vida. Otros investigadores publican resultados disímiles referidos a la edad de los cerditos y el tipo de cepas fimbriadas que los afectaban ( Evans y col., 1986; Wilson y Francis, 1986; Garabal y col. 1997). Por tanto, de acuerdo a esas publicaciones no es dable sostener con seguridad que tipo de cepas con fimbrias estaría afectando a los animales examinados en el presente estudio (cuadro 2), ya que se trabajó con el pool de antisueros de cepas de E. coli fimbriadas más frecuentemente asociadas a las diarreas neonatales que expresan las 4 adhesinas empleadas, mientras que E. coli relacionada con las diarreas del destete producen generalmente las adhesinas F4, F107, F2134 y F 8813 (Mainil y col., 1995). A pesar de ello, es necesario destacar que en la presente investigación los lactantes entre 8 y 14 días de vida fueron los más frecuentemente afectados (cuadro 2).

Como corolario final se puede concluir que los tests de inmunoperoxidasa o inmnufluorescencia utilizados directamente en fecas, constituyen un método de diagnóstico específico del todo conveniente por la rapidez con que se obtienen los resultados, aunque al emplear un pool de antisueros no se puede precisar la etiología exacta de la colibacteriosis, a no ser que se usen los antisueros por separado. No obstante, el diagnóstico se puede completar con cultivo y obtener posteriormente la información del tipo de fimbrias presentes, conocimiento imprescindible para prevenir específicamente la infección por el empleo de la vacuna adecuada.
 
RESUMEN

Resultaron positivas un total de 26 (27,9%) muestras, 12 (12,9%) de las cuales se pesquisaron únicamente por IFI y por IPO 8 (8,6%), siendo coincidentes ambas técnicas solamente en 6 (6,5%) muestras. El método empleado es de fácil realización y tiene la ventaja de lograr un diagnóstico rápido y específico con el consecuente beneficio.
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Aceptado: 13.04.99.

¹ Proyectos FONDECYT 1951150 y DID UACH PEF
97-12

BIBLIOGRAFIA

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