Role of insectivorous bats in the transmission of Rabies in Chile

SUMMARY

The importance of wild animals in the epidemiology of rabies in Chile was not recognized until 1985. Since then the epidemiology of rabies has been characterized by the presence of an endemic cycle in the species of the Order Chiroptera. In 1996, after 24 years without human rabies cases, a child died of the disease. The victim was infected with an antigenic variant 4 (AgV4) virus whose reservoir is the non-hematophagous bats Tadarida brasiliensis. This event emphatized the need for a better characterization of rabies selvatic cycles, their geographical distribution, and the risk factors that influence the virus transmission to humans and domestic animals in the country.

From a total of 250 isolates obtained between 1977 and 1997, 119 were reactived. These samples were antigenically characterized by the indirect inmunofluorescence technique using a panel of 8 monoclonal antibodies direct against epitopes of the viral nucleoprotein produced by the Centers of Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA. The analysis showed that all the viruses obtained from non-hematophagous bats were AgV4 seven out of 10 canine isolates were AgV4. The other 3 canine viruses were AgV1, whose reservoir is the dog. Of the 3 bovine isolates, 2 was AgV1 and 1 AgV4. Three feline and one porcine viruses was caracterized as AgV4. It was determined that a bovine rabies case reported in 1977 and all the viruses isolated from domestic animals since 1990 were AgV4.

These results allowed to conclude that, in Chile, the non-hematophagous bats Tadarida brasiliensis was a rabies selvatic reservoir before 1985, and since then it has been the only wild reservoir know responsible for rabies sporadic cases in human and domestic animals.

Palabras claves: Anticuerpos monoclonales, Variantes antigénicas, Rabia.

Key Words: Monoclonal Anbitodies, Antigenic Variant, Rabies.

INTRODUCCION

La rabia en América Latina se presenta en sus dos ciclos epidemiológicos, el urbano y el silvestre. El perro es el reservorio y transmisor del ciclo urbano y los reservorios más importantes del ciclo silvestre son el murciélago vampiro Desmodus rotundus,y la mangosta Herpestes auropucntatus (WHO, 1992).

En Chile la rabia urbana fue endémica entre los años 1950 y 1960, registrándose numerosos casos humanos y animales durante dicho período. Esto llevó a la instauración en 1960 de un programa de control y prevención de la rabia en el país. Este programa fue orientado a tres importantes objetivos: primero, reducir la población canina; segundo inmunizar masivamente a los perros y finalmente aumentar la cobertura del diagnóstico de rabia, tanto en animales sospechosos como a través de la vigilancia epidemiológica activa. (Favi y Catalán, 1986) La efectividad de las medidas adoptadas se hizo evidente a partir de 1962, al producirse una disminución drástica de los casos de rabia, y detectándose casos humanos hasta el año 1972 (Favi y Durán, 1991).

Desde el año 1980 se presentaron casos de rabia en forma esporádica en animales domésticos sin que su fuente de infección pudiera ser identificada. Estos casos tuvieron la particularidad de ser de bajo poder epidémico, presentándose incluso un silencio epidemiológico en los años 1982 y 1984. Este cuadro epidemiológico sugirió que la fuente de infección en estos eventos podía ser de origen silvestre (Nieto, 1985).

La importancia de los animales silvestres en la transmisión de la rabia fue reconocida en Chile en 1985, cuando se detectó por primera vez rabia en murciélagos insectívoros de la especie Tadarida brasiliensis (Favi y Catalán, 1986; Nuñez y col., 1987). Hasta ese momento todas las acciones del Programa de Control y Prevención de Rabia estaban focalizadas sobre las especies domésticas, principalmente sobre los perros, existiendo un total desconocimiento de la presencia de la rabia en la fauna silvestre. El reconocimiento de los murciélagos como reservorios de la enfermedad en Chile hizo que se ampliaran las acciones de vigilancia epidemiológica hacia esas especies. A partir de entonces el patrón epidemiológico de la rabia en Chile se ha caracterizado por una endemia en quirópteros. La importancia de esta nueva situación epidemiológica alcanza su mayor relevancia en el país al reportarse el primer caso humano después de 24 años. Este ocurre en un niño de siete años de edad, sin antecedentes de mordeduras o exposición al virus, sospechándose de un murciélago no hematófago como su fuente de infección (Favi y Ramírez, 1996).

El primer caso de rabia en murciélagos no hematófagos fue reportado en Estados Unidos en 1953 (Scatterday y Galton, 1954; Venters y cols.,1954). En este país, 30 de las 39 especies presentes, están infectadas con el virus rábico y 21 de los 36 casos humanos registrados, entre 1981 y octubre de 1997, fueron debidos a variantes virales circulando en murciélagos no hematófagos (Constantine 1979; Krebs y col., 1996). Estas variantes fueron diferenciadas a través de su caracterización antigénica y genética (Smith, 1989; Smith y col.,1995). Se demostró que en este país, la especie migratoria Tadarida brasiliensis mantiene un ciclo endémico independiente, cuya variante viral es diferente a la VAg4 que circula en Chile (Smith, 1989; Díaz y col., 1994).

La caracterización de aislamientos por anticuerpos monoclonales es un elemento de apoyo muy valioso a los sistemas de vigilancia epidemiológica de la enfermedad. Esta caracterización ayuda a identificar las especies reservorias presentes en una determinada área geográfica, a elaborar estrategias de control y prevención más eficientes y a mejorar el monitoreo de los programas de control correspondientes (Smith, 1989).

El objetivo del presente trabajo fue caracterizar antigénicamente los aislamientos del virus rábico efectuados en el Centro Nacional de Referencia de Rabia del Instituto de Salud Pública de Chile, desde 1977, hasta abril de 1997 con el fin de lograr un mejor entendimiento de la epidemiología de la rabia silvestre en murciélagos no hematófagos en Chile.

MATERIALES Y METODOS

Reactivación de las muestras. Un total de 250 muestras con diagnóstico previo positivo al virus de la rabia, obtenidas entre 1977 y abril de 1997, y mantenidas en congelación a -70°C, fueron inoculadas en ratones lactantes con el fin de ser reactivadas (Koprowsky, 1976) y para que el antígeno rábico se encuentre presente en el 75% al 100% de los campos microscópicos, a ser observados por la técnica de inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos monoclonales (Smith y col., 1986). Diez microlitros de una suspensión al 20% en PBS de cada una de ellas fue inoculada intracerebralmente en un grupo de 10 ratones lactantes (Albino swiss) de uno a tres días de edad. Los animales fueron observados diariamente por un período de 28 días. A partir del quinto día post-inoculación un animal de cada grupo fue sacrificado diariamente, sus cerebros extraídos e improntas de los mismos observadas por la técnica de inmunofluorescencia directa para determinar la presencia de antígeno rábico y así ser consideradas reactivadas (Larghi,1975; Dean y col., 1996).

Caracterización antigénica. Las muestras reactivadas fueron analizadas por la técnica de inmunofluorescencia indirecta (Smith y col., 1989; Smith, 1988). En esta caracterización se incluyó, también, la muestra humana obtenida en 1996, cuya reactivación no fue necesaria.

Para la tipificación antigénica se utilizó un panel reducido de anticuerpos monoclonales producidos contra la ribonucleoproteína viral reconocido por el Consorcio Institucional Multinacional Subregional de Laboratorios de Referencia para el diagnóstico y caracterización de variantes de virus rábico en América Latina, y producido por el Centers for Disease Control and Prevention de Atlanta, Georgia, Estados Unidos. La reactividad de estos anticuerpos monoclonales para muestras del virus rábico obtenidas en América Latina fue determinada en estudios previos (Díaz y col., 1994; De Mattos y col., 1996). El cuadro 1 muestra el panel de anticuerpos monoclonales utilizados.

CUADRO 1. Patrones de reacción de las diferentes variantes antigénicas con los anticuerpos monoclonales. Reaction patterns of different antigenic variants to monoclonal antibodies.
	C1	C4	C9	C10	C12	C15	C18	C19	AgV
CVS/ERA-SAD/PAST	+	+	+	+	+	+	+	+	Lab
Perro/mangosta	+	+	+	+	+	+	-	+	1
Perro	+	+	-	+	+	+	-	+	2
Desmodus rotundus	-	+	+	+	+	-	-	+	3
Tadarida brasiliensis	-	+	+	+	+	-	-	-	4
Desmodus rotundus	-	+	v	+	+	v	-	v	5
Lasiurus cinerius	v	+	+	+	+	-	-	-	6
Zorro de Arizona	+	+	+	-	+	+	-	+	7
Zorrillo Centro/Sur	-	+	+	+	+	+	+	+	8
Tadarida brasiliensis	+	+	+	+	+	-	-	-	9

RESULTADOS

De las 250 muestras iniciales, sólo 119 pudieron ser reactivadas y éstas junto con la muestra del caso humano fueron analizadas antigénicamente. El cuadro 2 muestra la especie y la región geográfica de origen de las muestras reactivadas, el número de las mismas por especie y el año de aislamiento.

Sobre la base de la reacción con el panel de anticuerpos monoclonales, se identificaron 2 patrones antigénicos: VAg1 (canina) y VAg4 (Tadarida brasiliensis). La VAg1 se observó en cuatro aislamientos. Tres en perros, en los años 1977, 1981 y 1990, respectivamente, y un caso en bovino de la Región Metropolitana en 1983. La VAg4 se observó en los 115 aislamientos restantes; 102 fueron aislamientos efectuados a partir de murciélagos de la especie Tadarida brasiliensis en las regiones IV a la X y en la Región Metropolitana, y 17 fueron virus rábicos obtenidos de 3 bovinos, 3 felinos, 10 caninos y 1 porcino en las regiones IX, V, X, I y Región Metropolitana (cuadro 2).

DISCUSION

La caracterización antigénica de 119 aislamientos del virus rábico obtenidos de diferentes especies animales y un humano en Chile entre 1977 y 1997 confirmó que actualmente la especie Tadarida brasiliensis es el reservorio más importante de la rabia en los centros urbanos y rurales del país. La relevancia de los murciélagos no hematófagos en la epidemiología de la rabia en los centros urbanos de América del Sur ha sido sugerida previamente (Lord, 1976; De Mattos y cols., 1996). Las características poblacionales y de diversidad de estas especies en América Latina hacen que su infección con el virus rábico, aún con una baja incidencia, sea una fuente de infección muy importante para los humanos y animales domésticos (Lord, 1976; De Mattos y cols., 1996).

El control de la rabia urbana permite que se haga evidente la presencia de ciclos silvestres en áreas geográficas donde previamente eran inadvertidos (Ruíz y Arambulo III, 1994). Esta situación es la que actualmente caracteriza el cuadro epidemiológico en Chile, donde, según nuestros datos aquí lo demuestran, el último caso producido por la variante VAg1 se registra en un perro en el año 1990, después de que el único caso de variante Vag1 se presentó en 1983 en un bovino. Esto indica la interrupción de la circulación de la variante canina desde esta fecha hasta abril de 1997.

En el período 1985-1997 se registra un promedio anual de 25 casos de rabia en quirópteros, reportándose también casos esporádicos en animales domésticos y el caso humano en 1996 (Favi y Ramírez,1996). La caracterización antigénica del aislamiento humano como VAg4 indica que la fuente de infección fue un Tadarida brasiliensis. Este evento epidemiológico es similar a numerosos casos de rabia humana ocurridos en Estados Unidos durante las últimas dos décadas. En algunos casos, asociados a variantes virales circulantes en poblaciones de murciélagos no hematófagos. Tampoco se pudo determinar la forma de exposición al virus o comprobar historia alguna de mordedura (Krebs y cols.. 1996; Weekly Epidemiological, 1997). Nuestros hallazgos demuestran la necesidad de disponer de la tecnología adecuada que permita determinar con la mayor resolución posible el origen de la fuente de infección en cuadros epidemiológicos complejos y caracterizar las variantes del virus rábico circulando en distintas zonas geográficas de Chile.

En relación a la distribución geográfica de los casos de rabia en murciélago en Chile (Mapa 1, 2 y 3), el primero se detectó en la Región Metropolitana en el año 1985, seguido a la brevedad por la aparición de nuevos casos en las regiones V, hacia el norte y VI, VII y VIII hacia el sur entre los años 1985 y 1995. En 1996 se amplía esta distribución con la detección de casos en la IV región después de más de 20 años de silencio epidemiológico en la zona. En el año 1997, la distribución geográfica de las VAg4 se extiende a las regiones III y X, con el aislamiento del virus a partir de un murciélago y un gato doméstico respectivamente. En este mismo año se reporta un caso de rabia en un perro en la ciudad de Arica (I Región), donde no se presentaban casos desde el año 1986. En esta zona se realiza vigilancia epidemiológica exclusivamente en animales domésticos, con vacunaciones antirrábicas masivas una vez al año en perros y gatos. En circunstancias como esta, la correcta y pronta identificación de la variante antigénica implicada, y en algunos casos su caracterización genética, permiten la pronta definición del cuadro epidemiológico que, a su vez, se traduce inmediatamente en medidas de vigilancia epidemiológica y control más eficaces.

Mapa 1. Distribución de variantes antigénicas en cepas reactivadas de virus rábico.

Distribution of antigenic patterns in reactivated strains of rabies virus.
Chile 1977 - 1983.

Mapa 2. Distribución de variantes antigénicas en cepas reactivadas de virus rábico.

Distribution of antigenic patterns in reactivated strains of rabies virus.
Chile 1985-1990.

Mapa 3. Distribución de variantes antigénicas en cepas reactivadas de virus rábico.

Distribution of antigenic patterns in reactivated strains of rabies virus.
Chile 1991 - 1997.

La distribución geográfica de los casos coincide con la del murciélago insectívoro Tadarida brasiliensis que abarca desde la zona desértica de Tarapacá hasta la región de los bosques lluviosos de la ciudad de Valdivia, demostrando su extraordinaria capacidad de adaptación frente a las más variadas condiciones climáticas (Redford y Eiseberg, 1992; Mann, 1978). Aparentemente estos animales migran estacionalmente y comúnmente se refugian en edificios y cavidades naturales (Redford y Eiseberg, 1992).

Además del Tadarida brasiliensis, existen en Chile al menos 8 especies de murciélagos no hematófagos distribuidos del norte al sur del país, entre ellas se encuentra el Lasiurus cinereus y el Lasiurus borealis (Mann, 1978), dos especies identificadas como reservorios de la rabia en otros países (Redford y Eiseberg, 1992).

Esto sugiere la posible presencia de otros ciclos endémicos silvestres en otras especies de quirópteros manteniendo otras variantes virales en el país.

Dada la posible complejidad del ciclo silvestre de la rabia en Chile, que ya ha cobrado una vida humana en uno de sus centros urbanos más importantes, es imperioso continuar con la caracterización antigénica y genética de las variantes existentes en conjunción con los programas de vigilancia epidemiológica en todas aquellas regiones donde existan posibles reservorios.

Los murciélagos por sus hábitos antropofílicos representan un riesgo para el hombre, por lo cual es también necesario intensificar la educación de la población en relación a su comportamiento frente a estos animales para su propia protección y para la conservación de estas especies quirópteras de enorme valor ecológico.

RESUMEN

La importancia de los animales silvestres en la trasmisión de la rabia en Chile no fue reconocida hasta 1985. A partir de entonces el patrón epidemiológico de la rabia se ha caracterizado por una endemia en quirópteros.

En el año 1996, después de 24 años sin registrarse casos de rabia en humanos, se reporta un caso en un niño infectado con la variante antigénica 4 (VAg4), cuyo reservorio es el murciélago no hematófago Tadarida brasiliensis. Esta situación determinó la necesidad de identificar con mayor precisión los ciclos silvestres del virus rábico, su dispersión territorial y los factores de riesgo que condicionan su trasmisión en el país.

De un total de 250 cepas aisladas entre los años 1977 y 1997 se reactivaron 119. Estas fueron analizadas por la técnica de inmunofluorescencia indirecta con un panel de ocho anticuerpos monoclonales producido por el Centers for Disease Control and Prevention en Atlanta, Georgia, Estados Unidos.

El análisis determinó que todos los virus de murciélagos pertenecen a la variante antigénica 4 (VAg4). De los 10 aislamientos caninos, siete corresponden a la VAg4 y tres a la VAg1, cuyo reservorio es el perro. De los aislamientos de bovinos uno fue VAg1 y dos VAg4 y aquellos de tres felinos y un porcino también fueron VAg4. Se determinó que un caso bovino reportado en 1977 y los virus aislados de animales domésticos desde 1990 corresponden a la Variante 4.

Estos resultados permiten concluir que, en Chile los murciélagos no hematófagos han actuado como reservorio de la rabia silvestre con anterioridad a 1985 y que posteriormente a este año son los únicos reservorios, conocidos hasta el momento, que han originado casos esporádicos de rabia en el hombre y los animales domésticos.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al personal del Laboratorio de Diagnóstico de Rabia del Instituto de Salud Pública de Chile, especialmente a la Sra. Cristina Toledo y Sra. Beatriz Sanhueza por su valiosa colaboración

Aceptado: 04.05.99.

REFERENCIAS

CONSTANTINE, D. G. 1979. An undated list of rabies infected bats in North America, J. Wild Dis. 15: 347 - 349.

DEAN, JJ., M. K. ABELSTH, P. ATANASIU. 1996. The fluorescent antibody test. /In Laboratory Techniques in Rabies (4th ed.), Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowsky, H. (eds.). World Health Organization, Geneve, pp. 86 -96.

De MATTOS, C.A., C.C. De MATTOS, J.S. SMITH, E.T. MILLER, S. PAPO, A. UTRERA, B. I. OSBURN. 1996. Genetic characterization of rabies field isolates from Venezuela, J. Clin. Microbiol. 34: 1553 - 1558.

DIAZ, A.M., S. PAPO, A. RODRIGUEZ, J.S. SMITH. 1994. Antigenic analysis of rabies virus isolated from Latin America and the Caribbean, Zentralbl. Veterinaer med Reihe B 41: 153 - 160.

FAVI, M.; R. CATALAN. 1986. Rabia en murciélagos en Chile, Av. Cs. Vet. 1: 73-76.

FAVI, M., J. C. DURAN. 1991. Epidemiología de la rabia en Chile (1929 - 1988) y perpectivas en mamíferos silvestres, Av. Cs. Vet. 6: 13 - 21.

FAVI, M., E. RAMIREZ. 1996. Rabia humana en Chile. Laboratorio al día. Instituto de Salud Pública de Chile, Vol. XII N° 2, pp 7.

FAVI, M., V. YUNG, C. PAVLETIC. 1997. Programa de vigilancia de rabia. Laboratorio al día, Instituto de Salud Pública de Chile, Vol. XIII N° 1, p 18.

KREBS, J.W., J.S. SMITH, C.E. RUPPRECHT, J.E. CHILDS. 1996. Rabies Surveillance in the US during 1966, JAVMA. 211:1525 - 1539.

KOPROWSKY, H. 1976. Prueba de inoculación en ratón. En: La Rabia. Técnica de Laboratorio. (3ª ed.) Kaplan, M.N; Koprowsky, H. Ginebra, OMS., pp 88- 97.

LARGHI, O.P. 1975. Anticuerpos fluorescentes para rabia. Centro Panamericano de Zoonosis (Buenos Aires). Oficina Sanitaria Panamericana (Nota técnica N° 8).

LORD. R. 1976. Importancia de los murciélagos en la epidemiología de las zoonosis con énfasis en la rabia bovina. Publ. Cient. Org. Panam. Salud. 334: 89-97 .

MANN, G. 1978. Los pequeños mamíferos de Chile, Gayana Zoología 40: 40 - 105. Universidad de Concepción, Chile.

NIETO, D.A. 1985. Antecedentes sobre rabia silvestre en la comunidad de Pirque. Tesis.Santiago, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad de Chile.

NUÑEZ,S.F., M. FAVI, V.S. URCELAY, C. SEPULVEDA, G.F. FABREGA. 1987. Rabia silvestre en murciélagos insectívoros en Chile, Bol. Of. Sanit. Panam.103(2):140-145 (English traslation in Wild. Dis. Rev. VI(2): 88-93.

REDFORD K.H., J.F. EISENBERG. 1992. Orden quiroptera. In Mamals of the Neurotropics.The Southern cone . The University of Chicago Press, Chicago, London. Vol. 2, Chapter 4, pp 69-133.

RUIZ A., P. ARAMBULO III. 1994. Program for the elimination of rabies in Latin America. 131 AVMA Annual Meeting, San Francisco, July 9-13.

SMITH J.S., F.R. REID-SANDEN. L.F. ROUMILLAT, C. TRIMARCHI, A. CLARK, G.M. BAER, W.G. WINKLER. 1986. Demostration of antigenic variation among rabies virus isolated by using monoclonal antibodies to nucleocapsid proteins, J. Clin. Microbiol. 24 : 573-580.

SMITH J.S. 1988. Monoclonal Antibody Studies in insectivorous bats of the United States, Rev. Infect. Dis. 10 (Sppl. 4): 5637-5643.

SMITH J.S., L.A. ORCIARI, P.A. YAGER. 1995. Molecular epidemiology of rabies in the United States, Seminars in Virol. 6: 387-400.

SMITH J.S. 1989. Rabies virus epitope variation use in ecologic studies, Adv. Vi. Res. 36: 215-253.

SCATTERDAY J.E., M.M. GALTON. 1954. Bat rabies in Florida; Vet. Med. 49:133.

VENTERS H.D., W.R. HOFFERT, J.E. SCATTERDAY, A. V. HARDY. 1954. Rabies in bats in Florida, Am. J. Public. Health 44: 182.

WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL REPORT. 1997. Human rabies,Kentucky and Montana, 1996, N°29, julio.

WHO. 1992. Expert Commitee on Rabies, Eigth Report. WHO Technical Report Series 824, Geneva.