DLAIKAN, H., M.V.; HERNANDEZ, A., M.V., M.Sc., Ph.D.; CORTES, A., M.V.

Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Bogotá. Colombia.

In order to evaluate possible morphological modifications during implantation in the cow, histological studies of the uterine lining epithelium and the trophoblast were carried out in 8 heifers (2 per gestational stage) at 21, 23, 28 and 36 days of gestation. Ten samples were taken from each uterus, and stained for light microscopical evaluation. Embryo location was assessed by direct observation on days 23, 28 and 36 of pregnancy.

All embryos were located caudal to the mid uterine region. The more relevant changes were: 1) modification of the uterine lining epithelium (from a columnar or seudostratified columnar epithelium, to a cuboidal and later to a flattened simple epithelium with sincitia). 2) The development of the trophoblast (change from a simple cuboidal epithelium to a two-layered cuboidal or columnar one). These modifications are initiated near the embryo to spread peripherally afterwards, but they do not appear to be the same in all regions of the uterus or the conceptus. Likewise, they are not seen in a similar extent in conceptuses of the same age. A developed trophoblast is typical of a viable conceptus, but a more precise change of implantation is the presence of a flattened uterine lining epithelium. Implantation in the cow occurs similar to sheep, although somewhat slower. The modulation of trophoblast development could be due genetic programming and/or to paracrine or autocrine secretions such as growth factors.

Key words: cow, implantation, uterus, trophoblast, placenta.

Palabras claves: vaca, implantación, útero, trofoblasto, placenta.

INTRODUCCION

La mortalidad embrionaria afecta considerablemente la eficiencia reproductiva en vacunos. Una parte importante de la pérdida de embriones sucede durante la implantación (Brijaldo y col., 1982; Sreenan y Diskin, 1986).

Aún no está claro si existen períodos de mayor o menor vulnerabilidad del conceptus, ni se conocen completamente las características anatómicas que permitan diferenciar los embriones viables de los de dudosa viabilidad.

En la oveja, la implantación es un fenómeno lento y gradual, en comparación con lo que sucede en especies (por ejemplo primates y roedores) en las cuales hay un contacto íntimo entre el trofoblasto y los tejidos maternos (Hernández, 1971; Gaviria y Hernández, 1994; Guillomot, 1995). La estructura histológica del trofoblasto cambia entre los 14 y los 17 días de gestación, de un epitelio simple cúbico a uno biseriado cuboidal. Al comienzo de la implantación, el epitelio de revestimiento del útero se modifica; pasa de cilíndrico simple o seudoestratificado (típico de lo observado durante el ciclo estral) a un tejido simple cúbico y posteriormente simple plano (Gaviria y Hernández, 1994).

Existen evidencias (en observaciones hechas en especímenes de edad gestacional superior a los 27 días) de que en la vaca podría darse un tipo de implantación con características similares a las observadas en la oveja (Hernández, 1975; Jiménez y Hernández, 1982). Sin embargo, no aparecen en la literatura estudios cronológicos acerca de los posibles cambios histológicos del trofoblasto y epitelio uterino durante la implantación temprana en la vaca.

El presente trabajo tuvo como objetivo describir el desarrollo trofoblástico y la modificación del epitelio uterino a los 21, 23, 28 y 36 días de gestación en la vaca.

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron 8 hembras bovinas de la raza Holstein Friesian, entre los 17 y los 20 meses de edad, dos por cada una de las siguientes edades de gestación: 21, 23, 28 y 36 días.

Los animales fueron mantenidos en semiestabulación, bajo condiciones adecuadas de nutrición (pasto cortado, suplementación con concentrado comercial y sal y agua a voluntad) y manejo. Los signos de estro fueron detectados con una hembra androgenizada provista con un chaleco marcador, además de la observación de cada animal, tres veces diarias. Se realizó monta directa, con un macho de la raza Normando.

El diagnóstico de la gestación se llevó a cabo por observación del retorno o no al estro y mediante el cálculo de los niveles de progesterona en el suero. Para esto último, se tomaron muestras de sangre de la vena yugular, los días 5, 10, 15, 17, 19 y 21 (día 0= presentación de calor) para las gestaciones de 21 días. Para las de 23, el mismo esquema, añadiendo el día del sacrificio. Para las de 28 días, se tomaron muestras en los mismos días usados para las gestaciones de 23 días. Para las preñeces de 36 días, se tomaron muestras en los mismos días de las gestaciones de 28 días, añadiendo una toma el día 25.

Los animales fueron sacrificados, mediante sangría por sección de las venas yugulares y carótidas, previa insensibilización. Inmediatamente después del sacrificio, se removó el tracto genital, el cual fue fijado con glutaraldehído tamponado al 2%. A continuación, se hizo postfijación por inmersón con solución tamponada de formalina al 10%. En cada cuerno uterino se establecieron 5 puntos equidistantes, comenzando desde la extremidad útero-tubárica hasta el cuerpo del útero. Así, el punto más cercano a la unión útero-tubárica se identificó como el número 1 y el más próximo al cuerpo del útero, como el 5. En cada punto de divisón se realizaron cortes transversales, de los cuales se obtuvieron, para colorear con Hematoxilina y Eosina, secciones de 5 micrómetros de grosor previamente incluídas en parafina, mediante procedimientos estándar. Posteriormente se analizó, en toda el área ocupada por cada corte, el porcentaje de desarrollo trofoblástico (T) y el de la modificación del epitelio uterino (MEU). Para este efecto, se midó la longitud del corte y en base a ella se establecó que porcentaje de la misma estaba ocupada por trofoblasto desarrollado o por un epitelio uterino modificado (cúbico o cilíndrico).

Lo anterior se llevó a cabo utilizando un equipo computarizado para análisis de imágenes (LECO 2000, USA), utilizando la función de medición directa, debidamente calibrada para uso con el objetivo de 40X. El epitelio corónico de dos o más capas celulares fue considerado como un trofoblasto desarrollado. El útero de un bovino no gestante con actividad ovárica normal está recubierto de un epitelio que varía entre cilíndrico simple y seudoestratificado (Priedkalns, 1976), de tal manera que la presencia de un epitelio de otro tipo, fue tomado como modificación.

Además se determinó el sitio preferencial de ubicación de los embriones mediante observación directa, en las preñeces de 23, 28 y 36 días. A los resultados obtenidos se les aplicaron cálculos de estadística descriptiva.

RESULTADOS Y DISCUSION

En todas las edades de gestación estudiadas, T fue mayor en los cortes del cuerno gestante al cuerpo lúteo que en los del no gestante. También hubo variación en cuanto al T entre casos de la misma edad. Con el avance de la gestación, T aumenta (ver figuras 1 y 2). Sin embargo, en uno de los casos de 28 días de gestación, el valor de T fue inferior al obtenido en todas las otras edades gestacionales (cuadro 1).

La MEU se hace de manera gradual. Inicialmente, el epitelio de revestimiento del útero, seudoestratificado o simple cilíndrico, similar al de animales no gestantes (figura 2), comienza a transformarse en algunos sitios, en un epitelio de tipo cúbico (cuadro 4). Posteriormente, cambia a un tejido simple plano, con formación de sincitios en algunas zonas (cuadro 5, figura 1). El epitelio de revestimiento del útero modificado, siempre se observó en contacto con un trofoblasto desarrollado (figura 1). Los cambios se inician en el cuerno gestante al cuerpo lúteo, predomi-nantemente en las zonas centrales y posteriores del mismo y luego se extienden al cuerno no gestante. Existen variaciones individuales en relación con MEU. A medida que avanza la gestación, puede observarse un aumento en MEU, pues el porcentaje de epitelio plano es mayor a los 36 días que a las demás edades estudiadas (cuadro 2).

Figura 1. Trofoblasto desarrollado en contacto con el epitelio de revestimiento endometrial modificado (entre las flechas) en una zona del placentoma en la vaca, a los 28 días de gestación. Aumento original 150X. Developed trophoblast in contact with a modified lining uterine epithelium (arrows) in a placentome. Twenty eigh days of gestation in the cow. (Original magnification 150X).

Figura 2. Trofoblasto no desarrollado en contacto con el epitelio de revestimiento endometrial sin modificación (entre las flechas) en una zona del placentoma en la vaca, a los 28 días de gestación. Aumento original 1000X. Non-developed trophoblast in contact with an unmodified lining uterine epithelium (arrows) in a placentome. Twenty eight days of gestation in the cow. (Original magnification 1000X).

Los mayores valores de T se encuentran en las zonas posteriores del cuerno uterino gestante (cuadro 3; cortes I3, I4 e I5), con excepción del caso 4 de 21 días de edad, donde el mayor valor de T se obtuvo en el corte más cercano a la unión útero-tubárica.

CUADRO 3. Porcentaje de desarrollo trofoblástico en diferentes zonas del conceptus bovino en 4 edades de la gestación. Percentage of trophoblastic development in different zones of the bovine conceptus at 4 different stages of gestation.
	Cuerno gestante **						Cuerno no gestante **
Caso	EG*	I1	I2	I3	I4	I5	C1	C2	C3	C4	C5
4	21	92	60	56	17	0	0	0	32	7	0
5	21	15	58	100	36	60	5	73	20	60	10
8	23	86	90	100	100e	100e	0	0	90	75	33
11	23	0	13	75	73	96e	0	0	0	10	73
1	28	0	0	0	100e	0e	0	0	0	5	0
10	28	0	100	100	100e	100e	0	0	0	0	0
2	36	0	0	100e	100e	100	0	0	7	27	93
3	36	100	100	100	100e	100	0	0	100	100	83
* EG= edad gestacional (en días). e = corte cerca al cual estaba ubicado el embrión. ** I1 y C1 corresponden a los cortes de las zonas más cercanas a la unión útero-tubárica; I5 y C5, a los de las regiones más próximas al cuerpo del útero.

CUADRO 4. Porcentaje de epitelio de revestimiento, de tipo simple cúbico, en diferentes zonas del útero bovino, en 4 edades de gestación. Percentage of cuboidal uterine lining epithelium in different zones in the bovine uterus, at 4 different stages of gestation.
	Cuerno gestante **						Cuerno no gestante **
Caso	EG*	I1	I2	I3	I4	I5	C1	C2	C3	C4	C5
4	21	92	60	56	8	0	0	0	36	7	0
5	21	15	58	96	60	60	5	73	2	60	10
8	23	100	100	60	87e	10e	0	0	90	75	53
11	23	0	13	80	78	88e	0	0	0	10	74
1	28	0	80	0	3e	0e	0	0	10	5	0
10	28	0	88	90	98e	5e	0	0	0	0	0
2	36	0	0	40e	3e	0	0	0	70	20	90
3	36	30	0	10	0e	0	0	0	100	100	100
* EG= edad gestacional (en días). e = corte cerca al cual estaba ubicado el embrión. ** I1 y C1 corresponden a los cortes de las zonas más cercanas a la unión útero-tubárica; I5 y C5, a los de las regiones más próximas al cuerpo del útero.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede inferir que el proceso de la implantación en la vaca, es similar al correspondiente en la oveja, iniciándose en las zonas cercanas al embrión para luego extenderse a las áreas periféricas del cuerno gestante y luego al no gestante. En la oveja, en el lapso de 10 días (entre los 14 y 24 de la gestación) en preñeces únicas, el epitelio uterino ha sido modificado casi en su totalidad (Gaviria y Hernández, 1994). En el período de 17 días que cubre el presente estudio, la modificación aludida no se produjo totalmente, lo cual estaría indicando un proceso de implantación más lento en la vaca que en la oveja.

La amplia variación en cuanto al grado de desarrollo del trofoblasto y de la modificación del epitelio uterino observada, puede implicar la presencia de importantes diferencias, que podrían constituir marcadores genéticos válidos de mayor o menor supervivencia de los embriones. O por otro lado, la existencia de microambientes uterinos más o menos propicios para el desarrollo del conceptus y el éxito de la implantación.

El desarrollo del epitelio trofoblástico (paso de epitelio simple cúbico a biseriado cúbico o cilíndrico) parece ser un requisito para que se inicie la modificación del epitelio uterino. Esto puede depender de programaciones genéticas del conceptus, o de las secreciones del útero o el mismo trofoblasto. Hay varios estudios que indican que el útero secreta los factores de crecimiento insulínico 1 y 2 (Geisert y col., 1991; Simmen y col., 1993) y el factor epidérmico de crecimiento (Gharib-Hamrouche y col., 1993), los cuales podrían influir en el desarrollo del conceptus. Ello implicaría que dichos factores se elaboran y/o actúan de manera preferencial en las cercanías del embrión. Sin embargo, el desarrollo trofoblástico, no parece ser el único requisito para que haya modificación del epitelio uterino, pues aún cuando el grado de desarrollo del trofoblasto sea alto, no siempre corresponde a un elevado porcentaje de epitelio modificado, como se observó en el presente estudio a los 23 (caso 8) y a los 28 (caso 10) días de gestación.

Un trofoblasto conformado por un epitelio simple cúbico o aplanado, podría ser tomado como característico de conceptus de dudosa viabilidad (Boshier, 1968). Sin embargo, de acuerdo con los hallazgos del presente estudio y lo encontrado previamente en la oveja (Hernández, 1971; Gaviria y Hernández, 1994), según el sitio de muestreo, aun en conceptus viables se puede encontrar normalmente un trofoblasto como el descrito. Por lo tanto, en las evaluaciones postmortem de viabilidad de los conceptus, este aspecto debe tenerse en cuenta. Asimismo, según lo observado, el desarrollo del trofoblasto parece ser un requisito indispensable para que se den los cambios iniciales propios de la implantación (verbigracia modificación del epitelio uterino). Por ende, el desarrollo del trofoblasto, o sea la presencia de un trofoblasto conformado por epitelio cúbico o cilíndrico biseriado, puede tomarse como un elemento más de evaluación de la viabilidad del conceptus en bovinos, de igual manera como sucede en la oveja (Gaviria y Hernández, 1994), en adición al criterio histológico del número de células binucleadas (Boshier, 1968) y al de la presencia de vasos sanguíneos en las membranas embrionarias (Hernández, 1971). Sin embargo, el grado de modificación del epitelio de revestimiento del endometrio, parece ser un cambio más confiable para evaluar el nivel de éxito del proceso de la implantación, tanto en la vaca como en la oveja. Esto puede ser de particular interés cuando no se disponga de cortes de alantocorón, ya que a partir de cortes de tejido endometrial podría evaluarse el grado de implantación y de acuerdo con la extensón de los mismos, su expansón. Según los resultados obtenidos en el presente estudio, hasta los 36 días de la gestación, el cuerno no gestante, aún no ha participado en la implantación del conceptus. Cabe anotar, en este contexto, que es posible que la porción alantocorónica que ocupa el cuerno no gestante, haya sufrido el proceso necrobótico, pues de acuerdo con un estudio previo, en la vaca se inicia, aproximadamente a los 28 días de gestación (Hernández, 1975).

RESUMEN

Para evaluar las modificaciones morfológicas durante la implantación en la vaca, se llevó a cabo un estudio histomorfométrico del epitelio de revestimiento del útero y del trofoblasto en 8 novillas a los 21, 23, 28 y 36 días de gestación. Se utilizaron 10 cortes realizados en puntos equidistantes de cada cuerno uterino. En las tres últimas edades de gestación, se determinó la ubicación del embrión, por observación directa.

Todos los embriones fueron encontrados en la mitad posterior del cuerno gestante. Los cambios más relevantes encontrados se refieren a: 1) la modificación del epitelio de revestimiento del útero (cambio de un epitelio cilíndrico simple o seudoestratificado a uno cúbico simple y posteriormente a uno de tipo plano simple con formación de sincitios), y 2) el desarrollo trofoblástico (paso de un epitelio cúbico simple a uno biseriado cúbico o cilíndrico). Ellos se hacen evidentes a medida que avanza la gestación, pero no se llevan a cabo uniformemente en todas las regiones del útero o del conceptus, ni suceden con dinámica similar en los conceptus de la misma edad gestacional. Se inician en las cercanías del embrión, para extenderse periféricamente. Un trofoblasto biseriado cúbico o cilíndrico, es típico de un conceptus viable, pero el cambio más significativo de la implantación, es la presencia de un epitelio uterino de revestimiento modificado (simple plano con sincitios). La implantación en la vaca es un proceso similar al informado previamente en la oveja, aunque aparentemente más lento. La modulación de los cambios sufridos por el trofoblasto, puede deberse a programaciones genéticas del conceptus o a la secreción de factores de crecimiento secretados por la madre y/o el conceptus.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue auspiciado por la Universidad Nacional y Colciencias. Los autores expresan su gratitud al Dr. Carlos Sánchez por su apoyo en el procesamiento del material fotográfico.

Aceptado: 11.05.99.

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