ARTICULOS ORIGINALES

Características histoquímicas, morfométricas y metabólicas del músculo Gluteus medius de equinos entrenados para competencias de salto^*

Histochemical, morphometrical and metabolic characteristics of the Gluteus medius muscle from horses in training for jumping competition

A. Islas¹, MV, MS; M. Quezada¹, MV, Dr.Met.Vet; A. Bernales², MV; G. Mora¹, MV, MS ;
J.L. López-Rivero³, MV, Dr. Med. Vet.; V. Merino¹, BQ, MS; P. Dossow, MV; V. Rojas, MV; L. Marín¹, TM.

¹ Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Concepción, Casilla 537, Chillán, Chile.
² Escuela de Equitación de Carabineros "Oscar Cristi Gallo", Santiago, Chile.
³ Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba, España.

SUMMARY

Biopsies were taken at a depth of 3 and 6 cm from the Gluteus medius muscle of 7 mares and 3 castrated male horses. The animals were 4 years old and submitted to a previous specific training program for jumping during 6 months. The samples were analysed by the mATPase miofibrillar technique to determine the fibrillar composition, and by the NADH-TR technique to determine the oxidative capacity of the fibres. In addition, the fibre metabolic activity was determined by enzyme activities of the citrate synthetase (CS), 3-OH-acil CoA dehydrogenase (HAD), lactic dehydrogenase (LDH) and creatinkinase (CK).

The averages obtained for the fibrillar composition were 14, 28, 41 and 17% at 3 cm depth and 25, 30, 34 and 10% at 6 cm depth for oxidative type I, IIA, IIB and non oxidative IIB fibres, respectively. The fibrillar composition varied in relation to the depth of the biopsy. Type l and type II B fibre percentages showed significant differences between 3 and 6 cm. Type IIA fibres were similar in percentage at both depths whilst, oxidative and non oxidative fibres type IIB showed a statistically significant difference in percentage of fibrillar composition at both biopsy depths. The area of the muscle fibres at 3cm depth was 2191; 3466 and 5578 mm² for fibres type l, IIA and IIB, respectively and the lesser diameters were 19; 24 and 30 for fibres type l, IIA and IIB, respectively. The area of the fibres at 6 cm depth was 2433; 3929 y 5558 mm² and the lesser diameters were 20; 25 y 30 for fibres I, IIA and IIB, respectively.

The activity of CS, HAD, LDH, and CK enzymes was 817, 243, 1.20 and 1.80 U/mg protein at 3 cm depth and 1479, 542, 1.58 and 3.30 at 6 cm depth. The activities of CS and HAD enzymes were significantly different between depths during the training period.

These results show that the training produced changes in the fibrillar composition and metabolic capacity of the Gluteus medius in horses prepared for jumping competition.

Significant differences were obtained in the fibrillar composition and enzymatic activities when comparing pre-training and post-training data.

Palabras claves: equino de salto, músculo, histoquímica, bioquímica.

Key words: muscle, histochemistry, biochemistry, jumping horses.

INTRODUCCION

La técnica de biopsia muscular y los análisis histoquímicos y bioquímicos han aumentado el conocimiento de los efectos de la edad, sexo y entrenamiento sobre las características del músculo Gluteus medius en diferentes razas de equinos (Lindholm y Piehl, 1974; Snow, 1983; Ronéus y col., 1992; Islas y col.,1996).

La composición fibrilar se ha determinado usando la técnica de miosina ATPasa (mATPasa) (Brooke y Kaiser, 1970), encontrándose en los equinos adultos fibras tipo I, IIA y IIB, las cuales varían en su frecuencia relativa, abastecimiento capilar y tamaño al aumentar la profundidad de la biopsia y el entrenamiento (Kline y col., 1987; López-Rivero y col., 1992). El músculo Gluteus medius se caracteriza por presentar en sus zonas más profundas, un mayor porcentaje de fibras tipo I y un metabolismo aeróbico, mientras que en las regiones más superficiales un alto porcentaje de fibras tipo IIA oxidativas y tipo IIB con capacidad oxidativa y no oxidativa (Kline y col.,1987; López-Rivero y col., 1993; Islas y col., 1996), que pueden ser modificadas por efecto del entrenamiento (Essén -Gustavsson y col., 1984).

La capacidad oxidativa es importante para los músculos esqueléticos por su influencia en la respuesta metabólica al ejercicio. El caballo tiene una alta capacidad oxidativa si se compara con otros animales y el hombre (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985). La evaluación de la capacidad oxidativa puede realizarse a través de las tinciones histoquímicas con nicotinamida tetrazolium reductasa (NADH-TR) (Lindhom y Piehl, 1984; Hodgson y col., 1985) y con succinato deshidrogenasa (Snow, 1983) o a través de la determinación de algunas actividades enzimáticas en el músculo completo, tales como la citrato sintetasa (CS), succinato deshidrogenasa (SDH) (Guy y Snow, 1977) y 3-OH-acil Co A deshidrogenasa (HAD) (Essén-Gustavsson y col., 1980) Estas actividades enzimáticas aumentan por efecto del entrenamiento y la profundidad de la biopsia (López, J. F., 1995; Islas y col., 1997).

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de un programa de adiestramiento sobre la composición fibrilar, diámetro menor, área y

capacidad metabólica del músculo Gluteus medius en equinos debutantes para competencias de salto. Los resultados se comparan con los valores obtenidos en el grupo previo al entrenamiento.

MATERIAL Y METODOS

En el estudio se emplearon 10 equinos mestizos adiestrados durante 6 meses para participar en competencias de salto para categorías debutantes (7 yeguas y 3 machos castrados), 50% fina sangre inglés de carrera (FSI) y 50% Hackney, categoría debutantes, clínicamente sanos, de 4 - 5 años de edad, pertenecientes a la Escuela de Equitación "Oscar Cristi Gallo" de Carabineros de Chile (Santiago). Los caballos habían realizado durante 6 meses un programa específico de entrenamiento para competencias de salto según la pauta de la Escuela de Equitación (Vigil, 1996), que tiene por objetivo desarrollar habilidades, destrezas de salto y capacidad física de los equinos. Se adjunta resumen del programa de entrenamiento. (Anexo 1).

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvieron 2 biopsias musculares a 3 y 6 cm de profundidad a través de la misma incisión. Las biopsias fueron tomadas con una aguja percutánea de 6 mm de diámetro interno (Henckel, 1983) de acuerdo al procedimiento descrito por Mora y col. (1995) y por Islas y col. (1997).

Una vez obtenidas las muestras, una parte fue inmediatamente congelada en nitrógeno líquido para realizar los análisis bioquímicos, mientras que aquellas para análisis histoquímico fueron colocadas sobre placas de poliestireno, bañadas en OCT para congelación de tejidos (Tissue Tek, Miles Sci., USA) y luego sumergidas durante 30 segundos en Isopentano (2-metilbutano Lab. Merck) enfriado previamente en nitrógeno líquido (Dubowitz, 1985). Las biopsias fueron almacenadas en un termo de nitrógeno a una temperatura de -196°C hasta su posterior procesamiento. Para disminuir la alteración que sufre el tamaño fibrilar debido a la contracción que experimentan las muestras obtenidas con aguja de biopsia, se dejó transcurrir 2 a 3 minutos desde la obtención hasta su congelación (López-Rivero y col., 1993a).

Métodos histoquímicos. De cada muestra se obtuvieron cortes seriados en un criostato (Microm HM 500) a -20°C, de 10 mm de grosor que fueron incubados para demostrar la actividad mATPasa (E:C:3.6.1.3.) a pH 9.4 tras preincubación ácida. La capacidad oxidativa de las fibras se evaluó en cortes seriados teñidos mediante NADH-TR (E.C. 1.6.99.3), para cada profundidad de biopsia (Dubowitz, 1985).

Según los patrones de tinción de mATPasa las fibras fueron clasificadas como tipo I (contracción lenta) o tipo IIA y tipo IIB (contracción rápida) (Brooke y Kaiser, 1970). Las fibras tipo IIB de acuerdo a la intensidad de la tinción con NADH-TR se clasificaron en oxidativas y no oxidativas.

Composición fibrilar. Se determinó la proporción de cada tipo de fibra muscular del tejido obtenido a las dos profundidades de las biopsias. Un área representativa de cada biopsia conteniendo al menos 200 fibras fue examinada sistemáticamente en las microfotografías en blanco y negro (x100) de los cortes teñidos con mATPasa.

Para obtener los porcentajes y tamaño fibrilar se examinó un área representativa de cada biopsia y se determinaron las frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB. Los tipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculadas sobre las microfotografías en blanco y negro (X100) en los cortes teñidos con NADH-TR, mediante el cómputo de 200 fibras /biopsia.

Morfometría. El área transversal y el diámetro mínimo de los tipos de fibras se obtuvo sobre microfotografías procesadas con un sistema de imagen en un programa morfométrico computacional (Imago, Grupo SIBA, Universidad de Córdoba España). Sólo se midieron las fibras de las biopsias con bordes celulares nítidos y localizadas en la zona central. De cada muestra se midió un mínimo de 25 fibras de cada tipo, obteniéndose el área y diámetro mínimo (Dubowitz, 1985).

Análisis bioquímico. 50 mg de tejido muscular libre de tejido conectivo y adiposo fue lavado en tampón fosfato (PBS) pH 7,3 en frío, centrifugado tres veces a 1000 g por 10 minutos en una centrífuga Sorvall R-C-5B para eliminar la sangre. El sedimento obtenido se solubilizó en 5 ml de PBS, y se homogenizó en un triturador ultra turrax T-25 a 8000 rpm, posteriormente se sometió a un sonicador Trassonic C-460 por 30 segundos y luego se centrifugó a 7000g durante una hora a 4C. En el sobrenadante se determinaron las enzimas deshidrogenasa láctica (LDH) (EC 1.1.1.28), creatinquinasa (CK) (EC 2.7.3.2.), citrato sintetasa (CS) (EC 4.1.3.7.) y 3- OH-acil-CoA dehidrogenasa (HAD).

Las actividades de las enzimas CK y LDH se determinaron midiendo la variación de absorvancia a 365 nm de NADPH y NADH por minuto, respectivamente, utilizando reactivos comerciales (Laboratorio Boehringer, Mannheim, kits N 1087592 y N 1087533). La actividad CS se detectó según el método descrito por Alp y col., (1976) y la HAD por el método de Kline y Bechtel (1987).

Las proteínas se determinaron por el método de Lowry y col. (1951), usando seroalbúmina de bovino como estándar. Todas las determinaciones espectrofotométricas se realizaron en un equipo Shimadzu UV-120-02 a 25C.

Análisis estadístico. Los resultados se expresaron en porcentaje y se aplicaron pruebas estadísticas convencionales para obtener la media y desviación estándar de cada variable. Las diferencias entre las profundidades de muestreo fueron valoradas por medio de una prueba "t" de Student para observaciones pareadas y un análisis de varianza.

Los resultados se compararon con los valores obtenidos en el mismo grupo, previo al entrenamiento, a través de un análisis de varianza, considerándose la edad, entrenamiento y profundidad de la biopsia sobre la composición fibrilar y actividad de las enzimas evaluadoras del metabolismo muscular.

RESULTADOS

El estudio histoquímico realizado permitió determinar la composición fibrilar del músculo Gluteus medius de los equinos de salto debutantes.

Los tipos de fibras observadas en función de la profundidad pre y post-entrenamiento se presentan en el cuadro 1.

Se observa que los porcentajes de fibras tipo IIA no tienen variación ni en la profundidad ni en relación al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo I varió significativamente en profundidad, pero no en relación al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo IIB varió significativamente tanto en relación a la profundidad como al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo IIB oxidativas varió en relación al entrenamiento, pero no a la profundidad, y el porcentaje de fibras tipo IIB no oxidativas no varió en relación a la profundidad en el pre-entrenamiento pero sí en el entrenamiento (cuadro 1).

CUADRO 1. Tipos de fibra presentados como porcentajes (%) en el músculo Gluteus medius de equinos pre-entrenamiento y post-entrenamiento (promedios y desviación estándar).

El estudio de la actividad de las enzimas citrato sintetasa, 3-OH acil coA deshidrogenasa, deshidrogenasa láctica y creatin fosfoquinasa determinó diferencias significativas en la actividad de las enzimas CS y HAD por efecto de la profundidad y el entrenamiento.

La enzima LDH no presentó diferencias significativas por efecto de la profundidad y el entrenamiento. La enzima CK no presenta diferencias significativas por efecto de la profundidad de la muestra, observándose una disminución de ella por efecto de entrenamiento.

El analisis de varianza determinó que no se producen variaciones en los parámetros estudiados por efecto de la edad, observándose variaciones significativas en la actividad de las enzimas evaluadoras del metabolismo oxidativo por efecto del entrenamiento y la profundidad de la biopsia y en el porcentaje de las fibras tipo IIB oxidativas por efecto del entrenamiento.

CUADRO 2. Areas (µm²) y diámetro menor (µm) de las fibras del músculo Gluteus medius en equinos pre-entrenamiento (Islas y col., 1998) y post-entrenamiento (promedio y desviación estándar).

Area mm² and lesser diameter (µm²) of Gluteus medius muscle fibre in horse before and after training (mean and standar deviation).

CUADRO 3. Actividad de las enzimas citrato sintetasa (CS), 3 OH ACIL Co A deshidrogenasa (HAD), deshidrogenasa láctica (LDH) y creatin fosfoquinasa (CK) (U/mg proteína) en músculo Gluteus medius de equinos antes del entrenamiento y después del entrenamiento (promedio y desviación estándar).

Activity of citrate syntase (CS), 3 OH ACYL Co A dehidrogenase (HAD), lactic dehidrogenase (LDH) and creatine inase (CK) (U/mg protein) in Gluteus medius muscle in horses before training and after training (meand and standard desviation).

Al comparar los resultados de esta investigación con un estudio preliminar realizado en estos equinos, previo al programa de adiestramiento (Islas y col., 1998), se observó un aumento de las fibras tipo IIB oxidativas, lo que indica que el adiestramiento produce cambios en las características fibrilares del grupo en estudio, observándose un mayor desarrollo muscular que se corrobora por el aumento del tamaño de las fibras tipo IIB y concuerda con los estudios que han demostrado que el entrenamiento en esta especie produce una hipertrofia de las fibras musculares (Serrano y López-Rivero, 1996), no observándose efecto de la edad sobre la composición fibrilar (p>0,05).

El área y diámetro de las fibras son similares a los obtenidos por otras razas (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; López-Rivero y col., 1993a; Ronéus, 1992). Las fibras de menor tamaño y diámetro tienen un mejor abastecimiento de capilares, lo que permite una mejor irrigación y más difusión de oxígeno y sustratos a la célula y al mismo tiempo realizan una mejor eliminación de los productos del metabolismo de ellas (Essén-Gustavsson y col., 1989).

Asociado a los cambios en la composición fibrilar, estudios realizados por Ronéus y col. (1992) demuestran que el ejercicio produce cambios metabólicos en la fibra muscular. En este estudio, se observó un aumento de las actividades enzimáticas del metabolismo oxidativo por efecto del entrenamiento (p<0,05), lo que muestra que el músculo Gluteus medius es muy activo y adaptable al ejercicio y concuerda con trabajos anteriores que han demostrado que una adaptación muscular al ejercicio se traduce en un aumento de la capacidad oxidativa de las fibras (Valberg y col., 1998; Hodgson y col., 1985).

Las actividades de LDH y CK no aumentaron por efecto del adiestramiento, al comparar estos resultados con los obtenidos previos al entrenamiento (cuadro 3), lo que indicaría que el metabolismo anaeróbico de los carbohidratos no es una fuente importante de energía para estos animales durante el adiestramiento. Es probable que tanto la oxidación del piruvato obtenido por la vía glicolítica como la de los ácidos grasos sea más eficiente durante el adiestramiento, lo que explicaría la disminución de LDH, estos resultados son concordantes con los obtenidos por Hodgson y col. (1985) en caballos sometidos a ejercicio en "treadmill".

Los resultados obtenidos en esta investigación indican que el músculo Gluteus medius de estos equinos presentan cambios en sus características fibrilares y actividad metabólica, como causa del adiestramiento.

RESUMEN

Se obtuvieron biopsias a 3 y 6 cm de profundidad del músculo de 7 yeguas y 3 machos castrados de 4 años de edad, los cuales habían realizado previamente un programa de adiestramiento para salto por 6 meses. Las muestras fueron analizadas por las técnicas mATPasa miofibrilar, para determinar la composición fibrilar, y NADH-TR para determinar la capacidad oxidativa. La actividad metabólica de las fibras se determinó por la actividad de las enzimas CS, HAD, LDH y CK.

Los promedios obtenidos para la composición fibrilar fueron de 14, 28, 41 y 17% a 3 cm y 25, 30, 34 y 10% a 6 cm de profundidad para las fibras tipo I, IIA, IIB oxidativas y IIB no oxidativas respectivamente. Al analizar el factor profundidad de la biopsia se encontraron diferencias estadísticamente significativas, específicamente para las fibras tipo I y IIB, mientras que las tipo IIA mantuvieron valores similares. El tamaño de las fibras fue de 2191±624, 3466±840 y 5578±1439 mm² a los 3 cm de profundidad y 243, 3929 y 5558 mm² a los 6 cm de profundidad para las fibras tipo I, IIA y IIB, respectivamente. El diámetro menor fue de 19; 24 y 30 a 3 cm de profundidad y 20, 25 y 30 para las fibras tipo I,IIA y IIB a 6 cm de profundidad.

La actividad de las enzimas CS, HAD, LDH y CK fueron 817, 243, 1,2 y 1,8 U/mg de proteínas a 3 cm de profundidad y 1479, 542, 1,58 y 3,30 a 6 cm de profundidad, existiendo diferencias significativas para las enzimas CS y HAD entre las dos profundidades durante el período de adiestramiento.

Los resultados indican que el adiestramiento produce cambios en la composición fibrilar y capacidad metabólica del músculo Gluteus medius en equinos preparados para competencias de salto.

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Aceptado: 20.04.2000.

*Financiado por Proyecto 96.151.004-1.2, Dirección de Investigación, Universidad de Concepción.

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