Gestación con embriones producidos in vitro a partir de ovocitos recuperados de vacas ovariectomizadas

Grupo de Biotecnología de la Reproducción, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria,
EEA Balcarce, C.C. 276 (7620) Balcarce, Argentina.

The objectives of this work were to evaluate the efficiency of in vitro production (IVP) of embryos from ovariectomized cows and the pregnancy rate of transferred frozen-thawed embryos. One hundred and twenty Argentine-Holland cows were ovariectomized in 6 sessions by using the effeminator by vaginal via. The ovaries were transported at 18-22°C into saline solution supplemented with antibiotics during 6 h and processed whitin of 11 h since the first ovary obtained. Cumulus-oocytes complexes (COCs) were aspirated from small antral follicles (2-8 mm in diameter). The COCs were matured in TCM 199 plus 10% oestrus cow serum for 22 h. Following maturation the oocytes were fertilised with frozen-thawed semen in TALP medium and cultured in CR1aa medium. At Day 7 and 8 after fertilisation, good quality blastocysts and expanded blastocysts were equilibrated in 1.5 M ethylene glycol. Two embryos were loaded into 0.25 ml straws and frozen. The embryos were thawed and directly transferred into the recipients. A total 57 dairy heifer was used as recipients. Pregnancy diagnosis was performed by rectal palpation 55 d after embryo transfer.

The efficiency of IVP technology was 9.5 oocytes and 2.7 embryos per ovary. The overall pregnancy rate was 31.5%. A higher pregnancy rate (P<0.05) was obtained for Day-7 (35.5%) versus Day-8 (16.6%) IVF embryos. It can be concluded from the results that a culled cow could produce 0.82 additional pregnancy after application of this technology. These data demonstrate that IVP embryos originating from ovaries of ovariectomized cows is a good alternative to preserve genetic resources and for commercial purposes.

El nacimiento del primer ternero producto de la fecundación in vitro (FIV) fue anunciado por Brackett y col. (1982), en este estudio se utilizó semen fresco y el embrión resultante (estadio de 2 a 4 células) fue transferido al oviducto de la hembra receptora. Extensa literatura científica ha sido publicada hasta la actualidad con el objeto de mejorar la técnica de producción in vitro (PIV) de embriones y la viabilidad in vivo de los mismos. Desde 1992, esta tecnología fue aplicada en forma exitosa a programas comerciales de mejoramiento genético (Hasler, 1993).

La obtención de ovocitos para FIV puede realizarse en el animal vivo a través de la aspiración folicular guiada por ultrasonografía (ovum pick-up), mediante laparoscopía u ovariectomía.

En Argentina, alrededor de 200.000 vacas de alto valor genético para producción de leche y carne son faenadas anualmente debido a que finalizan su ciclo productivo. La recuperación de sus gametos es una alternativa para preservar y potenciar una fuente genética utilizando tecnología in vitro de embriones. La PIV de embriones de hembras faenadas presenta las ventajas de la sencillez y economía de la obtención de los ovarios. Sin embargo, la falta de una adecuada identificación durante el desposte puede conducir a errores en la identidad. La falta de cuidado en la separación de los genitales de la carcasa puede aumentar el riesgo de contaminación de la superficie ovárica y por lo tanto de los ovocitos durante el cultivo posterior. En cambio, la obtención de los ovarios por medio de la ovariectomía presenta condiciones más higiénicas y mayor confiabilidad en la identificación con respecto a la recuperación en el matadero.

Los objetivos del presente trabajo fueron: evaluar la eficiencia en la PIV de embriones a partir de ovocitos de vacas de rechazo ovariectomizadas y determinar la tasa de preñez de esos embriones descongelados de 7 y 8 días de edad, después de la transferencia directa a vacas receptoras.

Ovariectomía y transporte de ovarios. Ciento veinte vacas Holando-Argentino de alta producción ( 8.000 litros/lactancia), ubicadas entre 500 y 650 km del Laboratorio de PIV de embriones, fueron utilizadas para este ensayo. Se realizaron 6 sesiones de ovariectomía de 18-25 vacas por sesión. La ovariectomía se realizó por vía transvaginal utilizando un bisturí de Dutto (Laboratorio Dutto, Uruguay) y un dilatador vaginal. Una vez realizada la colpotomía dorsal del fornix vaginal, se procedió a la sección y extracción de ambos ovarios con el castrador

Effeminator de Reisinger modificado por Richter (Hauptner, Alemania) en forma semejante a un emasculador (hemostasia y corte). Los ovarios fueron transportados en un recipiente térmico a 18-20C en solución salina con antibióticos (penicilina G sódica 100 UI/ml y sulfato de estreptomicina 0,5 mg/ml) durante 6 horas y procesados dentro de las 11 horas de comenzada la sesión de ovariectomía.

Producción in vitro de embriones. Los Complejos Cumulus-Ovocitos (CCOs) (Foto 1) fueron aspirados de folículos de 2-8 mm de diámetro por medio de una bomba aspirante y aguja 21G de diámetro. Los CCOs fueron recolectados del líquido folicular con ayuda de una lupa estereoscópica. El cultivo se realizó en grupos de 30-40 ovocitos en 400 µl de TCM 199 (Sigma, EEUU) suplementado con 10% de suero de vaca en estro (SVE) y Hormona menopáusica humana (HMG-0,05 UI/ml) u Hormona folículoestimulante recombinante humana (r-hFSH-0,05 UI/ml) (Serono, Italia) en estufa a 38,5°C, en una atmósfera con 5% CO₂en aire y humedad máxima durante 18-20 horas. Luego de la maduración, todos los CCOs fueron inseminados con semen descongelado de un toro de raza Holstein Friesian comercial. El semen fue centrifugado durante 10 minutos a 600 g a través de un gradiente discontinuo de Percoll (45-60-90%). El sobrenadante fue aspirado y el pellet resuspendido en 5 ml de medio de capacitación TALP sin suero (Parrish y col., 1986) y centrifugado nuevamente. El sobrenadante fue descartado y el pellet de semen evaluado en calidad y concentración. La fecundación se llevó a cabo con 1 x 10⁶ espermatozoides/ml en 400 µl de medio TALP, suplementado con 10 µg/ml de heparina (Sigma, EEUU) bajo las mismas condiciones atmosféricas de la maduración durante 18-22 horas. Después de la fecundación, los ovocitos fueron separados de las células de la granulosa y de los espermatozoides por medio de agitación mecánica (vortex) durante 1 minuto y cultivados posteriormente en 400 µl de medio CR1aa (Rosenkrans y First, 1994) a 38,5°C en 5% CO₂, 5% O₂, 90% N₂ durante 7 a 8 días.

Transferencia de embriones. Se utilizaron como receptoras 57 vaquillonas Holando-Argentino vírgenes (1820 meses de edad y 330-350 kg) con celo sincronizado mediante una aplicación de 500 mg de cloprostenol. La transferencia se realizó en el día 7 del ciclo estral (Día 0 = día del celo) en forma directa (sin observación de los embriones) 510 minutos después de la descongelación, por la técnica transcervical no quirúrgica, depositando dos embriones por receptora en el cuerno ipsilateral al cuerpo lúteo. Todas las transferencias fueron realizadas por un mismo operador. El diagnóstico de preñez fue realizado por palpación rectal 55 días después de la transferencia.

Análisis estadísticos. Para determinar si la diferencia obtenida entre las tasas de gestación de embriones de 7 y 8 días fue estadísticamente diferente de lo que se obtendría por azar, se utilizó el test de Chi cuadrado utilizando el programa estadístico PCS2T (Lambda, Alemania).

De 120 vacas ovariectomizadas se obtuvieron 237 ovarios. En 3 vacas sólo se pudo extraer un ovario. El tiempo transcurrido entre el primer ovario obtenido y el comienzo de la maduración fue aproximadamente de 11 horas en todas las sesiones. Se obtuvo por el método de aspiración un promedio de 9,5 ovocitos/ovario, o sea 18,8 ovocitos/vaca ovariectomizada.

Los resultados de la eficiencia en la producción in vitro de embriones son presentados en el cuadro 1.

CUADRO 1. Eficiencia en la producción in vitro de embriones a partir de vacas ovariectomizadas.

La tasa de gestación obtenida con embriones de 7 días (35,5%) fue significativamente mayor (P<0,05) a la obtenida con embriones de 8 días (16,6%) (cuadro 2).

CUADRO 2. Número (%) de receptoras preñadas luego de la transferencia de embriones PIV congelados/descongelados de 7 y 8 días de edad.

Number (%) of pregnant recipients after transfer of frozen/thawed Day-7 and Day-8 IVP embryos.

a b: Porcentajes con letras diferentes dentro de una misma columna difieren significativamente (P<0,05)(Chi cuadrado test)

DISCUSION

Los resultados obtenidos indican que después de un período de 11 horas, transcurrido desde la obtención del primer ovario y el comienzo del cultivo de ovocitos para la maduración, es posible la producción de embriones por técnicas in vitro y obtener gestaciones.

El tiempo óptimo y temperatura para el transporte de los ovarios hasta el laboratorio y el comienzo de la maduración de los ovocitos ha sido estudiado por Yang y col. (1990), quienes observaron que los ovarios pueden ser almacenados hasta 8 horas a 25°C sin una reducción en la tasa de fecundación o en la capacidad de desarrollar hasta estadio de blastocisto. En cambio, temperaturas extremas (4°C y 38°C) para el transporte de ovarios, resultaron en tasas de desarrollo embrionario menores a la obtenida con el mantenimiento a 23°C (Shioya, 1993). Existen resultados alentadores de PIV de embriones luego del almacenamiento de ovarios por 24 horas a 15 y 21°C (31% de blastocistos) (Schernthaner y col., 1997). Esto posibilitaría un mayor uso potencial de la PIV de embriones en programas comerciales, porque permitiría obtener ovarios de lugares más distantes del laboratorio. En nuestro trabajo, con un tiempo máximo de mantenimiento de los ovarios de 11 horas a 18-20°C, la tasa promedio de blastocistos seleccionados para la congelación a los 7 y 8 días de cultivo fue de 27,9% (cuadro 1) sobre el total de ovocitos colocados en cultivo para su maduración y fecundación.

Cada ovario contiene miles de ovocitos, pero con la tecnología corriente sólo una pequeña proporción del total de la población folicular puede ser utilizado. En este trabajo se obtuvieron 9,5 ovocitos/ovario. Estos resultados son similares a los obtenidos por Katska y Smorag (1984) y Hamano y Kuwayama (1993), quienes obtuvieron un promedio de 10,2 y 11,0 ovocitos/ovario respectivamente, utilizando el método de aspiración con jeringa. En cambio, Gordon y Lu (1990) obtuvieron 4,0 y 5,1 ovocitos/ovario empleando las técnicas de disección ovárica y aspiración respectivamente.

La tasa de PIV de embriones (blastocistos y blastocistos expandidos) de nuestro laboratorio utilizando el medio CR1 con aminoácidos fue similar a la obtenida por Galli y Lazzari (1996) quienes lograron un 28,5% de desarrollo utilizando un sistema de cultivo de embriones con medio SOF (Synthetic Oviduct Fluid) (Takahashi and First, 1993), suplementado con suero y sin células somáticas de soporte. Estos mismos autores no obtuvieron diferencias en la tasa de producción de blastocistos con otros sistemas empleados (cultivo en oviducto de oveja y cultivo con células epiteliales de oviducto bovino).

La mayor tasa de gestación fue obtenida con embriones de 7 días (35,5%). Hasler y col. (1995) obtuvieron tasas de preñez de 42 y 20% luego de la transferencia de un solo embrión congelado/descongelado de 7 y 8 días de edad respectivamente. Es difícil comparar estos resultados con los obtenidos en nuestro trabajo, debido a que aquellos autores realizaron la transferencia de embriones seleccionados (Grado I) después de la descongelación. En nuestro caso, luego de la descongelación, se realizó la transferencia de dos embriones por receptora (transferencia directa) sin observación previa.

En general, las tasas de gestación obtenidas con embriones PIV observadas en la literatura científica, son inferiores a las obtenidas por medio de la transferencia de embriones recuperados in vivo después de un tratamiento superovulatorio. Diferencias morfofisiológicas y bioquímicas entre embriones PIV e in vivo podrían explicar esa diferencia en viabilidad. Los embriones PIV presentan mayor sensibilidad al enfriamiento y congelación, menor número de células, mayor incidencia de anormalidades cromosómicas, mayor resistencia a la protrusión y mayor contenido lipídico (Massip y col., 1995). Estos mismos autores sugieren que la criopreservación por procedimientos de vitrificación podrían ser más apropiados para los embriones PIV.

En conclusión, estos resultados indican que por cada vaca de rechazo se podría producir en promedio 0,82 gestación adicional después de la aplicación de esta tecnología. Además, estos datos demuestran que la producción de embriones por técnicas in vitro a partir de ovarios de vacas ovariectomizadas es una buena alternativa que podría ser considerada para preservar recursos genéticos y para uso comercial en programas de mejoramiento genético.

Los objetivos de este trabajo fueron evaluar la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones empleando ovocitos de vacas ovariectomizadas y determinar la tasa de preñez después de la transferencia de embriones descongelados. Ciento veinte vacas Holando Argentino de alto valor productivo fueron ovariectomizadas en 6 sesiones de 18-25 vacas, utilizando un ovariótomo por vía vaginal. Los ovarios fueron transportados entre 18-20°C en solución salina con antibióticos durante 6 horas y procesados dentro de las 11 horas de comenzadas las ovariectomías. Los Complejos Cumulus-Ovocitos (CCOs) fueron aspirados de folículos antrales (2-8 mm de diámetro). Los CCOs fueron madurados en TCM 199 suplementado con 10% de suero de vaca en estro durante 22 horas. Luego de la maduración, los ovocitos fueron inseminados con semen descongelado y cultivados en medio CR1aa. A los 7 y 8 días después de la fecundación, los blastocistos y blastocistos expandidos de buena calidad fueron equilibrados en 1,5 M etilenglicol. Se colocaron dos embriones por pajuela de 0,25 ml y posteriormente fueron congelados. Los embriones descongelados fueron transferidos directamente a las receptoras. Un total de 57 vaquillonas lecheras fueron utilizadas como receptoras. El diagnóstico de preñez fue realizado por palpación rectal a los 55 días después de la transferencia.

La eficiencia en la PIV fue de 9,5 ovocitos y 2,7 embriones por ovario y la tasa total de preñez fue 31,5%. La tasa de gestación obtenida con embriones de 7 días (35,5%) fue significativamente mayor (P<0,05) a la obtenida con embriones de 8 días (16,6%). Se concluye de estos resultados que por cada vaca de rechazo se podría producir 0,82 gestación adicional después de la aplicación de esta tecnología. Estos datos demuestran que la PIV de embriones a partir de ovarios de vacas ovariectomizadas es una buena alternativa para preservar recursos genéticos y para propósitos comerciales.

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Nº vacas ovariectomizadas	Nº ovarios obtenidos	Nº ovocitos recuperados	Nº embriones congelados (%)		Nº embriones/ ovario	Nºembriones/ vaca
			Día 7	Día 8

120	237	2262	391	240	2,7	5,2
			(17,3)	(10,6)


Edad del embrión	Nº receptoras transferidas	Nº receptoras preñadas

7 días	45	16 (35,5) a
8 días	12 2	(16,6) b

Total	57	18(31,5)

**Gestación con embriones producidos in vitro a partir de ovocitos recuperados de vacas ovariectomizadas**

Gestation with in vitro produced embryos from oocytes of ovariectomized cows