ARTICULOS ORIGINALES

Escherichia coli aislada de cerditos diarreicos. Presunción de cepas productoras del Factor Citotóxico Necrosante (CNF)^*

Escherichia coli isolated from diarrheic piglets. Presumption of Cytotoxic Necrotizing Factor (CNF) producing-strains

J. Zamora, M.V.; G. Reinhardt, M.V. Dr. med. vet., M. Polette, T.M.; P. Macías, T. M.; I. González, T. M.

Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, casilla 167, Valdivia, Chile.

SUMMARY

A total of 275 strains of E. coli were isolated. Sixteen (5.8%) were shown to be producers of the toxin "CNF type", and 5 (31.2%) out these were hemolytic. Fimbria was not detected.

Palabras claves: E. coli, CNF, cerditos, diarrea.

Key words: E. coli, CNF, piglets, diarrhea.

INTRODUCCION

Son numerosos los tipos de toxinas que sintetizan diversas cepas de Escherichia coli, no obstante en el área médico veterinaria de Chile sólo se tiene información de las enterotoxinas termoestables (ST) y termolábiles (LT) de las cepas enterotóxicas (ETEC), como también de las verotoxinas (VT) (Pinochet y col., 1989; Borie y col., 1997; Zamora y col., 1994, 1999) y se carece, a la fecha, de mayores datos de cepas necrotóxicas (NTEC) productoras del factor citotóxico necrosante (CNF).

Esta última toxina fue descrita primero por Caprioli y col. (1983), a partir de cepas de E. coli aisladas de niños que sufrían de diarrea aguda, comprobándose posteriormente en adultos con cuadros extraintestinales (Brauner y col., 1990; Cherifi y col., 1990), como también en distintas especies de animales con diarrea, septicemia, diversas infecciones extraintestinales y en casos de abortos bovinos y porcinos (González y Blanco, 1985; Blanco y col., 1990a; Tabouret y De Rycke, 1990; Penrith y col., 1995; Pohl y col., 1992, 1993a, 1997; Mainil y col., 1998). Por su parte, Wray y col. (1993) inoculan experimentalmente cerditos neonatos y logran reproducir graves enterocolitis con o sin sangre e incluso con diseminación pulmonar.

Este factor posee dos tipos de toxinas, CNF1 y CNF2, que son producidas separadamente por diferentes cepas y causan cambios morfológicos en las líneas celulares Vero y IHeLa consistentes en aumento del tamaño celular y multinucleación, como también necrosis dérmica en el conejo (Pohl y col., 1992, 1993b; Wray y col., 1993).

Dados estos antecedentes se consideró de interés investigar, en forma preliminar, si las cepas de E. coli aisladas de cuadros entéricos del porcino neonato tienen la capacidad de sintetizar toxinas que produzcan alteraciones morfológicas de la línea celular HeLa.

MATERIAL Y METODOS

Se recolectaron 497 muestras de fecas diarreicas de cerditos lactantes de hasta 40 días de edad, las que se sembraron en Agar Eosina Azul de Metileno (Difco) e incubaron a 37ºC por 18 ­ 24 h, considerando sólo aquellas placas que tenían, al menos, un 80% de colonias sospechosas de E. coli (Schudel, 1985), identificándolas posteriormente morfológica, fisiológica y bioquímicamente.

Para la obtención de CNF se procedió según Blanco y col. (1990b). Para tal efecto, las cepas E. coli se sembraron en Caldo Tripticasa de Soya (CTS) (Difco), pH 7,5, incubándola a 37º C durante 5 h en agitador orbital (200 ciclos por minuto). A continuación se adicionaron 20 ml de una solución que contiene 2,5 µg de mitomicina C (Sigma) y se reincubó en el agitador por 20 h más, centrifugando a continuación a 6000 x G a 4° C durante 15 minutos. El sobrenadante se filtró por membranas Sartorius de 0,2 µm y se conservó a ­20º C hasta su uso.

La actividad citotóxica de los filtrados se ensayó en monocapa de células HeLa en microplacas de 24 pocillos. Con este objeto, se inocularon los pocillos con una suspensión de 10⁵ células/ml adicionadas del medio MEM (Minimun Essential Medium, Sigma) con 10% de suero fetal, la que se incubó a 37º C en 5% de CO₂ por 24 h. A continuación se eliminó el medio y se remplazó por otro carente de suero fetal incubando por 24 h más en las mismas condiciones descritas anteriormente. Transcurrido este lapso se cambió nuevamente el medio sin suero, adicionado con 50 ml de sulfato de polimixina B más 50 µ del extracto filtrado a cada pocillo. Se dejaron 3 pocillos como control negativo, uno con el medio MEM, otro con el medio más sulfato de polimixina B y el tercero inoculado con CTS más mitomicina C. A las 48 h se hizo la lectura directamente mediante microscopio invertido y posteriormente se observaron las células teñidas con hematoxilina-eosina.

A todas las cepas que produjeron alteraciones morfológicas caracterizadas por aumento de tamaño y multinucleación de las células HeLa, se les determinó la capacidad hemolítica y los antígenos fímbricos.

Se estudió el tipo de hemólisis sembrando las cepas en placas de Triptosa Agar-Sangre-Base (Gibco BRL) suplementado con 10 mM de CaCl₂ y 5% de sangre desfibrinada de cordero; también se utilizó el mismo medio para preparar agar sangre con el equivalente del 5% de eritrocitos lavados por 3 veces en PBS. Además, se probó la resistencia frente al ácido nalidíxico y a las cepas que resultaron resistentes se les investigó la capacidad hemolítica en agar sangre con 25 µg/ml del antibiótico mencionado (Walton y Smith, 1969). En todos los casos, la lectura se realizó después de 4 y 24 h de incubación a 37ºC.

También se detectó la capacidad de producir hemólísis, sembrando 0,1 ml de la cepa cultivada durante una noche en caldo cerebro corazón (GIBCO BRL), en tubos con 10 ml del medio previamente calentado a 37ºC. El cultivo se incubó durante 6 h y a continuación se les agregaron 0,5 ml de sangre de cordero desfibrinada, reincubándolos hasta el día siguiente (Pohl y col., 1991).

El tipo de hemólisis se interpretó de acuerdo con el criterio de Pohl y col. (1991) y de Beutin y col. (1988, 1991). Así, se consideró síntesis de a hemolisina si la hemólisis se presenta en placas con eritrocitos lavados, con sangre entera y en caldo. Es b, si la hemólisis se constata en agar sangre y no en caldo, en cuyo tubo se aprecia la sedimentación de eritrocitos; por lo demás, tanto la a y b hemolisinas comienzan a apreciarse después de 4 h de incubación. En cambio, se trata de enterohemolisina (EH) cuando la hemólisis se presenta únicamente en las placas con eritrocitos lavados y después de 24 h de cultivo. En el caso de g hemolisina, la hemólisis se hace evidente sólo cuando el agar sangre contiene ácido nalidíxico. El resultado es negativo si no se observa hemólisis en ninguno de los medios de cultivo empleados, considerando que una ligera coloración verdosa no corresponde a propiedades hemolíticas (Walton y Smith, 1969).

A las cepas se les determinó la presencia de fimbrias por serología, sembrándolas previamente en un medio que estimula su formación, consistente en 1% de casamino ácido, 0,15% de extracto de levadura, 0,005% de MgSO₄, 0,0005% de MnCl₂ y 2% de agar ajustado a pH 7,4 (Zamora y col., 1996). Para tal efecto se emplearon los antisueros aglutinantes Fimbrex F41, K88, K99 y 987P elaborados por el "Central Veterinary Laboratory", Weybridge, Inglaterra.

RESULTADOS

Sólo en 275 muestras fecales de las 497 se aislaron cepas de E. coli, puesto que habían desarrollados 80% o más colonias típicas de esta enterobacteria en cada placa de cultivo. De éstas, 16 cepas (5,8%) produjeron toxinas que aumentaron el tamaño de las células HeLa y polinucleación de ellas como se describe para CNF, alteraciones que se pueden observar en la microfotografía 1.

Las alteraciones que se produjeron en la monocapa de las células HeLa con el inóculo de los extractos de las cepas de E. coli, se caracterizaron por aumento del tamaño y multinucleación (microfotografía 1), coincidiendo con las que describieron por primera vez Caprioli y col. (1983), McLaren y Wray (1986) y De Rycke y col. (1990). Consecuentemente, esta característica lesión celular hace presumir que 16 cepas (cuadro 1) tendrían la capacidad de síntetizar CNF1, CNF2 o de ambas, las que son difícil de diferenciar si se carece de antisueros o de sondas, aunque Blanco y col (1990 b) informan que producen alteraciones diferentes en las células HeLa, pero que, naturalmente, se requiere de experiencia para detectarlas.

Se ha visto que las cepas CNF1 afectan al hombre y diversas especies animales y que las CNF2 son casi exclusivamente patógenas de los rumiantes, a los que les provoca cuadros intestinales y extraintestinales (Blanco y col., 1990a; Oswald y col., 1991; DeRycke, 1996; Pohl, 1997; Mainil y col., 1998).

Cepas NTEC están asociadas a diversas patologías en distintas especies de animales domésticos en diversas infecciones, aunque la patogenia no está del todo aclarada (Oswald y col., 1991; Wray y col., 1992; Pohl y col., 1992, 1993a; Blanco y col., 1993; Mellata y col., 1998; Orden y col., 1999). En la especie porcina se ha informado de abortos (Pohl y col., 1993a, 1997), pero se describe más frecuentemente en cuadros diarreicos, algunas de los cuales cursan con lesiones de enteritis hemorrágica catarrral difusa (Blanco y col., 1990a; Penrith y col., 1995), infección que se puede extender a bacteriemia y al pulmón con lesiones tóxicas tanto en esa víscera como en cerebro, hígado, corazón y riñón, como lo demostraron Wray y col. (1993) por inoculación experimental en cerditos neonatos, por lo que opinan que las propiedades toxigénicas de E. coli productora de CNF juegan un importante papel en las infecciones entéricas de los cerditos.

Diferentes investigadores sostienen que las cepas NTEC de origen extraintestinal obtenidas de humanos y animales, están asociadas en un porcentaje elevado con la propiedad de producir hemolisina, preferentemente de tipo alfa, en cambio las cepas intestinales lo son en un bajo porcentaje (Caprioli y col., 1987; DeRycke y col., 1990; Blanco y col., 1992; Pohl y col., 1993), por lo que llama la atención que el 31,2% de las CNF+ aisladas en el presente trabajo fueran hemolíticas. Posiblemente este alto porcentaje se deba a que en este estudio también se investigó la producción de g hemolisina, la que generalmente no investigan otros autores, lo que incrementó el número de cepas positivas (cuadro 1) y, naturalmente de no haberla investigado las no hemolíticas hubieran sido solamente 13 (81,3%), porcentaje más coincidente con lo que describe la literatura. Se constató la producción de a, b, y g hemolisinas y la ausencia de EH; no obstante, la cantidad de cepas NTEC aisladas fue escaso, lo que no permite concluir que esta última hemolisina no la produzcan las cepas CNF+.

A ninguna de las 16 cepas NTEC aisladas se les detectó serológicamente fimbrias con los antisueros K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6) ni F41 que corresponden a las más comúnmente descritas en diferentes especies animales con enteritis, lo que no significa necesariamente carencia de adhesinas. Estos resultados no extrañan, ya que investigaciones realizadas en el extranjero informan más frecuentemente de F17, F17a, F17b y F165 y en contadas ocasiones se publica la presencia de las adhesinas F6 y F41 en cepas NTEC aisladas de los animales domésticos (Wray y col., 1992; Mainil, 1993; Pohl y col., 1995, 1998; Mellata y col., 1998). Por su parte, Dozois y col. (1997) analizan cepas CNF+ aisladas de cerdos con septicemia y diarrea e informan la presencia de adhesinas S y F1C, las que corrientemente están asociadas a cuadros extraintestinales del hombre por cepas NTEC, por lo que sugieren que los cerdos puedan ser reservorios de infecciones en humanos.

En atención a los resultados obtenidos en el presente estudio y al papel que se le asigna a las cepas NTEC en las patologías de los animales, consideramos importante confirmar en el futuro la presencia de E. coli productoras de CNF en infecciones intestinales y extraintestinales, como también diferenciar los tipos de las distintas necrotoxinas, puesto que ambas son importantes clínicamente. En consecuencia, sería del todo conveniente desarrollar un método adecuado en el diagnóstico de rutina para estas colibacteriosis.

RESUMEN

Se recolectaron 497 muestras de fecas diarreicas de cerditos lactantes de hasta 40 días de edad con la finalidad de aislar cepas de E. coli, a las cuales se les determinó la capacidad de producir toxinas que tuvieran la propiedad de producir lesiones en la línea celular HeLa como las que causa el CNF. Además, se investigó la capacidad hemolítica y la presencia de fimbrias.

Se aislaron 275 cepas de E. coli, de las cuales 16 (5,8%) eran productoras de la toxina "tipo CNF"; de éstas 5 (31,20%) eran hemolíticas y a ninguna se les detectó fimbrias con los antisueros utilizados.

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Aceptado: 07.12.99.

* Proyecto FONDECYT 1951150.

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