COMUNICACIONES
J. ZAMORA, M. V., G. REINHARDT, M. V., Dr. med. vet., M. POLETTE,
T. M.,
C. M.ORELLANA, T. M.
Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad
Austral de Chile, casilla 167, Valdivia, Chile.
E-mail: jzamora@uach.cl
SUMMARY
Diarrheic feces from 150 piglets younger than 40 days
old, were examined in order to isolate E. coli strains and test their
adherence capacity to HEp-2 cells. For this purpose, samples were seeded on
eosin methylen blue agar.
Isolated E. coli strains were cultured in tryptone broth with 1% D-mannose
and then inoculated to HEp-2 monolayer cells..
Strains with adherence capacity were obtained from 20 piglets. In 11 piglets
(7.3%) the isolated strains showed localised adherence; in 5 piglets (3.3, they
had an aggregative pattern of adherence and in 4 piglets (2.7%), they showed
a pattern of diffuse adherence.
Palabras claves: E. coli, LAEC, DAEC, EAggEC, diarrea, cerditos.
Key words: E. coli, LAEC, DAEC, EAggEC, diarrhoea, piglets.
INTRODUCCION
La línea celular HEp-2 se utiliza para detectar la capacidad adherente de cepas de E. coli con o sin propiedades enteropatógenas (EPEC) por unirse típicamente a estas células mediante una adherencia localizada (LA), difusa (DA) o agregativa (AA). Esta última propiedad se puede constatar, también, en material inerte (vidrio, plástico), por lo que estas cepas de E. coli se pueden denominar LAEC, DAEC y EAggEC o EAEC (enteroagregativa), respectivamente. No obstante, recientemente se han sugerido nuevos tipos de patrón de adherencia que comprende simultáneamente la adherencia localizada y la difusa (LA/DA) y otra similar a la localizada (LAL por localized adherence-like) (Gomes y col., 1989; Matheewson y Cravioto, 1989; Corboz y col., 1992; Nataro, 1996; Yamamoto y col, 1996; Czeczulin y col., 1999; Scaletsky y col., 1999a, 1999b).
Se ha observado que las EPEC, y también algunas cepas verotóxicas (VTEC), son capaces de producir unión a los enterocitos y destrucción de las microvellosidades intestinales por el efecto "attaching-effacing" (AE) preferentemente por parte de las cepas LAEC, por lo que se les denominan AEEC (Moon y col., 1983; Knutton, 1994; Agin y col., 1997; China y col., 1997, 1998). Esta característica lesión intestinal no siempre es producida por LA, pues pueden carecer del gen cromosómico eae, aunque hay heterogeneidad entre los de origen animal y humano; de ahí que LA solo no sea suficiente para la producción de AE, aunque incrementan sustancialmente el efecto AE (Jerse y col, 1990; Zhu y col, 1994; China y col, 1999).
Así, diversos autores analizan los diferentes patrones de adherencia a células HEp-2 con cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea en diferentes estadios de la enfermedad (Cravioto y col., 1991; Bernet- Camard y col., 1996; Dutta y col., 1999), mientras otros investigadores entregan información con cepas aisladas de animales (Corboz y col., 1992; Erpenstein y Wieler, 1994; Beutin, 1999). Con todo, los antecedentes sobre la capacidad de adherencia de E. coli a esa línea celular en el área de medicina veterinaria no es abundante en comparación con las publicaciones sobre la capacidad adherente a las células HEp-2 de cepas aisladas del hombre. En atención a que en Chile no existe información sobre las propiedades LA, DA ni AA en animales, el presente estudio tiene por objetivo aportar antecedentes sobre la capacidad adherente a línea celular HEp-2 por E. coli aisladas de cerditos diarreicos.
MATERIAL Y METODOS
Con la finalidad de aislar cepas de E. coli, se examinaron bacteriológicamente 150 muestras de fecas de igual número de cerditos diarreicos menores de 40 días de edad. Las muestras se sembraron en agar eosina azul de metileno (Difco) y se incubaron por 24 h a 37º C. Se repicaron 3 colonias con brillo verde metálico de aquellas placas que cubrían por lo menos el 80% de su superficie de colonias sospechosas (Schudel, 1985; Wray y Woodward, 1994), clasificándolas por sus características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas.
Para detectar la capacidad de adhesión a las células HEp-2 se utilizó el método de Cravioto y col. (1979) con algunas modificaciones según Knutton y col. (1987). Por consiguiente, las cepas se incubaron por una noche a 37º C en 1% de agua triptonada con 1% de D- manosa. Las células HEp-2 se incubaron en medio MEM (mínimo esencial) con la adición de 4,766 g/l del medio Hepes 20 mM, 0,85 g/l de NaHCO3 y 10% de suero fetal bovino.
En cada uno de los 8 pocillos de una microplaca que contenía un cubreobjeto estéril se colocaron 2 ml de suspensión de células HEp-2 (2 x 105 células por ml) y se incubó por una noche. A continuación se lavaron los cubreobjetos 3 veces con PBS y se les agregó, por separado, 1 ml del cultivo en agua triptonada con D-manosa incubándolos por 3 h a 37º C. Por último, se lavaron los cubreobjetos por 3 veces en PBS, se fijaron con metanol al 70% por 15 minutos y se tiñeron con Giemsa al 5% por 15 minutos y finalmente se procedió a su lectura. Así, se consideró que se presentaba algún tipo de adherencia si 10 o más bacterias se adherían a no menos del 10% de células HEp-2 (Hall y col., 1990; Wieler y col., 1994; Erpenstein y Wieler, 1994), catalogando los distintos patrones de conformidad a lo informado por diversos autores (Cravioto y col., 1979; Nataro y col., 1987; Matheewson y Cravioto, 1989; Yamamoto y col., 1992; Nataro y Levine, 1994; Scaletsky y col, 1999b):
- En LA, las bacterias en gran número forman microcolonias características sobre la superficie de las células HEp-2
- En LAL, escasa cantidad de bacterias conforman una o dos microcolonias sobre la superficie de las células HEp-2.
- En DA, las bacterias están dispersas sobre las células HEp-2.
- En AA, las bacterias se unen unas a otras como "ladrillos apilados" sobre o fuera de la superficie de las células HEp-2.
RESULTADOS Y DISCUSION
En 20 de los 150 cerditos (13,3%) se detectaron cepas con diferentes tipos de adherencia a las células HEp-2, lo que se aprecia en la fotografía 1. En 11 cerditos (7,3%) se aislaron cepas con capacidad de adherencia localizada (LA), la que, de acuerdo a la reciente descripción de Scaletsky y col. (1999b), correspondería más bien al tipo LAL. No obstante, en el presente trabajo se continuará con la clásica definición de LA, pues ambos tipos se habrían considerado anteriormente como uno solo, como se puede apreciar en investigación de diversos autores (Nataro y col., 1985; Nataro y col., 1987; Matheewson y Cravioto, 1989). En otros 5 cerditos lechones (3,3%) se aislaron cepas que fueron AA y, por último, en 4 cerditos las (2,7%) cepas produjeron DA.
La importancia patógena de estas cepas se desprende de los diversos estudios realizados para determinar la patogenicidad de las cepas de E.coli, particularmente de las aisladas de la especie humana, que muestran algunos de los tres patrones de adherencia a las células HEp-2. Estos diferentes tipos de adherencia han generado controversia en el origen de la enfermedad, aunque se describe que LA está más frecuentemente asociada con diarrea aguda no sanguinolenta en niños, en cambio la AA lo está con cuadros de diarrea secretoria persistente y la DA está implicada en estudios epidemiológicos como causante de diarrea en infantes, aunque la patogenicidad de esta última es, según algunos autores, discutible (Cravioto y col., 1991; Bernet-Camard y col., 1996; Scaletsky y col., 1999b; Wachter y col., 1999). Por su parte, Wieler y col. (1994) y Erpenstein y Wieler (1994), dan a conocer la frecuencia de LAEC y DAEC asociadas a la producción de verotoxinas en animales diarreicos y, a su vez, otros investigadores manifiestan que estas cepas tienen el carácter de las AEEC por las características lesiones que producen en la mucosa intestinal de porcinos y bovinos infectados natural y experimentalmente (Hélie y col., 1990; Janke y col., 1990; China y col., 1997, 1998, 1999).
Por consiguiente, de acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio se podría estar en presencia de EPEC o bien de VTEC o de ambas. En 11 cerditos diarreicos se aislaron cepas que exhibían la capacidad de producir adherencia localizada, lo que permite presumir que el 7,3% de los animales examinados estaría infectado por este tipo de E. coli, porcentaje superior a lo que describe la literatura. Así, Corboz y col. (1992) informan que solamente el 1,5% de 65 cerditos diarreicos presentó LA, no encontrando ninguna cepa con esta clase de adherencia en 52 sanos.
Figura 1.- A) Patrón de adherencia localizada. B) Patrón de adherencia difusa. C) Patrón de adherencia agregativa.
A) Localized pattern of adherence. B) Diffuse pattern of adherence. C ) Aggregative pattern of adherence.
En cuanto a la adherencia difusa, se pudo comprobar que solamente 4 cepas (2,7%) eran DA, cepas que no encuentra Corboz y col. (1992), tanto en 65 cerdos diarreicos como en 52 sin diarrea. Por último, 5 cepas (3,3%) tenían la capacidad de adhesión agregativa (AA), información que no se encontró en la literatura consultada sobre colibacilosis intestinal porcina, por lo que no es posible establecer comparaciones.
Aquellas cepas que sintetizan intimina, una determinada proteína de la membrana externa, conducen a la producción de lesiones de unión y destrucción de las microvellosisdades intestinales (AE), tanto en el hombre como en animales, informándose, además, que la adherencia ocurre con cepas EPEC, aunque no exclusivamente, pues también se presentan con algunas VTEC. (Nataro y col., 1987; Gomes y col., 1989; Janke y col., 1989; Cravioto y col., 1991; Meyer y col., 1992; Yamamoto y col., 1992; Wieler y col., 1994; Nataro, 1996; China y col., 1997).
En 1990, Hélie y col. reproducen experimentalmente lesiones AE típicas en el intestino delgado y grueso de cerditos inoculados con cepas EPEC aisladas de cerdos con diarrea postdestete. Más tarde Wada y col. (1996) confirman serológicamente in situ que la cepa EPEC O45 afectaba la mucosa intestinal con lesion AE a cerditos naturalmente infectados, cepa que últimamente ha sido estudiada genéticamente por An y col. (1999a) y concluyen su asociación con los genes eae y su asociación con el fenotipo AE in vivo. Teniendo en cuenta estas investigaciones y que An y col (1999b) informan que cepas EPEC LA aisladas de perros producen AE, es dable suponer que algunas de las cepas aisladas en el presente trabajo que produjeron adherencia en las células HEp-2, especialmente las LAEC, pudieran ser enteropatógenas, sin desconocer la posibilidad de que, al menos algunas de ellas, fueran cepas verotóxicas con capacidad AE. Con todo, se debe ser cauto, pues existen cepas con capacidad AE que no producen adherencia a las células HEp-2, más aún si se tiene presente que este tipo de lesiones por AEEC está fuertemente influenciado por la dieta a la que están sometidos los animales (Jerse y col., 1990; Neef y col., 1994; Zhu y col., 1994).
No son numerosas las publicaciones que se refieren a cepas de E. coli aisladas de animales con capacidad de adherirse a la línea celular HEp-2, en especial las de origen porcino, pero se ha demostrado en infecciones naturales y experimentales que las EPEC, aunque no todas, están asociadas con lesiones AE (Janke y col., 1990; Fisher y col., 1994). Sin embargo, la mayoría de las publicaciones se refieren a bovinos en los que producen diarrea, preferentemente las LAEC, aunque también se describe la presencia de DAEC, aunque son mayoritariamente AEEC, aquellas cepas que están asociadas a la producción de verotoxinas (Meyer y col., 1992; Mainil y col., 1993; Wieler y col., 1994; Mainil y Pohl, 1994; Erpenstein y Wieler, 1994; Pohl y col., 1995; China y col., 1997).
De acuerdo a lo expresado precedentemente y con lo publicado en la especie humana (Nataro y col., 1985; Girón, 1996), se podría pensar que las LAEC tendrían un mayor papel en una eventual patología entérica en los porcinos que las DAEC, pudiendo tratarse de cepas EPEC sin descartar que algunas de ellas fuesen verotóxicas, con la eventual capacidad de producir, en ambos casos, lesiones AE en la mucosa intestinal de los cerditos afectados. Una situación semejante ocurriría con las 5 cepas (3,3%) con adherencia agregativa (EAggEC), sobre lo que no existe mayor referencia en animales afectados naturalmente a diferencia de la información existente en relación al hombre (Nataro y col., 1987; Cravioto y col., 1991; Yamamoto, 1996; Nataro, 1996; Agin y Wolf, 1997).
Otro aspecto a considerar, obviamente de trascendencia epidemiológica, es la posibilidad de que los porcinos puedan ser una importante fuente de infección para el hombre, transformándose en reservorios, máxime si se tiene presente que los cerdos portan el serovar O128ab:H2 y en los bovinos se han constatado el serovar O26:H11 y el serogrupo O111, que corresponden a serogrupos clásicos que afectan al hombre (Corboz y col., 1992; China y col, 1999).
En nuestro país no existen publicaciones que informen la presencia de cepas LAEC, DAEC ni EAggEC en especies animales, y el presente artículo constituye un informe preliminar de cepas de E.coli con capacidad de adherencia a las células HEp-2. En atención a que estas cepas están asociadas a patologías entéricas, se considera conveniente continuar con trabajos semejantes, completándolos con exámenes feno y genotípicos e histopatológicos in vitro e in vivo que permitan comprobar lesiones AE en la mucosa intestinal y en cultivos celulares, como también constatar la producción de verotoxinas, todo lo cual permitirá diferenciar cepas EPEC y VTEC productoras de lesiones AE.
RESUMEN
Se examinaron fecas diarreicas de 150 cerditos menores de 40 días de edad con el propósito de aislar cepas de E. coli y probar su capacidad de adherirse a las células HEp-2. Para tal objeto, las muestras se sembraron en agar eosina azul de metileno.
Las cepas de E. coli aisladas se sembraron en agua triptonada con 1% de D- manosa y se inocularon sobre monocapas de células HEp-2.
Las cepas con adherencia correspondieron a 20 cerditos. En 11 cerditos (7,3%) las cepas aisladas exhibieron adherencia localizada, en 5 (3,3%) fueron adherencia agregativa y en 4 (2,7%) presentaron un patrón de adherencia difusa.
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Aceptado: 29.08.2000.
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