ARTÍCULOS ORIGINALES

J.I. RONCHI¹ , M.V., Esp. Salud Anim.; E.S. ESTELA,² , M.V., Esp. Salud Anim.; M. R. LEUNDA¹ , A. C. ODEON,¹ , M.V., Dr. Cs. Vet., M. Sc., Ph.D.

¹ Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Estación Experimental Agropecuaria Balcarce, C.C. 276 - (7620) Balcarce, Bs.As., Argentina.
² Facultad de Ciencias Veterinarias, Tandil, Universidad Nacional del Centro de la provincia de Buenos Aires (UNCPBA), Argentina.

SUMMARY

The aim of this study was to determine the consequences of the infection of BVDV genotype II (BVDV-2) in calves with preexisting immunity to BVDV-1 (induced by infection with wild type BVDV (Group A, 4 calves), or induced by vaccination with a killed BVDV-1 product (Group B, 2 calves). Group A and B were intranasally exposed to a field isolate of BVDV-2 (25ml x 10^-7.8 TCID₅₀/ml). Calves of Group A had erosions on the oral mucosa from 3 to 4 day post-challenge (DPC); moreover, intense salivation, mucous nasal secretion and sporadic diarrhea were observed from 4-14 DPC. Only one calf of Group B had diarrhea at 5 DPC. The average value of peripheral blood leukocytes (PBL) previous to BVDV-2 challenge was 8,775 PBL/ml (±603) in calves of Group A and 9,975 PBL/ml (±1308) in calves of Group B. After BVDV-2 challenge there was leukopenia in Groups A and B. The minimal number of PBL of 5,875 PBL/ml (±311) was observed in Group A at 6 PDC (P <0.05). There were differences (P <0,05) in the average of PBL during the 17 DPC among challenged animals and uninfected controls. Moreover, a difference in the number of blood lymphocytes was observed at 6-7 DPC between virus exposed and control calves. BVDV was isolated from ocular swabs of 3 calves of Group A at 13 and 17 DPC and from PBL at 9 and 11 DPC. The neutralizing antibody titer (NT) to both genotypes of BVDV was higher (P <0.05) in calves of Group A. Previous to virus challenge calves in this group had NT of 1:125 (geometric mean) and 1:128 to BVDV-1 and -II, respectively. The NT rose to 1:2048 at 17 DPC to both Genotypes of BVDV. Calves in Group B had a NT of 1:16 to both BVDV-1 and -II previous to BVDV-2 challenge. At 17 DPC the NT rose to 1:64 and to 1:181 to BVDV-1 and -II, respectively. These results allow us to conclude that antibodies generated by natural infection or vaccination with BVDV-1 increased for BVDV-1 and -2 after the experimental challenge with BVDV-2.

Palabras claves: Virus de la Diarrea Viral Bovina, VDVB, infección experimental genotipos, inmunidad, vacuna inactivada

Keywords: Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV, Experimental Infection, Genotypes, Immunity, Killed Vaccine

INTRODUCCIÓN

El virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) es un importante patógeno del ganado bovino en la mayoría de los países con explotaciones comerciales ganaderas. Estudios de la genética molecular del virus han permitido la caracterización y clasificación del VDVB como genotipo 1 o genotipo 2, estableciéndose diferencias del 25 - 40% en la secuencia de la región 5'UTR del genoma viral entre ambos genotipos (Pellerin y col., 1994). Entre las cepas del VDVB genotipo 2 (VDVB-2) se encuentran cepas que poseen la característica de ser altamente virulentas, causando una infección aguda severa, muy similar a la enfermedad de las mucosas, en bovinos seronegativos e inmunocompetentes (Odeón y col., 1999). En la última década se han detectado brotes severos de enfermedad causados por VDVB-2 en EE.UU. (Rebhun y col., 1989), Gran Bretaña (David y col., 1994), Francia (Broes y col., 1992) y Canadá (Carman y col., 1998). El VDVB-2 ha sido identificado recientemente en Argentina como responsable de cuadros fatales en bovinos mayores de 6 meses de edad (Odeón y col., 1998). Teniendo en cuenta que a la fecha no existen vacunas comerciales que hayan incorporado VDVB-2 en su formulación en Argentina, se plantea el siguiente trabajo, cuyo objetivo es determinar las consecuencias de la infección con el VDVB-2 en terneros con anticuerpos neutralizantes -infectivos o vacunales- contra el VDVB-1.

Animales y diseño experimental. Para cumplir con el objetivo del trabajo se utilizaron ocho bovinos, razas A. Angus y A. Angus x Hereford, de 7 - 9 meses de edad, asignados a los siguientes tratamientos: Grupo A: cuatro animales seropositivos VDVB-1 (N° 005, 014, 0187, 8202); Grupo B: dos animales vacunados contra VDVB-1 (N° 8322, 8430) y Grupo C: dos animales controles, seronegativos, no vacunados (N° 8103, 8345). Previo al experimento se comprobó que los animales no estaban persistentemente infectados con VDVB. Los animales del Grupo A eran seropositivos a VDVB-1, ya que 60 días previos al estudio cursaron una forma subclínica de diarrea viral bovina. Los animales del Grupo B eran seronegativos y recibieron dos dosis de una vacuna comercial inactivada de VDVB-1 por vía intramuscular con un intervalo de 21 días. La segunda dosis fue administrada 21 días antes de la infección experimental con VDVB-2. Los animales de los Grupos A y B fueron desafiados intranasalmente con VDVB-2. Todos los animales fueron controlados clínicamente y muestreados (sangre con EDTA y sin anticoagulante, e hisopados oculares) diariamente durante 17 días post-desafío (DPD).

Inóculo. Se empleó una cepa NCP del VDVB, designada como 98/124, que fue aislada de un caso severo de enteritis hemorrágica en bovinos de 18 meses en el partido de Necochea, provincia de Buenos Aires, en 1998. La caracterización molecular del segmento 5'UTR de dicho aislamiento reveló que la cepa 98/124 era similar a otros VDVB-2 (Odeón y col., 1998). El virus fue propagado 3 veces en células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) para generar un inóculo con una infectividad de 10^-7.8 TCID₅₀/ml. Los animales de los Grupos A y B fueron desafiados intranasalmente con 25 ml de dicho inóculo.

Temperatura corporal y curso clínico. A todos los animales se les registró la temperatura rectal 2 veces por día (matutina y vespertina), procediéndose a su observación clínica.

Recuento leucocitario. Desde el día desafío (0 DPD) y durante 17 días, se procedió a la extracción diaria de sangre con anticoagulante (EDTA) por punción yugular para el estudio de citología sanguínea mediante recuento leucocitario total y diferencial (Schalm, 1965).

Serología. En las muestras de suero obtenidas los 0, 7, 14 y 17 DPD se determinaron anticuerpos neutralizantes a VDVB-1 y VDVB-2, realizándose la prueba de seroneutralización (SN) en microplacas con virus fijo y suero variable, utilizando una cepa de referencia de VDVB-1, NADL (virus heterólogo) y la cepa de VDVB-2 inoculada (virus homólogo).

Aislamiento viral. El aislamiento viral se realizó a partir de leucocitos y de hisopados oculares en células MDBK con medio MEM-Hank's con suero fetal bovino. Los leucocitos fueron obtenidos por centrifugación de sangre con anticoagulante (EDTA), separados en Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich Corp. EE.UU.), lavados en PBS (pH 7,3) y co-cultivados en células MDBK, con 7% de suero fetal bovino. Luego de cuatro pasajes ciegos, la presencia del virus en los cultivos de leucocitos e hisopados oculares fue confirmada mediante inmunofluorescencia directa (IFD), empleándose un antisuero policlonal conjugado con fluoresceína, siguiendo las instrucciones del fabricante (American BioResearch, EE.UU.).

Análisis estadístico.- Se compararon las diferencias entre las medias (test de Duncan) de los datos de cada grupo experimental mediante ANOVA utilizando el procedimiento GLM. Los análisis se realizaron con el programa estadístico SAS/STAT Release 6.03, (SAS Int. Inc., Cary, NC, 1995).

Temperatura y curso clínico. No se observaron diferencias significativas en los registros de temperatura corporal de los grupos experimentales durante los 17 días de observación. En todos los animales del Grupo A se detectaron petequias y erosiones orales leves, de 2 - 5 mm de diámetro, en la mucosa gingival y en carrillos entre los 3 y 9 DPD. Además, se observó epífora, secreción nasal mucosa y diarrea leve e intermitente desde el 4 hasta el 14 DPD. En los animales del Grupo B se observó diarrea leve en un animal (8430) el 5 DPD. Los animales del Grupo C, controles no desafiados, no presentaron síntomas clínicos.

Recuento leucocitario. En el gráfico 1 se detallan los resultados del recuento leucocitario total de cada grupo experimental durante todo el experimento. El valor promedio de leucocitos totales circulantes previo al desafío fue de 8,775 leucocitos (Le)/ml (±603) para el Grupo A y de 9,975 Le/ml (±1.308) para el Grupo B y de 7,450 Le/ml (±212) para el Grupo C. Luego del desafío con el VDVB-2 se registró leucopenia en los Grupos A y B (cuadro 1). El valor mínimo de leucocitos circulantes fue observado en el Grupo A, al 6 DPD con 5875 Le/ml (±311), estos valores resultaron significativos (P <0,05) con respecto al Grupo B y C (control), que tuvieron un recuento promedio de 6.875 Le/ml (±625) y de 8,300 Le/ml (±450) al 6 DPD, respectivamente. La leucopenia se mantuvo constante en el Grupo A, con diferencias significativas (P <0,05) en el número promedio de leucocitos totales circulantes con respecto al control durante los 17 DPD. En el Grupo B el número de leucocitos circulantes recuperó los valores previos al desafío a partir de los 12 DPD (gráfico 1); no obstante este incremento, el valor promedio de leucocitos durante los 17 DPD difirieron significativamente con el control (P <0,05) (cuadro 1).

El número promedio de linfocitos circulantes previo al desafío fue de 6.173 linfocitos (Li)/ml (±405) para el Grupo A y de 7,517 Li/ml (±776) para el Grupo B. Si bien no se determinaron diferencias en el valor promedio de linfocitos totales circulantes durante los 17 DPD, existieron diferencias significativas (P <0,05) de los Grupos desafiado con el control durante los 6 y 7 DPD (cuadro 1). Esta linfopenia resultó ser la responsable de la leucopenia detectada ya que no se observaron diferencias estadísticamente significativas (P <0,05) en los recuentos de neutrófilos (cuadro 1), monocitos y eosinófilos (datos no presentados).

Cuadro 1. Recuentos leucocitarios totales y diferenciales en los grupos experimentales expresados como valor promedio en los 17 días del estudio y como promedio de los valores mínimos determinados. Total and differential blood lymphocyte counts in the experimental groups expressed as average value during the 17 days of observations and as average of the least detected value.

	Leucocitos totales / ml		Linfocitos / ml		Neutrófilos / ml
	Promedio general 0 -17 DPD	Promedio mínimo 6 - 9 DPD	Promedio general 0 - 17 DPD	Promedio mínimo 6 -7 DPD	Promedio general 0 -17 DPD	Promedio mínimo 4- 8 DPD
Grupo A	6,872 ±959 a*	6,209 ±144 a	4,880 ±213 a	4,787 ±235 a	1,168 ±106 a	1,200 ±45 a
Grupo B	7,672 ±509 b	7,737 ±590 b	4,150 ±817 a	5,402 ±29 a	1,014 ±220 a	1,559 ±288 a
Grupo C	8.801 ±970 c	8.162 ±146 b	4.804 ±399 a	6.397 ±118 b	1.321 ±81 a	1.642 ±32 a

* Columnas con distintas letras indican diferencias significativas entre Grupos (P <0,05)

Aislamiento viral . En el Grupo A se aisló VDVB a partir de hisopados oculares el 13 DPD de dos animales (014 y 005) y el 17 DPD del animal 005. El 9 DPD se aisló virus a partir de leucocitos circulantes en los animales 014 y 0187 y el 11 DPD de los animales 014 y 0187. En el Grupo B no se aisló el virus inoculado.

Gráfico 1. Cinética de leucocitos circulantes en los grupos experimentales A y B luego del desafío con BVDV genotipo 2 y Grupo C, control no-desafiado. * = Indica diferencia significativa (P < 0,05).
Kinetics of peripheral blood lymphocyte counts in the experimental groups A and B after BVDV Genotype 2 challenge, and Group C non-BVDV-challenged control. * = Indicates significance (P < 0.05).

Serología . Al comienzo de la experiencia se detectaron diferencias significativas (P <0,05) en el nivel de anticuerpos neutralizantes entre el Grupo A y B, observándose una respuesta inmune humoral significativa (P <0,05), tanto para VDVB genotipo 1 y 2, en los animales del Grupo A (cuadro 2).

Cuadro 2. Anticuerpos neutralizantes contra BVDV genotipo 1 y 2 en los grupo experimentales después de una infección experimental con BVDV Genotipo 2.
Neutralizing antibodies to BVDV Genotype 1 and 2 in the experimental groups after BVDV Genotype 2 challenge.

Inmunizaciones con vacunas con virus inactivado, o virus modificado han mostrado anticuerpos específicos contra varias proteínas virales (Bolin y Ridpath, 1990; Bolin y col.,1991; Cortese y col., 1998b). Asimismo, variaciones genéticas fueron correlacionadas con diferencias antigénicas en la glicoproteína de superficie gp53/E2 de VDVB genotipo 1 y 2 (Pellerin y cols., 1994). De acuerdo con estas observaciones y coincidiendo con lo previamente publicado por Dubovi (1992), podría señalarse que existiría inadecuada protección cruzada contra virus heterólogos luego de la vacunación contra VDVB. Sin embargo, existen evidencias que sugieren que los anticuerpos neutralizantes heterólogos pueden detectarse en terneros inmunizados con vacunas con virus inactivado o virus vivo modificado (Cay y col., 1989). Los resultados obtenidos en este estudio indican la presencia de inmunidad cruzada a virus heterólogos ya que, previo al desafío, tanto los animales expuestos naturalmente (Grupo A), como los vacunados con virus inactivado (Grupo B) genotipo 1 tenían anticuerpos contra VDVB-2, determinados mediante la prueba de seroneutralización.

Si bien todos los pestivirus comparten antígenos (Cay y col., 1989), las vacunas con virus inactivados no parecen mostrar completa protección contra cepas de virus heterólogo (Bolin y col., 1991). En el presente trabajo, la diferencia en el título de anticuerpos neutralizantes entre los animales del Grupo A (con infección natural previa) y Grupo B (vacunados) al momento del desafío, sugiere un menor estímulo en la respuesta inmune de la vacuna inactivada, en comparación con una infección natural contra ambos genotipos. Asimismo, al igual que para el caso del número de leucocitos circulantes, la ausencia de viremia detectable en el Grupo B posiblemente haya sido un factor importante que contribuyó para que estos animales tengan un menor nivel de anticuerpos al finalizar el estudio. Por otra parte, este menor título de anticuerpos neutralizantes en los animales vacunados también podría atribuirse a una menor repuesta anamnésica luego del desafío en animales inmunizados con virus inactivado (Bolin y col., 1991). Sin embargo, a pesar de tales diferencias en la inmunidad humoral, sólo un animal del Grupo B presentó diarrea leve, la leucopenia en el Grupo B fue menos severa que en el Grupo A y no fue posible determinar viremia luego del desafío en el Grupo B. Estas observaciones coinciden con estudios recientes que indican que luego de la vacunación con virus vivo modificado de VDVB-1, los terneros desarrollan respuesta inmune luego del desafío con VDVB-2 (Martín y col., 1994). Los resultados de nuestro ensayo, empleando una vacuna con virus inactivado, coinciden con dicha información; ello permitiría demostrar que bajo determinadas circunstancias animales inmunizados con VDVB-1 estarían protegidos parcialmente contra VDVB-2, demostrando que la respuesta inmune a los dos genotipos del virus sería parcialmente homóloga.

Los resultados obtenidos de este estudio permiten concluir que el nivel de anticuerpos generados por una infección o vacunación con VDVB-1 aumentan para el VDVB genotipo 1 y 2 después de una infección con VDVB-2. Adicionalmente, la infección con VDVB-2 produce leucopenia en animales previamente infectados o vacunados con VDVB-1. El bajo número de animales utilizados y la falta de un control seronegativo desafiado con BVDV-2 no permiten inferir si la presencia de dichos anticuerpos neutralizantes limitaron la infección con el BVDV-2.

Se determinaron las consecuencias de la infección con VDVB genotipo 2 (VDVB-2) en terneros seropositivos a VDVB genotipo 1 (VDVB-1). Ocho bovinos no-virémicos de razas británicas de 9 meses de edad se asignaron en: Grupo A: 4 animales seropositivos a VDVB; Grupo B: 2 animales inmunizados con VDVB-1 inactivado y Grupo C: 2 animales controles. Los Grupos A y B fueron desafiados intranasalmente con VDVB-2, 10^-7.8 TCID₅₀/ml. Entre 3 - 7 día post-desafío (DPD) se observaron erosiones orales en los animales del Grupo A y desde 4 - 14 DPD epífora, secreción nasal mucosa y diarrea. El número de leucocitos (Le) previo al desafío fue de 8,775 Le/ml (±603) en el Grupo A y de 9.975 Le/ml (±1,308) en el Grupo B. Luego del desafío se observó leucopenia en ambos grupos, con un número mínimo de 5875 Le/ml (±311) en el Grupo A al 6 DPD (P <0,05). En el Grupo A y B se observaron diferencias (P <0,05) respecto al control en el promedio de Le totales durante los 17 DPD. También hubo diferencias (P <0,05) en el número de linfocitos circulantes entre los Grupos desafiados y el control durante los 6 y 7 DPD. En 3 animales del Grupo A se aisló el VDVB de hisopados oculares el 13 y 17 DPD y de Le circulantes el 9 DPD y 11 DPD. El título de anticuerpos neutralizante contra ambos genotipos de VDVB fue más elevado (P <0,05) en los animales del Grupo A. Al momento del desafío éstos tenían un título neutralizante de 1:215 (media geométrica) y 1:128 contra VDVB-1 y -II, respectivamente, elevándose a 1:2048 para ambos genotipos al 17 DPD. Los animales del Grupo B tenían un título de anticuerpos neutralizantes a VDVB-1 de 1:16 previo al desafío, incrementándose a 1:64 al 17 DPD; para el caso de VDVB-2, el título neutralizante de 1:16 al 0 DPD aumentó a 1:181 al 17 DPD. Estos resultados permiten concluir que el nivel de anticuerpos generados por una infección o vacunación con VDVB-1, aumentan para el VDVB genotipo 1 y 2 después de una infección con VDVB-2. Adicionalmente, la infección con VDVB-2 produce leucopenia en animales previamente infectados o vacunados con VDVB-1.

Los autores reconocen la colaboración brindada por la Srta. María A. Poso, y los veterinarios participantes en el Programa de Residencia en Salud Animal de la Unidad Integrada Balcarce, Argentina, en la realización de este trabajo. Se agradece a la Asociación Cooperadora de le EEA Balcarce por la provisión de los animales para experimentación y al Dr. Ruben O. Donis por su aporte en la corrección del manuscrito.

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